Preparação e caracterização de Nanolipossomas para a aprisionamento de proteínas globulares hidrofílicas bioativas
31 de agosto de 2019
Este estudo descreve a hidratação clássica utilizando o método de filme lipídico fino para preparo de nanolipoalguns seguido de caracterização de nanopartículas. Uma proteína 47 kDa-hidrófilo e globular, Tarin, é encapsulada com sucesso como uma estratégia para melhorar a estabilidade, evitar o afastamento rápido, e promover a liberação controlada. O método pode ser adaptado ao encapsulamento de moléculas hidrofóbicas.
A preparação de nanocápsulas liposômicas por uma técnica de extrusão será realizada passo a passo na armadilha de tarin 48 kilodaltons globulares em proteína hidrofílica purificada a partir de colocasia esculenta será demonstrada. Todos os procedimentos para caracterização das nanocápsulas incluem a microscopia eletrônica de varredura e a dispersão dinâmica da luz também serão seguidos. Os procedimentos de capsulação podem enfrentar alguns desafios desde a escolha dos lipídios até a realização de encapsulamento de alta eficiência, mantendo a atividade biológica das moléculas presas.
O protocolo que será descrito pode superar algumas dessas dificuldades. Pesar os componentes lipossomos usando um equilíbrio analítico. Dissolva os componentes lipídicos em clorofórmio usando um frasco volumoso que se encaixa em um evaporador rotativo para evitar a perda de material.
Mexa a mistura a 150 RPM por 15 minutos. Remova o clorofórmio usando um evaporador rotativo. Ajuste a boca de frasco volumoso para a posição padrão para melhor eficiência, enquanto em contato com a água do banho de aquecimento.
Defina os parâmetros de acordo com o protocolo descrito. Após cerca de 25 minutos, remova o frasco e descarte o solvente evaporado adequadamente. Um filme fino e opaco é formado e pode ser facilmente visualizado.
Hidrate o filme lipíduo em uma solução de sulfato de amônio contendo tarin a um miligrama por mililitro. Mexa a mistura por 40 minutos e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, sonicar a suspensão por um minuto a 25 graus Celsius, temperatura ambiente.
Para reduzir o tamanho da vesícula e evitar a agregação, coloque a membrana de policarbonato entre dois suportes de filtro pré-molhados e coloque-a no suporte. Insira uma seringa vazia no dispositivo, encha a outra com um mililitro da suspensão liposômica e insira-a no lado oposto. Realize uma extrusão de 12 ciclos através de uma membrana de poros de policarbonato de 2 micômetros.
Empurre a amostra de uma seringa para outra lentamente. No final, a suspensão lipossômica deve ficar clara durante o processo de excursão, como resultado da redução de tamanho. Cerca de 2 mililitros da amostra podem ser perdidos durante esta etapa.
Separe os lipossomos por ultracentrifugação. Primeiro, pesar a amostra no tubo de titânio e equilibrar os tubos. Verifique o volume mínimo a ser preenchido e, se necessário, ajuste o volume com sulfato de amônio.
Coloque os tubos de titânio no balde de balanço. Abra a porta da centrífuga e coloque o rotor dentro. Feche a porta centrífuga, pressione o vácuo e espere até que o vácuo atinja de 200 a menos de 20 mícrons.
Ajuste os parâmetros no visor ultracentrifuuge. Pressione lembre-se, verifique as condições e inicie a corrida. Após 90 minutos, solte o vácuo clicando no botão de vácuo e abra a porta centrífuga.
Remova o rotor de dentro. Mantenha a amostra de ultracentrifuagem no gelo e, em seguida, separe o sobrenatante da pelota, virando o tubo de cabeça para baixo, em uma centrífuga descartável de 59 mil para separar o sobrenatante da pelota. Armazene o supernasce contendo a proteína não encapsulada a quatro graus Celsius.
Isso será usado para determinar a eficiência do encapsulamento. A pelota é apresentada como uma geleia translúcida. Suspenda a solução salina tamponada com pelotas e calor HEPES.
Por favor, verifique o protocolo para obter mais informações. Determine a eficiência de encapsulamento pelo protocolo de Peterson, a fim de evitar interferência lipídica na quantificação de proteínas. As amostras devem ser analisadas em triplicado.
Em um tubo de microfuge, diluir o supernanato lipsômico ou BSA a um miligrama por mililitro com água a um volume final de um mililitro. Adicione DOC e incubar por 10 minutos. Adicione 1 mililitro de 72% TCA e misture bem.
Centrifugar a 3.000 g por 15 minutos em temperatura ambiente. Descarte cuidadosamente o supernasal evitando o tubo para baixo, colocando-o em um papel absorvente e deixando-o secar. Suspenda a pelota em um mililitro de água.
Misture bem para certificar-se de que a pelota está dissolvida. Em seguida, transfira a amostra para tubos de ensaio. Adicione um mililitro de reagente A, misture e incuba por 10 minutos em temperatura ambiente.
