Name: Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a produzir hepatosferas 3D funcionais a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e livre de soro. Este método permite controlar o tamanho das esferas, limitando necrose e mantendo a funcionalidade hepática por longos períodos.

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Este estudo foi apoiado com prêmios da plataforma de medicina regenerativa do Reino Unido (MRC MR/L022974/1) e do escritório do cientista chefe (TCS/16/37).

1. preparação de moldes da microplaca do agarose
Nota: Os meios utilizados para estes experimentos devem ser estéreis e à temperatura ambiente (RT) para a cultura celular.
<ol><li>
Prepare 2% moldes de agarose.
	<ol>
<li>Dissolva 2 g de agarose de baixa temperatura de fusão em 100 mL de água destilada esterilizada. Aqueça com cuidado em um microondas com agitação do intervalo para dissolver completamente.</li>
		<li>Adicione 520 μL de agarose derretido a um molde de formato 256-well e deixe-o solidificar.</li>
		<li>Transfira cada microplaca do agarose em um único poço de uma placa de 12 poços.</li>
		<li>Adicione 1,5 mL de soro fisiológico com tampão fosfato de 1x Dulbecco (DPBS) com CA2 +/mg2 + para cada poço e retire as bolhas de ar dos micropoços introduzindo suavemente a pipetagem para cima e para baixo várias vezes utilizando uma ponta de pipeta P1000. Isso é realizado para garantir a semeadura de células uniformes. Nota: Os microplates do agarose podem ser armazenados por até 6 meses em 4 ° c em 1x DPBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. semeando células-tronco pluripotentes humanas em placas de micropoços de agarose
<ol><li>
Preparação da suspensão celular
	<ol>
<li>Aspirar o meio de uma cultura indiferenciada de hPSCs como descrito anteriormente8. Nota: os hpscs são cultivados em LN-521 em mTeSR1 com o meio mudado cada 24 h, e é regularmente uma vez que as pilhas alcangam 75% a 85% da confluência como descrito previamente8.</li>
		<li>Enxague as células com 5 mL de RT 1x DPBS sem CA2 +/mg2 + e retire o tampão.</li>
		<li>Adicionar 5 mL de reagente de dissociação de célula 1x (tabela de materiais) às células e permitir a dissociação celular por células incubantes a 37 ° c por 6-8 min. Nota: Para interromper a reação, examine o descolamento da célula o microscópio. As células devem ser parcialmente separadas da placa. Estenda a incubação por um extra de 1-2 min se for necessário mais tempo.</li>
		<li>Pare a reação removendo o reagente da dissociação da pilha e adicione 5 mL do meio mTeSR1 fresco suplementado com o inibidor Rho-associado da quinase de 10 μM (rocha) Y27632 às pilhas. Dissociar as células pipetando para cima e para baixo várias vezes usando uma ponta de pipeta P1000.</li>
		<li>Conte as células viáveis usando um hemocitômetro e a exclusão de coloração azul do Tripan. Depois disso, prepare a suspensão da célula na concentração requerida.</li>
		<li>Calcule o número total de células necessárias. Para a diferenciação do hepatosphere 3D, semente 3,84 x 105 pilhas por o microplate do agarose para gerar esferoides com o μm 100-150 no diâmetro.</li>
		<li>Transfira o número desejado de pilhas em um tubo de centrifugador estéril de 15 mL ou de 50 mL e Centrifugue o tubo em 200 x g por 5 minutos em RT para pellet as pilhas.</li>
		<li>Aspirar e descartar as células sobrenadantes e ressuscitará no meio mTeSR1 mais 10 μM de inibidor de rocha Y27632. Diluir o pellet celular no volume adequado de médio a uma concentração final de 2,1 x 106 células/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Semeando as células para as microplacas de agarose preparadas Nota: se estiver usando microplacas de agarose armazenadas em geladeira, coloque-as na incubadora de células a 37 ° c por pelo menos uma hora antes de usar e aspire o 1x DPBS do poço antes da semeadura da célula.<ol>
<li>Adicionar 190 μL da suspensão celular no micropoço de agarose.</li>
		<li>Após a semeadura, retorne as placas para a incubadora de células a 37 ° c e 5% CO2 para 2 h para permitir que as células se acomodem.</li>
		<li>Após 2 h, adicione 1 mL de meio mTeSR1 fresco e morno suplementado com o inibidor da rocha de 10 μM Y27632 a cada poço.</li>
		<li>Retorne as placas para a incubadora de células a 37 ° c e 5% CO2 por 24 h e examine a formação de esferas no dia seguinte para permitir que as células se fixem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. diferenciando hPSCs para Hepatoesferas 3D em micropoços de agarose
<ol><li>Preparação de Poços revestidos poli-2-hidroxietil metacrilato (poli-HEMA)
	<ol>
