Name: A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprenda a detectar 5-hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos usando imunofluorescência e dot-blot de DNA. Este protocolo revela dinâmicas epigenéticas na diferenciação neuronal.

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O XL foi apoiado na parte pelo programa nacional da chave R & D de China (2017YFE0196600), e pela Fundação Nacional da ciência natural de China (Grant nos. 31771395, 31571518). VEÍCULO especial Q.S.P. foi apoiado pelo programa de pesquisa e desenvolvimento chave nacional da China (2017YFC1001703) e o programa-chave de pesquisa e desenvolvimento da província de Zhejiang (2017C03009). W.X. foi apoiado pela Fundação de ciência natural da província de Zhejiang (LY18H020002) e departamento de tecnologia da ciência da província de Zhejiang (2017C37057).

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê de ética animal da Universidade de Zhejiang.
1. a cultura de células-tronco neurais adultas e neurônios
<ol><li>Isole pilhas de haste neural adultas do prosencéfalo de um adulto (8-10 semanas velho) C57/BL6 macho rato como descrito previamente31,32.</li>
	<li>Cultura células tronco neurais adultas em DMEM/F-12 médio contendo 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 suplemento, 1% antibiótico-antimicótico, e 2 mM L-glutamina em uma incubadora de 5% CO2 em 37 ° c. Induzir a diferenciação de células-tronco neurais adultas com 1 μm de ácido retinóico e 5 μm de forskolina para 48 h, conforme descrito anteriormente31,32.</li>
	<li>Isolar os neurônios do dia embrionário 17 (E17) hipocampo do rato e cultura com meio neurobasal contendo de 0,25% L-glutamina, 0,125% glutamax e 2% B27 suplemento em uma incubadora de co2 de 5% a 37 ° c como descrito anteriormente33.</li>
</ol>2. perfusão transcardial do rato
<ol><li>Prepare 10% de hidrato de cloral, 4% paraformaldeído (PFA) e tampão fosfato salina (PBS) um dia antes do experimento, e armazene a 4 ° c.</li>
	<li>Anestesiar um adulto macho ou fêmea C57 BL/6J rato com 10% hidrato de cloral (50 mg/kg, i.p.), e certifique-se de que o animal está profundamente anestesiado, verificando a reação do corpo. Fixar cada membro com fita adesiva em uma placa de plástico (em uma posição de face para cima).</li>
	<li>Corte a pele e, em seguida, o músculo com tesoura cirurgia. Abra a cavidade torácica com uma tesoura cirúrgica. Expor o coração e cortar uma pequena parte do átrio direito com uma tesoura cirúrgica multa.</li>
	<li>Perfuse o rato com uma seringa esterilizada descartável de 10 mL do ventrículo esquerdo com PBS frio (ao redor 30 mL por o rato adulto).</li>
	<li>Perfuse o rato com o PFA de 4% (ao redor 30 mL em 10 minutos por ratos adultos) até que esteja duro.</li>
	<li>Abra o crânio do mouse com fórceps ósseo. Retire o cérebro e coloque em 5 mL de PFA de 4% em um tubo de centrífuga de 15 mL para a pós-fixação a 4 ° c. Nota: Limpe a área cirúrgica após a cirurgia ter terminado.</li>
	<li>Pelo menos 24 h mais tarde, transfira as amostras do cérebro em uma solução da sacarose de 30% para a desidratação completa em 4 ° c.</li>
</ol>3. seccionamento cerebral
<ol><li>Incorpore as amostras cerebrais em um composto de temperatura de corte ideal (OCT) em um pequeno recipiente e esfrie a-20 ° c por pelo menos 1 h.</li>
	<li>Amostras do cérebro da seção em uma espessura de 20-40 μm com um micrótomo do criostato.</li>
	<li>Colete seções em PBS e armazene a 4 ° c.</li>
</ol>4. coloração da imunofluorescência
<ol><li>Pegue as seções com as regiões cerebrais alvo e colocá-los em uma placa de 24 poços com PBS. Para células cultivadas em uma lamínula, vá diretamente para a etapa 4,2.</li>
	<li>Lave com PBS na coqueteleira à temperatura ambiente durante 10 min. Repita isto duas vezes mais.</li>
	<li>Remova o PBS e trate com HCl pré-aquecido de 1 M por 30 min a 37 ° c. Nota: Prepare 1 M HCl adicionando 1 mL de ácido clorídrico (36-38%) em 10 mL de água em um capuz químico. Pré-aqueça 1 M HCl na incubadora a 37 ° c.</li>
	<li>Lave as amostras com PBS durante 5 min. Repita isso duas vezes mais.</li>
