Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish
January 28th, 2020
As tecnologias de edição de genes permitiram que os pesquisadores gerassem mutantes de zebrafish para investigar a função genética com relativa facilidade. Aqui, fornecemos um guia para realizar genotipagem e quantificação de embriões paralelos em sinais de hibridização in situ em zebrafish. Essa abordagem imparcial proporciona maior precisão em análises fenotípicas baseadas na hibridização do situ.
As consequências das mutações na expressão genética são frequentemente avaliadas qualitativamente pela hibridização in situ e geralmente pontuadas visualmente, o que é subjetivo e tendencioso pelas expectativas do pesquisador. Este método fornece uma maneira mais consistente de comparar experimentos in situ quantificando intensidades de imagem e remove esse viés. Isso também pode ser facilmente adaptado a outros sistemas de modelos que usam a hibridização in situ como leitor de uma expressão genética.
Comece por imagem dos embriões in situ hibridização ou ISH manchados. Prepare uma solução de glicerol e misture-a para homogeneizar. Transfira os embriões para a solução de glicerol com uma pipeta Pasteur de três mililitros e deixe-os se contentarem por pelo menos cinco minutos.
Prepare e rotule tubos PCR suficientes para transferir os embriões manchados de ISH após a imagem, em seguida, use uma pipeta Pasteur de três mililitros para adicionar 100% glicerol ao fundo do poço de um slide de depressão de vidro. Transfira um único embrião manchado de ISH para o slide de vidro e oriente-o sob um microscópio estéreo equipado com uma câmera digital e iluminação inferior e superior. Utilizando o primeiro embrião, ajuste o tempo de iluminação e exposição na ampliação desejada.
Imagem quantos embriões necessários e rotule cada imagem com um número único. Após a imagem, transfira cada embrião para um tubo PCR rotulado com o mesmo número e, se necessário, aspire o excesso de glicerol dos tubos PCR. Para extrair o DNA, adicione 40 a 75 microliters de um tampão alcalino de lise, como o HoTSHOT, a cada tubo.
Incubar os tubos a 95 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos e depois esfriá-los a quatro graus Celsius. Adicione um volume igual de tampão de neutralização e proceda com genotipagem para a mutação de interesse. Para realizar a análise da imagem, selecione e abra a imagem em Fiji e inverta-a clicando em Editar e, em seguida, inverter, em seguida, converta o tipo de imagem em 8 bits clicando na guia Imagem, selecionando Tipo e selecionando 8 bits.
Selecione a ferramenta polígono e desenhe manualmente a região de interesse ou ROI na imagem ao redor da região que contém o sinal ISH a ser medido. Pressione T para abrir o Gerenciador de ROI e selecione a região de interesse e clique em Medir. Copie o valor médio da janela Resultados para uma planilha.
Para medir a intensidade de fundo, mova o ROI para uma região no embrião sem coloração e clique em Adicionar no Gerenciador de ROI. Selecione a região de fundo e clique em Medir e, em seguida, registo o valor médio de intensidade na planilha. Obtenha a intensidade média do pixel do sinal de hibridização NC2 subtraindo a intensidade média do fundo da região manchada.
Depois de determinar a intensidade média do pixel de cada amostra, atribua um genótipo a cada amostra. Se o genótipo não puder ser determinado, exclua a amostra da análise subsequente. Classifique os valores médios de intensidade da amostra de acordo com o genótipo e prossiga com testes estatísticos.
A utilidade desta técnica foi demonstrada no ISH para dnmt3bb. 1 em embriões de um runx1 heterozigoso incross. Uma diminuição no dnmt3bb.
1 expressão foi detectada em mutantes homozigos runx1, enquanto embriões heterozigos não apresentaram diferenças significativas no dnmt3bb. 1 expressão. Ao tentar determinar o efeito da mutação LMO4 na expressão runx1, esta análise não mostrou diferenças significativas na expressão entre tipo selvagem e mutantes imo4 homozigos.
No entanto, uma pequena diminuição na expressão runx1 foi detectada por um único embrião qPCR. Em cerca de 0,4% dos embriões sondados por Runx1, o ISH tinha um fundo alto que resultou em um número negativo quando foi subtraído do sinal. Nesses casos, os embriões foram excluídos da análise.
Quatro regiões diferentes nos embriões foram testadas para otimizar correções de fundo. Embora tenha havido uma diferença relativamente estável na intensidade do ROI em qualquer uma das áreas de fundo, o R3 sempre apresentou maior intensidade que o ROI e não deve ser usado para correção de fundo. R1 e R4 provaram ser as áreas mais apropriadas para correção de fundo.
É importante encontrar as melhores condições para a imagem e mantê-las inalteradas durante todo o experimento. Também recomendamos quantificar a intensidade do pixel antes de atribuir um genótipo a cada amostra.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método para genotipagem paralela de embriões e quantificação de sinais de hibridização in situ em peixe-zebra. Ao utilizar esta abordagem imparcial, os pesquisadores podem alcançar maior precisão em análises fenotípicas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Genética
- Biologia do Desenvolvimento
Fundo
- Tecnologias de edição de genes facilitam a geração de mutantes de peixe-zebra.
- A hibridização in situ é um método comum para avaliar a expressão gênica.
- Métodos tradicionais de pontuação podem introduzir viés e subjetividade.
- Este estudo visa fornecer uma abordagem mais consistente e quantitativa.
Propósito do Estudo
- Melhorar a precisão das análises fenotípicas em peixe-zebra.
- Fornecer um método padronizado para genotipagem de embriões.
- Quantificar sinais de hibridização in situ objetivamente.
Métodos Utilizados
- Imageamento de embriões corados ISH usando um microscópio estéreo.
- Preparação de soluções de glicerol para transferência de embriões.
- Uso de buffer de lise alcalina para extração de DNA.
- Emprego de software Fiji para análise e quantificação de imagens.
Principais Resultados
- Demonstrou uma diminuição na expressão de dnmt3bb.1 em mutantes homozigotos para runx1.
- Identificou áreas de correção de fundo apropriadas para análise de imagem.
- Mostrou nenhuma diferença significativa na expressão entre o tipo selvagem e mutantes homozigotos para lmo4.
- Forneceu um método confiável para atribuição de genótipos com base na intensidade de pixels.
Conclusões
- O método aumenta a confiabilidade da análise de expressão gênica.
- Pode ser adaptado para uso em outros sistemas modelo.
- Manter condições de imagem consistentes é crucial para resultados precisos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
