Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish
28 de janeiro de 2020
As tecnologias de edição de genes permitiram que os pesquisadores gerassem mutantes de zebrafish para investigar a função genética com relativa facilidade. Aqui, fornecemos um guia para realizar genotipagem e quantificação de embriões paralelos em sinais de hibridização in situ em zebrafish. Essa abordagem imparcial proporciona maior precisão em análises fenotípicas baseadas na hibridização do situ.
As consequências das mutações na expressão genética são frequentemente avaliadas qualitativamente pela hibridização in situ e geralmente pontuadas visualmente, o que é subjetivo e tendencioso pelas expectativas do pesquisador. Este método fornece uma maneira mais consistente de comparar experimentos in situ quantificando intensidades de imagem e remove esse viés. Isso também pode ser facilmente adaptado a outros sistemas de modelos que usam a hibridização in situ como leitor de uma expressão genética.
Comece por imagem dos embriões in situ hibridização ou ISH manchados. Prepare uma solução de glicerol e misture-a para homogeneizar. Transfira os embriões para a solução de glicerol com uma pipeta Pasteur de três mililitros e deixe-os se contentarem por pelo menos cinco minutos.
Prepare e rotule tubos PCR suficientes para transferir os embriões manchados de ISH após a imagem, em seguida, use uma pipeta Pasteur de três mililitros para adicionar 100% glicerol ao fundo do poço de um slide de depressão de vidro. Transfira um único embrião manchado de ISH para o slide de vidro e oriente-o sob um microscópio estéreo equipado com uma câmera digital e iluminação inferior e superior. Utilizando o primeiro embrião, ajuste o tempo de iluminação e exposição na ampliação desejada.
Imagem quantos embriões necessários e rotule cada imagem com um número único. Após a imagem, transfira cada embrião para um tubo PCR rotulado com o mesmo número e, se necessário, aspire o excesso de glicerol dos tubos PCR. Para extrair o DNA, adicione 40 a 75 microliters de um tampão alcalino de lise, como o HoTSHOT, a cada tubo.
Incubar os tubos a 95 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos e depois esfriá-los a quatro graus Celsius. Adicione um volume igual de tampão de neutralização e proceda com genotipagem para a mutação de interesse. Para realizar a análise da imagem, selecione e abra a imagem em Fiji e inverta-a clicando em Editar e, em seguida, inverter, em seguida, converta o tipo de imagem em 8 bits clicando na guia Imagem, selecionando Tipo e selecionando 8 bits.
Selecione a ferramenta polígono e desenhe manualmente a região de interesse ou ROI na imagem ao redor da região que contém o sinal ISH a ser medido. Pressione T para abrir o Gerenciador de ROI e selecione a região de interesse e clique em Medir. Copie o valor médio da janela Resultados para uma planilha.
Para medir a intensidade de fundo, mova o ROI para uma região no embrião sem coloração e clique em Adicionar no Gerenciador de ROI. Selecione a região de fundo e clique em Medir e, em seguida, registo o valor médio de intensidade na planilha. Obtenha a intensidade média do pixel do sinal de hibridização NC2 subtraindo a intensidade média do fundo da região manchada.
Depois de determinar a intensidade média do pixel de cada amostra, atribua um genótipo a cada amostra. Se o genótipo não puder ser determinado, exclua a amostra da análise subsequente. Classifique os valores médios de intensidade da amostra de acordo com o genótipo e prossiga com testes estatísticos.
A utilidade desta técnica foi demonstrada no ISH para dnmt3bb. 1 em embriões de um runx1 heterozigoso incross. Uma diminuição no dnmt3bb.
1 expressão foi detectada em mutantes homozigos runx1, enquanto embriões heterozigos não apresentaram diferenças significativas no dnmt3bb. 1 expressão. Ao tentar determinar o efeito da mutação LMO4 na expressão runx1, esta análise não mostrou diferenças significativas na expressão entre tipo selvagem e mutantes imo4 homozigos.
No entanto, uma pequena diminuição na expressão runx1 foi detectada por um único embrião qPCR. Em cerca de 0,4% dos embriões sondados por Runx1, o ISH tinha um fundo alto que resultou em um número negativo quando foi subtraído do sinal. Nesses casos, os embriões foram excluídos da análise.
Quatro regiões diferentes nos embriões foram testadas para otimizar correções de fundo. Embora tenha havido uma diferença relativamente estável na intensidade do ROI em qualquer uma das áreas de fundo, o R3 sempre apresentou maior intensidade que o ROI e não deve ser usado para correção de fundo. R1 e R4 provaram ser as áreas mais apropriadas para correção de fundo.