Adicione 5 mililitros de reagente B, misture e incuba por 30 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Determine a absorvância em 750 nanômetros e calcule a eficiência de encapsulamento. A distribuição média de tamanho e tamanho é determinada pela dispersão dinâmica da luz.
Transfira os nanovesículos liposômicos para uma cuvette de tamanho descartável. Coloque a cuvette dentro do equipamento. Defina os parâmetros do equipamento.
Para determinação de estabilidade, armazene os lipossomos a quatro graus Celsius e verifique a distribuição e o tamanho regularmente. A caracterização lipossosome através da varredura do microscópio eletrônico é realizada de acordo com Murta e Ramasamy em triplicado. Conserte os deslizamentos de tampa de vidro no fundo de uma placa de Petri com uma fita.
Cubra os deslizamentos com Poli-L-lysine. Coloque um papel filtro molhado dentro da placa de Petri para manter a umidade e incubar por uma hora. Enxágüe com água destilada.
Adicione uma gota da amostra e deixe-a secar por uma hora, em temperatura ambiente. Para fixar as amostras, cubra-as com glutaraldeído, preparada em tampão fosfato. Coloque papéis de filtro molhados dentro da placa de Petri.
É importante selar a placa de Petri. Incubar a 4 graus Celsius por 48 horas. Enxágüe os deslizamentos de cobertura três vezes por cinco minutos cada, com o mesmo tampão de fosfato.
Desidratar as amostras da seguinte forma, lavando-se em uma solução de concentração de etanol crescente de 35% para o etanol absoluto. Seque quimicamente as amostras com hexametiletiladisilazane por 10 minutos. A hexa-ethyldisilazane deve ser cuidadosamente manipulada dentro de um capô de fumaça.
As amostras devem ser permitidas para secar durante a noite dentro de um desiccador ou dentro do capô de fumaça à temperatura ambiente. Monte as amostras secas em um stub, com uma fita adesiva condutora de carbono. Sputter os stubs com ouro.
Registo imagens SEM com um microscópio eletrônico de varredura, SEM, em modo de baixo vácuo e baixa tensão, 20 kilovolts. A figura um descreve a preparação de nano liposomos. Fosfolipídios, droga, pino e chems, os principais constituintes liposso, foram primeiro dissolvidos em clorofórmio para obter o filme lipíduo.
O filme lipídico foi então rehidratado em um tampão salino, contendo a proteína hidrofílica, tarina, para ser entranhada, e a incubação deve ser pré-formada durante a noite. Em seguida, a sônica e a extrusão são aplicadas para gerar pequenas vesículas unilamellar. O passo de ultracentrifugação separa a preparação lipossômica de lipídios livres e proteína não encapsulada.
Enquanto o supernante é usado para a determinação da eficiência da armadilha. Os nanoliposomos produzidos utilizando a metodologia acima mencionada exibem uma distribuição de tamanho variando de 51 a 396 nanômetros, e um tamanho médio de 155 nanômetros. A preparação é homogênea, uma vez que o índice de polidispersidade é de 168.
Uma alta eficiência de armadilha de 83% é alcançada se os lipossomos forem extrudados através de uma membrana de tamanho de poros de 2 micrômetros. As características do nanoliposomeo morfológico foram avaliadas pela microscopia eletrônica de varredura. Os lipossomos devem ser finalmente tratados de forma semelhante às células vivas, para obter imagens de melhor qualidade.
Procedimentos de fixação e secagem são importantes para garantir a visualização de vesículas intactas menores que suportam mais de 20 quilovolts em condições de vácuo. As figuras 2A e 2B exibem vesículas liposômicas em forma redonda na faixa de 121 nanômetros, analisadas a 20 kilovolts. Considerando que as figuras 2C e 2D exibem amostras inadequadamente preparadas.
Amostras maltratadas permitidas apenas para a observação de vesículas maiores e ou danificadas, que não resistem às condições de vácuo e ou tensão. O protocolo descrito, aqui dentro, permitiu a produção de vesículas reprodutíveis exibindo uma forma redonda, pequena superfície e tamanho médio de aproximadamente 150 nanômetros. O método pode ser usado para prender moléculas complexas e grandes, como uma proteína tetramérica, exibindo um corretivo hidrofílico.
A auto-armadilha deficiente é superior a 80% e a taxa de vazamento é muito baixa, inferior a 1,5% Quando as nanocápsulas são armazenadas a quatro graus Celsius. Esperamos que este vídeo o ajude no encapsulamento de grandes moléculas, como teri.
Visão Geral
Este estudo demonstra a preparação de nanocápsulas lipossomais encapsulando a proteína hidrofílica tarina utilizando um método de filme lipídico fino. A encapsulação tem como objetivo aumentar a estabilidade, controlar a liberação e superar os desafios para alcançar alta eficiência de encapsulação.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Nanotecnologia
- Biotecnologia
- Ciências Farmacêuticas
Antecedentes
- As nanocápsulas lipossomais são utilizadas para a liberação de fármacos.