	<li>Amostras de bloco com PBS contendo 3% de soro de cabra normal e 0,1% Triton X-100 por 1 h na coqueteleira à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar secções com anticorpos primários específicos durante a noite a 4 ° c na coqueteleira. Nota: Use os seguintes anticorpos preliminares: anticorpos Polyclonal do coelho anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000), anticorpo monoclonal anti-NeuN do rato (1:500).</li>
	<li>Tire as amostras e incubar ainda à temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Lave as amostras com PBS durante 10 min. Repita isso duas vezes mais.</li>
	<li>Incubar com anticorpos secundários correspondentes aos anticorpos primários à temperatura ambiente durante 1 h na coqueteleira. Cubra a placa com alumínio. Nota: Use os seguintes anticorpos secundários: Alexa fluor 488 cabra anti-coelho IgG (1:500), Alexa fluor 568 cabra anti-mouse IgG (1:500). Núcleos de contratura com 4 ′-2-diamidino-phenylindole (DAPI).</li>
	<li>Lave as amostras com PBS durante 10 min na coqueteleira. Repita isso duas vezes mais.</li>
	<li>Monte seções cerebrais sobre as lâminas, adicione uma quantidade adequada de meio de montagem Antifade (cerca de 100-150 μL), e cubra com vidro de cobertura Premium. Selo com lustrador de prego.</li>
	<li>Tome imagens com um microscópio de fluorescência regular ou confocal.</li>
</ol>5. isolação do ADN de Genomic
<ol><li>Eutanizar um adulto C57 BL/6J mouse (masculino ou feminino) por luxação cervical e remover o cérebro.</li>
	<li>Dissecar os tecidos do hipocampo, córtex e cerebelo em um prato refrigerado a gelo. Esfregue os tecidos com um moedor de tecido em 1 mL de tampão de lise de DNA e transfira para o tubo de microcentrífuga limpo. Adicionar 250 μg de proteinase K por 600 μL de tampão de Lise. Para pelotas da pilha, adicione diretamente o amortecedor do lysis, proteinase K, e misture-o completamente. Nota: Prepare o tampão do lysis do ADN: EDTA de 5 milímetros, 0,2% SDS, 200 milímetros NaCl em 100 milímetros Tris-HCl, pH 8,5. Lave e autoclave o moedor de tecido antes do experimento.</li>
	<li>No segundo dia, acrescentar cerca de 50 μg de RNase A por amostra de pelo menos 12 h a 37 ° c.</li>
	<li>Adicione um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1) e misture completamente.</li>
	<li>Centrifugue a 20.817 x g durante 15 min e retire o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Adicionar 600 μL de clorofórmio ao sobrenadante para precipizar o ADN e misturar completamente.</li>
	<li>Centrifugue a 20.817 x g durante 15 min e retire o sobrenadante para outro tubo novo.</li>
	<li>Adicionar 500 μL de isopropanol ao sobrenadante e misturar cuidadosamente.</li>
	<li>Centrifugue em 20.817 x g por 15 min, e retire o sobrenadante completamente.</li>
	<li>Lave a precipitação com 1 mL de 70% de etanol, Centrifugue a 20.817 x g durante 1 min e retire o sobrenadante completamente. Repita uma vez.</li>
	<li>Seque completamente o pellet de DNA.</li>
	<li>Dissolva a pelota do ADN com amortecedor de Tris-HCl (pH 8,5) à concentração apropriada.</li>
</ol>6. borrão do ponto do ADN
<ol><li>Preparar as soluções: 2 M NaOH, tampão Tris-HCl (pH 8,5), 6x citrato de sódio salino (SSC).</li>
	<li>Faça a mistura da amostra como tabela 1.</li>
	<li>Amostras de DNA de denature a 100 ° c por 10 min, e resfriar no gelo.</li>
	<li>Corte o tamanho adequado da membrana de nylon (por exemplo, HYBOND-N +) e enxague com 6x SSC.</li>
	<li>Põr a membrana sobre o instrumento do ponto-Borrão e conecte-a à bomba de vácuo. Ponto 6 μL de mistura por ponto na membrana.</li>
	<li>Hibridizar por 30 min a 80 ° c e bloquear a membrana da amostra com leite sem gordura em soro fisiológico com tampão Tris (TBS) por 1 h.</li>
	<li>Incubar com anticorpo primário a 4 ° c durante a noite. Nota: o seguinte anticorpo preliminar: coelho Polyclonal anti-5-hydroxymethylcytosine (1:5000).</li>
	<li>No segundo dia, incubar as membranas da amostra à temperatura ambiente durante 1 h. Lave com TBS durante 10 min. Repita esta lavagem mais duas vezes.</li>
	<li>Incubar a membrana com anticorpo secundário anticoelho (1:5000) durante 30 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave com TBS durante 10 min. Repita esta lavagem mais duas vezes.</li>
	<li>Visualize os sinais de quimioluminescência e quantifique intensidades de sinal.</li>
</ol>