É importante encontrar as melhores condições para a imagem e mantê-las inalteradas durante todo o experimento. Também recomendamos quantificar a intensidade do pixel antes de atribuir um genótipo a cada amostra.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para genotipagem paralela de embriões e quantificação de sinais de hibridização in situ em peixe-zebra. Ao utilizar esta abordagem isenta de viés, os pesquisadores podem alcançar maior precisão nas análises fenotípicas.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia do Desenvolvimento
Antecedentes
- As tecnologias de edição gênica facilitam a geração de mutantes de peixe-zebra.
- A hibridização in situ é um método comum para avaliar a expressão gênica.
- Métodos tradicionais de análise podem introduzir viés e subjetividade.
- Este estudo tem como objetivo fornecer uma abordagem mais consistente e quantitativa.
Objetivo do Estudo
- Para melhorar a precisão das análises fenotípicas em peixe-zebra.
- Fornecer um método padronizado para genotipagem de embriões.
- Para quantificar objetivamente os sinais de hibridização in situ.
Métodos Utilizados
- Imagem de embriões corados por HSI usando um microscópio estereoscópico.
- Preparação de soluções de glicerol para transferência de embriões.
- Uso de tampão de lise alcalina para extração de DNA.
- Utilização do software Fiji para análise e quantificação de imagens.
Resultados Principais
- Demonstrou uma diminuição na expressão de dnmt3bb.1 em mutantes homozigotos para runx1.
- Identificou áreas apropriadas de correção de fundo para análise de imagem.
- Mostrou ausência de diferenças significativas na expressão entre o tipo selvagem e mutantes homozigotos para lmo4.
- Forneceu um método confiável para atribuição de genótipos com base na intensidade dos pixels.
Conclusões
- O método aumenta a confiabilidade da análise de expressão gênica.
- Pode ser adaptado para uso em outros sistemas modelo.
- Mantém-se crucial a manutenção de condições de imagem consistentes para resultados precisos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A análise quantitativa de hibridização in situ reduz a subjetividade na avaliação da expressão gênica, melhorando a confiabilidade dos dados para a validação de alvos em modelos de peixe-zebra. Esta abordagem auxilia na desmistificação mecanicista ao permitir a correlação imparcial entre genótipo e padrões de expressão fenotípica. O método aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, fornecendo medições padronizadas e reproduzíveis em amostras com genótipos mistos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da quantificação imparcial de sinais de expressão gênica restritos espacialmente.
- Valor Operacional: Fornece um fluxo de trabalho consistente para comparar fenótipos mutantes e selvagens sem viés do observador.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir alterações significativas na expressão do ruído de fundo em modelos genéticos.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do Ensaio: Prepara sistemas biológicos validados para triagem de compostos em etapas subsequentes, estabelecendo perfis de expressão de referência.
- Reprodutibilidade: Padroniza protocolos de aquisição e análise de imagens para minimizar a variabilidade entre experimentos.
- Saída Quantitativa: Gera dados mensuráveis de intensidade de pixel adequados para comparação estatística entre grupos de tratamento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Mantém a consistência do descobrimento até a validação pré-clínica, utilizando leituras fenotípicas objetivas.
- Alinhamento de Biomarcadores: Facilita a correlação entre alterações na expressão gênica e o status genotípico para o desenvolvimento de biomarcadores translacionais.
- Decisões Ajustadas ao Risco: Permite decisões de avanço baseadas em dados, reduzindo falsos positivos em estudos de validação de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao vincular a confirmação genotípica à avaliação fenotípica quantitativa, apoiando a identificação de compostos líderes por meio da redução de riscos mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao fornecer dados quantitativos sobre a distribuição de mRNA para esclarecer a função gênica em vias de desenvolvimento.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio de condições reprodutíveis de imagem e análise para avaliação confiável de compostos.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de intensidade e valores subtraídos do fundo que permitem comparação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à continuidade pré-clínica, garantindo pontuação fenotípica consistente entre diferentes sistemas modelo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de genotipagem e quantificação aplicável a múltiplos genes e linhagens mutantes.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a ambiguidade mecanicista em dados de expressão gênica.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de protocolos padronizados de manipulação de embriões e análise de imagens.
- Valor Estratégico: Aprimora decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados objetivos para alocação de capital em programas de fase inicial.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao distinguir efeitos biológicos reais da variabilidade técnica.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manejo de embriões de peixe-zebra, microscopia e técnicas básicas de genotipagem.
- Depende de microscopia estereoscópica com capacidades de imagem digital e do software Fiji para análise.
- Necessita padronização entre equipes quanto às condições de imagem, tempos de exposição e regiões de correção de fundo.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes linhagens de peixe-zebra e estágios de desenvolvimento.
- Inclui limitações práticas, como a otimização da correção de fundo e a exclusão de amostras com genótipos indeterminados ou alto ruído de fundo.
