Preparação de amostras para espectrometria de ionização de eletrospray de sonda
19 de fevereiro de 2020
Este artigo introduz métodos de preparação de amostras para um método analítico único em tempo real baseado na espectrometria de massa ambiente. Este método nos permite realizar a análise em tempo real das moléculas biológicas in vivo sem nenhum pré-tratamento especial.
Então, esta é uma espectrometria de massa ambiente única, particularmente adequada para a análise de amostras biológicas, tanto in vitro quanto in vivo. Como isso não requer regularmente um pré-tratamento especial de amostras, como classificação celular, fracionamento e concentração, pode analisar uma amostra com perda mínima de componentes biológicos, especialmente aqueles que existem como quantidade muito pequena. Esta técnica permite analisar as matérias-primas diretamente em um minuto por espectrometria de massa.
A rapidez é desempresa na robustez do sistema, principais vantagens inerentes a essa técnica. Tudo que você tem que fazer é apenas para preparar sílica, 10 miligramas de amostras de tecidos, e 10 microliters de proliferação. E colocá-los em cartucho descartável.
Ele está definido para a máquina PESI-MS, e você terá o resultado em poucos minutos. Escolhendo o espectrômetro de massa apropriado, você pode anotar a identidade molecular. Para começar, recupere o fígado ou tecido renal do congelador.
Em uma placa de cortiça, corte a amostra de tecido para aproximadamente dois por dois milímetros usando um bisturi ou faca. Alternativamente, soque a amostra com o Trepan e corte o comprimento da coluna para dois milímetros. Se o tecido estiver contaminado com sangue, lave brevemente com soro fisco tamponado de fosfato gelado.
Coloque aproximadamente 10 miligramas da amostra cortada ou perfurada em um microtubo plástico e adicione 100 microliters de 50% de etanol. Use uma micropéstle para homogeneizar a amostra. Em seguida, com o pipetman, coloque 10 microliters do homogeneizar no poço do cartucho do espectrômetro de massa.
Coloque o cartucho na câmara de ionização do Espectrômetro de Massa de Ionização da Sonda Direta e instale a sonda de agulha de roubo inoxidável que será usada para a ionização da amostra. Feche firmemente a tampa da câmara para ativar automaticamente o dispositivo de segurança. Inicie o computador de bordo clicando no ícone de partida para analisar, usando os painéis na tela, aplique uma tensão de 2,3 quilovolts na agulha para gerar o eletrospray e certifique-se de que a frequência da agulha é de três hertz.
Aguarde 30 segundos para que a medição seja concluída. Depois de medir cada amostra, descarte o cartucho e a agulha em um descarte de risco biológico. Para analisar o espectro de massa, abra o software associado ao espectrômetro de massa.
Clique no arquivo L-C-D na janela do navegador de arquivo de dados do software. Escolhendo clicar em um único pico da janela de espectro de massa, e para representar automaticamente um E-I-C. Verifique o T-I-C e o E-I-C e clique no ícone de espectro médio para selecionar a janela de tempo para gerar o espectro de massa.
Exporte os dados de texto espectral em massa. Para analisar os fluidos corporais, elave até 10 microliters da amostra de soro e distribua-os em um microtubo de 1,5 mililitro. Adicione 190 microliters de 50% de etanol ao tubo, depois vórtice por dois minutos em temperatura ambiente.
Para eliminar todos os glóbulos vermelhos, centrifugar o líquido a 15.000 vezes G por um a cinco minutos a quatro graus Celsius. Transfira 10 microlitres do supernante para o poço do cartucho e proceda à medida no espectrômetro de massa como anteriormente. Este protocolo mostra a preparação amostral para PESI-MS em amostra sólida, amostra líquida e animal vivo.
O carcinoma de células renais humanas mostra picos característicos de lipídios neutros. Houve picos relativamente fortes nos espectros na proporção massa-carga de 900 do tecido carcinoma de células renais humanas que não foram identificados no tecido não canceroso circundante. Esses picos representam principalmente o glicerol triacyl.
Exemplo de dados adquiridos em tecidos hepáticos normais, retratou a lesão neoplásica de um paciente com hepatite crônica e cirrose hepática. O soro humano de três indivíduos foi analisado utilizando-se o PESI-MS, houve diferenças claras nos padrões espectrais entre os indivíduos. Para as alterações metabólicas em 5-FdU injetadas intravenosamente no vaso de cauda de um rato, a detecção muito rápida e sensível de 5-FdU com aduto de sódio foi alcançada no fígado in situ.
Como a profundidade da ponta da agulha do local do tecido, desempenha o papel mais importante na ionização que lê a aquisição de dados bem sucedida, certifique-se de seguir as instruções. Você pode identificar as espécies moleculares olhando para o banco de dados comercial. Esta é uma maneira de qualificar o mecanismo molecular da doença.
Muitos pesquisadores se interessaram pela aplicação dessa técnica para prever a prosperidade da doença e seu prognóstico. Especialmente usando biópsia ricket. Apenas certifique-se de não ser picado pela agulha da sonda.
Isso pode ser simplesmente evitado com um instrumento específico para remover a agulha da máquina.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um método único de espectrometria de massas em ambiente para análise em tempo real de amostras biológicas in vivo. Esta técnica permite a análise de materiais teciduais brutos sem pré-tratamentos especiais, minimizando a perda de componentes biológicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Espectrometria de Massas
- Análise Biológica
- Química Analítica
Antecedentes
- A espectrometria de massa ambiental é adequada tanto para análise in vitro como in vivo.