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</ol>

Não existem interesses financeiros concorrentes.

Modificações epigenéticas desempenham papéis essenciais durante o desenvolvimento do cérebro, maturação e função. Como um marcador estável para a modificação do ADN, o 5-hmC dinâmico responde à adaptação comportamental, à atividade neuronal, e é correlacionado positivamente com a expressão de gene; assim, está envolvida na função normal do cérebro e da desordem neurológica4. Para explorar sua função em células e tecidos, é necessário detectar a existência de 5-hmC e comparar o nível antes e após o...

As modificações epigenéticas, incluindo a modificação do ADN, a modificação do histona e a modificação do RNA, foram mostradas para jogar funções essenciais em processos e em doenças biológicos diversos1,2,3, 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. por um longo tempo, METILAÇÃO de DNA (ou seja, 5-metilcitosina (5-MC)) tem sido visto como um marcador epigenético altamente estável e não pode ser mais modificado no genoma. Recentemente, verificou-se que 5-MC poderia ser oxidado a 5-Hidroximetilcitosina (5-hmC) por Tet (dez-onze translocações) proteínas dafamília, incluindoTET1, TET2, e TET38,9. Estudos adicionais mostram que 5-hmC poderia servir como um marcador estável e desempenhar papéis biológicos através da regulação da expressão gênica4,10,11,12.
As evidências atuais indicam que 5-hmC é altamente enriquecido em tecidos/células neuronais em relação a outros tipos de tecidos em mamíferos, e apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento neuronal13,14. No sistema neuronal, as modificações epigenéticas mediadas por 5 hmC desempenham um papel importante na regulação das células-tronco neurais, atividade neuronal, aprendizagem e memória, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas, incluindo Síndrome de Rett, autismo, Alzheimer doença de Huntington, etc.2,13,15,16,17,18,19,20.
Existem várias abordagens para a detecção de 5-hmC em células e tecidos14,21,22,23,24. Aqui, nós descrevemos dois métodos para detectar a existência de 5-hmC e quantificamos o nível global de 5-hmC: a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN. Estes dois métodos são convenientes e sensíveis, e foram usados com sucesso em estudos precedentes25,26,27,28,29,30. Os passos-chave destes dois métodos são a desnaturação do DNA. Para a coloração da imunofluorescência de 5-hmC, o pré-tratamento das amostras com 1 M HCl é exigido. Para o ponto-borrão de 5 hmC, a desnaturação do ADN é executada com solução de NaOH. Esses dois métodos, juntamente com o sequenciamento de próxima geração, são ferramentas muito úteis para investigar a função do 5-hmC.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop software</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-coelho IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 cabra anti-rato IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>anti-5-hidroximetilcitosina</td><td>Motivo ativo</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Micrótomo criostato</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 médio</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento epidérmico</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos-básico</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Vector Laboratories</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nylon (Hybond&trade;-N+)</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>OCT</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido</td> <td>retinóicoSigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

a detecção de 5-hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

As modificações múltiplas do ADN foram identificadas no genoma mamífero. Deste, 5-methylcytosine e 5-hydroxymethylcytosine-mediam mecanismos epigenéticas foram estudados intensivamente. 5-Hidroximetilcitosina apresenta características dinâmicas durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do cérebro, desempenha uma função reguladora na expressão gênica, e está envolvida em múltiplas desordens neurológicas. Aqui, nós descrevemos os métodos detalhados que incluem a coloração da imunofluorescência e o dot-borrão do ADN para detectar 5 hydroxymethylcytosine em pilhas cultivadas e em tecidos do cérebro do rato.