- A encapsulação de proteínas pode melhorar sua estabilidade e biodisponibilidade.
- Os desafios incluem a seleção dos lipídios e a manutenção da bioatividade.
- A dispersão dinâmica da luz e a microscopia eletrônica de varredura são técnicas fundamentais de caracterização.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para encapsular tarina em nanocápsulas lipossomais.
- Melhorar a estabilidade e a liberação controlada de proteínas hidrofílicas.
- Fornecer um protocolo que aborde desafios comuns na preparação de lipossomas.
Métodos Utilizados
- Preparação de lipossomos utilizando uma técnica de extrusão.
- Caracterização por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de varredura.
- Eficiência de encapsulação determinada usando o protocolo de Peterson.
- Ultracentrifugação para separar lipossomos de proteínas não encapsuladas.
Resultados Principais
- Obteve-se uma encapsulação bem-sucedida da tarina.
- A caracterização confirmou o tamanho e a estabilidade dos lipossomos.
- O método demonstrou alta eficiência de encapsulação.
- Os desafios na seleção dos lipídios foram abordados de forma eficaz.
Conclusões
- O método do filme lipídico fino é eficaz para a preparação de nanocápsulas lipossomais.
- A encapsulação de proteínas hidrofílicas pode aumentar seu potencial terapêutico.
- Este protocolo pode ser adaptado para outras moléculas hidrofóbicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O encapsulamento de proteínas hidrofílicas em nanolipossomos resolve desafios fundamentais na entrega de biológicos, incluindo estabilidade, biodisponibilidade e liberação controlada. Este método apóia a validação precoce de alvos ao permitir a formulação reprodutível de biomoléculas complexas para ensaios funcionais. A alta eficiência de aprisionamento e a baixa taxa de vazamento aumentam a confiança preditiva em pipelines de desenvolvimento pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação da função proteica em um ambiente protegido e biomimético, esclarecendo os mecanismos-alvo.
- Valor Operacional: Fornece nanovesículas padronizadas para condições de ensaio consistentes entre equipes de descoberta.
- Valor Preditivo: Reduz a ambiguidade mecanicista ao manter a bioatividade proteica durante a encapsulação e o armazenamento.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera vesículas uniformes em escala nanométrica (média de 155 nm, PDI 0,168) adequadas para plataformas de triagem de alto rendimento.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas de extrusão e ultracentrifugação que minimizam a variabilidade entre lotes.
- Prontidão para Ensaios: Facilita a preparação de sistemas estáveis de interação ligante-receptor utilizando proteínas globulares aprisionadas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a progressão do descobrimento para a fase pré-clínica ao manter a integridade estrutural de proteínas tetraméricas.
- Mitigação de Riscos: Baixa taxa de vazamento (<1,5% a 4 °C) possibilita modelagem confiável da farmacocinética e da biodistribuição.
- Ponte de Formulação: Oferece uma plataforma escalonável de nanocarreadores adaptável a outros biológicos hidrofílicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a otimização do fármaco líder e a formulação pré-clínica, especialmente para proteínas hidrofílicas que necessitam de estabilização.
- Biologia de Descoberta: Permite testes funcionais de lectinas e proteínas globulares aprisionadas em estudos de elucidação de vias metabólicas.
- Triagem: Fornece nanolipossomas monodispersos adequados para ensaios baseados em fluorescência ou ensaios de ligação que exigem tamanho uniforme de partículas.
- Análise: Utiliza dispersão dinâmica da luz para distribuição de tamanho quantitativa e eficiência de encapsulação por meio do protocolo de Peterson para quantificação precisa.
- Pesquisa Translacional: Mantém a integridade proteica por meio de extrusão suave e armazenamento a frio, apoiando modelos pré-clínicos alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um procedimento operacional padrão reprodutível para encapsulação lipossomal aplicável a múltiplos alvos proteicos e projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Alta eficiência de aprisionamento (83%) e baixa vazão melhoram a confiabilidade dos dados em estudos de interação com alvos.
- Valor Operacional: Hidratação padronizada do filme lipídico e extrusão permitem produção escalável e adaptável às Boas Práticas de Fabricação.
- Valor Estratégico: Reduz a taxa de desistência ao minimizar desafios de formulação no início do processo de descoberta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos proteicos com base na capacidade de desenvolvimento e viabilidade de formulação.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em manipulação de lipídios, sonicação, extrusão e técnicas de ultracentrifugação.
- Depende do acesso a evaporador rotativo, extrusor com membranas de policarbonato, DLS, MEV e ultracentrífuga.
- Necessita padronização entre equipes quanto às proporções de lipídios, tampões de hidratação e ciclos de extrusão para garantir reprodutibilidade.
- A adaptação a outros modelos requer otimização da composição lipídica e da concentração de carga proteica.
- As limitações práticas incluem possíveis interações entre lipídios e proteínas, além da necessidade de análise em triplicata para assegurar a precisão da quantificação.