- O método não exige tratamento prévio extensivo da amostra.
- Permite a análise de amostras com perda mínima de componentes biológicos.
- A análise rápida é uma vantagem fundamental desta técnica.
Objetivo do Estudo
- Apresentar um método para análise em tempo real de moléculas biológicas.
- Demonstrar a eficiência da análise de materiais teciduais brutos.
- Destacar as vantagens do uso da espectrometria de massas em condições ambientes.
Métodos Utilizados
- Preparação de espécimes de sílica e tecidos.
- Uso de cartuchos descartáveis para análise de amostras.
- Análise direta de amostras biológicas por espectrometria de massas.
- Processamento rápido de amostras em menos de um minuto.
Resultados Principais
- O método permite uma análise rápida sem perda significativa de componentes.
- É eficaz para analisar amostras com quantidades muito pequenas de material biológico.
- Demonstra robustez e confiabilidade na análise em tempo real.
- Facilita o estudo de moléculas biológicas em seu estado nativo.
Conclusões
- A espectrometria de massas ambiental é uma ferramenta valiosa para análise biológica.
- A técnica aprimora a compreensão dos processos biológicos.
- Ela oferece um método rápido e eficiente para análise em tempo real.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A espectrometria de massas com ionização por eletrospray com sonda (PESI-MS) permite a análise molecular em tempo real de amostras biológicas com tratamento prévio mínimo, apoiando a validação rápida de alvos e a redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. A técnica requer apenas 10 mg de tecido ou 10 µL de soro, tornando-a adequada para amostras pré-clínicas de baixo volume e reduzindo a perda de componentes biológicos. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao fornecer dados diretos, in situ, sobre metabólitos e dinâmica de fármacos em sistemas vivos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a detecção de lipídios neutros e metabólitos diretamente em tecidos sólidos, como o carcinoma de células renais.
- Valor Operacional: Exige preparo mínimo da amostra — apenas a homogeneização do tecido em etanol a 50% — reduzindo a complexidade e a variabilidade do fluxo de trabalho.
- Valor Preditivo: Apoia a qualificação de mecanismos moleculares por meio da correspondência com bancos de dados comerciais, auxiliando na avaliação da confiança no alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Permite a análise direta de soro sanguíneo humano após precipitação simples com etanol e centrifugação, possibilitando a triagem de biomarcadores baseada em fluidos.
- Valor Operacional: Utiliza cartuchos descartáveis e sondas de aço inoxidável, garantindo padronização e reduzindo o risco de contaminação cruzada.
- Escalabilidade: Facilita a rápida renovação das amostras — resultados em poucos minutos — favorecendo a preparação para triagem de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite o rastreamento em tempo real da dinâmica de metabólitos ou fármacos em órgãos específicos de animais vivos, como a detecção de 5-FdU no fígado de camundongo.
- Desriskagem Mecanística: Fornece dados moleculares in situ sem destruição do tecido, preservando o contexto fisiológico para uma melhor transição pré-clínica para clínica.
- Progressão com Base em Risco: Detecta padrões espectrais associados a doenças (por exemplo, lesões neoplásicas em fígado cirrótico) para orientar decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A PESI-MS insere-se no espectro de descoberta que vai da biologia inicial à identificação de compostos líderes, oferecendo leituras moleculares rápidas e quantitativas que apoiam a verificação de hipóteses e a preparação de ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a detecção de assinaturas moleculares específicas de tecidos (por exemplo, triacilglicerol em carcinoma) sem necessidade de fracionamento.
- Triagem: Permite análise de fluidos e tecidos prontos para ensaios por meio de introdução padronizada de amostras com cartuchos.
- Análises: Gera dados espectrais de massa (picos de m/z, EIC, TIC) para comparação quantitativa entre condições e indivíduos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio do monitoramento in vivo de metabólitos de fármacos, como 5-FdU intravenoso na veia da cauda de camundongo.
- Reutilização Corporativa: Utiliza hardware reutilizável (sonda, câmara) com consumíveis descartáveis, permitindo padronização entre projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao fornecer dados moleculares diretos de sistemas biológicos intactos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de preparação padronizada de amostras (10 mg de tecido, 10 µL de soro, 50% de etanol) e configurações fixas de tensão/frequência (2,3 kV, 3 Hz).
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao permitir detecção rápida de metabólitos/fármacos em modelos de doenças.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco mediante a detecção de picos específicos da doença (por exemplo, m/z 900 no carcinoma) ausentes nos controles.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência na operação de espectrometria de massas, incluindo preparação de solvente (50% etanol) e uso de centrífuga para processamento de soro.
- Requer um Espectrômetro de Massas com Ionização por Sonda Direta equipado com sistema de cartucho compatível e sonda de agulha de aço inoxidável.
- Exige padronização entre equipes no manuseio de amostras — corte de tecidos, homogeneização e transferência de sobrenadante — para garantir consistência dos dados.
- Deve considerar a profundidade da ponta da agulha como uma variável crítica que afeta a eficiência de ionização e a qualidade dos dados em aplicações in vivo.
- Restrito a amostras compatíveis com ionização ambiente; efeitos de matriz podem exigir otimização para biofluidos complexos.