Para revelar a distribuição de 5-hmC no hipocampo de camundongos adultos, realizamos imunofluorescência com anticorpos contra células neuronais (NeuN) e 5-hmC. No hipocampo, o 5-hmC colocalizada bem com marcador de células neuronais NeuN (Figura 1a-H), sugerindo um enriquecimento de 5-HMC em neurônios.
Para determinar a dinâmica de 5-hmC durante o desenvolvimento neuronal, um dot-blot foi realizado pela primeira vez com amostras de DNA isoladas de...

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar 5-hidroximetilcytosina nas células e nos tecidos cerebrais usando imunofluorescência, o novo método, e o dna ponto-mancha. 5-hidroxietilcytosina, ou seja, 5hmC, modificação epigenética atenuada, desempenha importante função na regulação da expressão genética e envolvida em múltiplos distúrbios neurológicos.Na verdade, nossos métodos podem ser usados para detectar 5hmC em múltiplas células e tecidos. É conveniente e pode ser realizado com equipamentos comuns no laboratório. Comece posicionando o rosto do mouse em uma placa de plástico e fixando cada membro com fita adesiva.Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele e o músculo, e abrir a cavidade torácica. Exponha o coração e corte uma pequena parte do átrio direito com uma tesoura cirúrgica fina. Usando uma seringa descartável de 10 mililitros, esterilizada, perfunda o mouse do ventrículo esquerdo com PBS frio.Em seguida, perfunde o mouse com 4%PFA até que ele esteja duro. Então, abra o crânio com fórceps ósseos e remova o cérebro. Coloque o cérebro em um tubo de centrífuga de 15 mililitros cheio de cinco mililitros de 4% PFA e armazene-o a quatro graus Celsius.Após 24 horas, transfira o cérebro para uma solução de 30% de sacarose e deixe-o a quatro graus Celsius para desidratação completa. Antes da secção, embebedou o cérebro em um composto de temperatura de corte ideal e esfriou para menos 20 graus Celsius por pelo menos uma hora. Seção amostras cerebrais com uma espessura de 20 a 40 micrômetros usando um microtome criostat.Colete seções na PBS e armazene a quatro graus Celsius. Pegue as seções cerebrais de interesse e coloque-as em uma placa de 24 poços com PBS. Lave as seções com PBS em um shaker por 10 minutos.Retire o PBS e trate com ácido clorídrico de um molar pré-aquecido a 37 graus Celsius por 30 minutos. O ácido clorídrico é corrosivo e, por favor, prepare-o no porão químico. Em seguida, lave as amostras três vezes com PBS por cinco minutos e bloqueie-as com PBS contendo soro de cabra 3% normal e 0,1% Triton X-100.Deixe as amostras em um agitador à temperatura ambiente por uma hora. Adicione anticorpos primários específicos às seções e incubar durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker. No dia seguinte, pegue as amostras e deixe-as em temperatura ambiente por uma hora.Lave as amostras três vezes com PBS e adicione anticorpos secundários. Cubra a placa com alumínio e deixe-a em temperatura ambiente por uma hora enquanto treme. Após a incubação, lave as amostras três vezes com PBS e monte-as em slides.Adicione 100 a 150 microliters de meio de montagem anti-fade, cubra com um vidro de cobertura premium e vedação com esmalte. Imagem as seções cerebrais com um microscópio regular ou confocal. Para isolar o DNA genômico, comece dissecando os tecidos de hipocampo, córtex e cerebelo em um prato refrigerado ao gelo.Adicione um mililitro de tampão de dna e triture os tecidos. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuge limpo e adicione 250 microgramas de proteinase-K para cada 600 microliters de tampão de lise. Em seguida, adicione cerca de 50 microgramas de RNase A por amostra e incubar por pelo menos 12 horas a 37 graus Celsius.Após a incubação, adicione um volume igual de álcool isoamílico de clorofórmio fenol e misture bem. Centrifugar a mistura de acordo com as instruções do manuscrito e transferir o supernatante para um novo tubo. Adicione 600 microlitadores de clorofórmio ao supernanato, misture bem e centrífuga de acordo com as instruções do manuscrito.Transfira o supernatante para um novo tubo e adicione 500 microliters de isopropanol. Misture bem e centrífuga novamente para precipitar o DNA. Após a centrifugação, descarte o supernasce, e lave a pelota de DNA com 70% de etanol de acordo com as instruções do manuscrito.O ar secou completamente a pelota de DNA e, em seguida, dissolvê-la em tampão Tris-HCl. Antes de começar, prepare as soluções necessárias e a mistura de amostras de acordo com as instruções do manuscrito. Desnaturar a amostra de DNA aquecendo-a a 100 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, colocá-la no gelo.Corte o tamanho apropriado de uma membrana de nylon e enxágue-a com 6X SSC. Coloque a membrana em um aparelho de mancha de ponto e conecte a bomba de vácuo. Detectar pontos de seis microliter na membrana e hibridizar por 30 minutos a 80 graus Celsius.Em seguida, bloqueie a membrana amostral com leite sem gordura e soro fisiológico tris-tampão, ou TBS, por uma hora. Adicione o anticorpo anti-5-hidroxitilcitomitosina do coelho policlonal à membrana e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, deixe a membrana amostral à temperatura ambiente por uma hora, depois lave a membrana três vezes com TBS.Incubar a membrana com o anticorpo secundário anti-coelho por 30 minutos e, em seguida, lavar três vezes com TBS. Visualize os sinais de chemiluminescência e quantifique sua intensidade. Este protocolo pode ser usado para visualizar 5-hidroxietilcitose, ou 5hmC, no hipocampo de camundongos adultos.Imunofluorescência com anticorpos contra células neuronais, o 5hmC revela que há um enriquecimento de 5hmC nos neurônios. A dinâmica de 5hmC durante o desenvolvimento neuronal pode ser determinada com um ensaio de manchas de ponto de amostras de DNA isoladas da proliferação e células-tronco neurais adultas diferenciadas. Os níveis globais de 5hmC aumentam significativamente durante a diferenciação e o nível de 5hmC em neurônios é maior do que em células-tronco neurais.O passo chave deste método é garantir a desnaturação completa das amostras de DNA.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

A administração de dois análogos de timidina, EdU e BrdU, em ratinhas grávidas permite a análise da progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais e no cérebro do rato embrionário. Este método é útil para determinar os efeitos do stress genotóxico, incluindo a radiação ionizante, durante o desenvolvimento do cérebro.

Avaliando a progressão do ciclo celular de tronco neurais e as células progenitoras no desenvolvimento do cérebro do rato após estresse genotóxico

Aqui descrevemos um método imunoquímico sensível para mapear a distribuição espacial de derivados de oxidação de 5mC com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação de sinal de tiramida.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

Apresentamos um método eficaz e reprodutível para isolar e cultura de células progenitoras neurais do tecido do cérebro embrionário e pós-natal por imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de histona 3 lisina 79 laboratório (H3K79me2) - uma marca do histone localizada dentro do domínio globular de histona 3.

Isolamento e cultivo de progenitores neurais seguido de imunoprecipitação de cromatina da marcação de dimetilação da lisina 9 da histona 3

O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

O ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado é um método à base de anticorpos usado para enriquecer para fragmentos de RNA metilado. Juntamente com sequenciamento profundo, leva à identificação de transcrições carregando a modificação m5C.

Ensaio de imunoprecipitação de RNA metilado para estudar m5C modificação em Arabidopsis

A capacidade de marcar permanentemente células-tronco e sua prole com um fluoróforo usando uma linhagem transgênica indutível que traça a linhagem do mouse permite a análise espacial e temporal de ativação, proliferação, migração e/ou diferenciação in vivo. O rastreamento de linhagem pode revelar novas informações sobre o comprometimento da linhagem, a resposta à intervenção e a multipotência.

Rastreamento de linhagem de células-tronco fluorescentes indutíveis no cérebro do rato adulto

Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Aprenda a detectar 5-hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos usando imunofluorescência e dot-blot de DNA. Este protocolo revela dinâmicas epigenéticas na diferenciação neuronal.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

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