<li>Dissolver 2 g de poli-HEMA em 100 mL de etanol a 95%. Agitar a solução durante a noite usando uma placa quente em 55 ° c. Adicionar 250 μL de solução de poli-HEMA por poço de uma placa de 24 poços e secar durante a noite a 60 ° c usando um forno.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do meio de diferenciação
	<ol>
<li>Prepare uma solução de 1, 000x stock de activina humano a dissolvendo o activina humano uma proteína liofilizada na albumina de soro bovina estéril de 0,2% (BSA)/DPBS a uma concentração final de 100 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000.</li>
		<li>Prepare uma solução de 1, 000x stock de Wnt3a dissolvendo a proteína liofilizada do rato Wnt3a em 0,2% BSA/DPBS estéril a uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:200.</li>
		<li>Prepare uma solução de 1, 000x de fator de crescimento de hepatócitos humanos (HGF) dissolvendo a proteína liofilizada HGF humana em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000.</li>
		<li>Prepare uma solução de estoque de 1.000 x de oncostatina M (OSM) dissolvendo OSM em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 20 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000.</li>
		<li>Prepare uma solução de estoque de 1000x de fator de crescimento epitelial (EGF) dissolvendo a proteína liofilizada em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000.</li>
		<li>Prepare uma solução de 1, 000x de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) dissolvendo a proteína liofilizada em 0,2% BSA/DPBS estéril para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000.</li>
		<li>Prepare uma solução de 1, 000x de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) dissolvendo a proteína liofilizada em 0,2% de BSA/DPBS para uma concentração final de 10 μg/mL. Conservar a-20 ° c em pequenas alíquotas. Use em 1:1000.</li>
		<li>Faça meio de diferenciação endoderma consistindo de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) meio basal suplementado com 2% B27 suplemento (50x, sem insulina), e 1% penicilina/estreptomicina (concentrações finais: 100 UI/mL e 100 μg/mL, respectivamente). A menos que indicado, em cada mudança média, complemente o volume exigido com Wnt3a e activina a em uma concentração final de 50 ng/mL e 100 ng/mL, respectivamente. Nota: Conservar a 4 ° c e utilizar dentro de duas semanas.</li>
		<li>Faça meio de diferenciação hepatoblast consistindo de nocaute Dulbecco ' s modificado Eagle médio (KO-DMEM) com 20% nocaute soro substituto (KOSR) e suplementado com 0,5% de um suplemento alternativo para L-glutamina, 1% não-aminoácidos essenciais (NEAA), 0,1 mM beta-Mercaptoetanol, 1% dimetil sulfóxido (DMSO) e 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais de 100 UI/mL e 100 μg/mL, respetivamente). Filtro vácuo. Nota: Conservar a 4 ° c e utilizar dentro de duas semanas.</li>
		<li>Faça meio de maturação de hepatócitos constituído por meio de hepatócitos suplementado com 1% de um suplemento alternativo à L-glutamina, 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccinato de sal de sódio (HCC), 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 μg/mL, respetivamente). Para cada alteração média, completar o volume necessário com OSM e HGF (concentrações finais a 20 ng/mL e 10 ng/mL, respectivamente). Nota: Armazene o estoque a 4 ° c e use dentro de duas semanas.</li>
		<li>Faça meio de manutenção de hepatócitos consistindo de meio de William E suplementado com reposição sérica de nocaute de 10%, consistindo em 1% de um suplemento alternativo à L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 μg/mL, respectivamente). Para cada mudança média, complemente o volume necessário com HGF, EGF, bFGF e VEGF (concentração final de cada fator de crescimento a 10 ng/mL). Nota: Armazene o estoque a 4 ° c e use dentro de duas semanas.</li>
	</ol></li>
	<li>Verificar a formação da hepatofera 24 h após a semeadura e iniciar a diferenciação de hepatócitos. Retire cuidadosamente o meio mTeSR1 e substitua-o por 1 mL de meio de diferenciação de endoderma fresco suplementado com 100 ng/mL activina a e 50 ng/mL Wnt3a.</li>
	<li>Mude o meio de escorva suplementado do endoderme cada 24 h por 3 dias para hESCs. Ao trabalhar com hiPSCs, estenda este estágio por mais 2 dias completando a mídia com activina a (100ng/mL) sozinho.</li>
	<li>Após a indução definitiva do endoderma, mude para o meio de diferenciação hepatoblast para a especificação do hepatoblast por 5 dias substituindo o meio a cada 2 dias e realize a última alteração no último dia da especificação do hepatoblast.</li>
	<li>Transfira hepatoferas para os Poços revestidos de poli-HEMA.
	<ol>
<li>Lave as células uma vez com meio de maturação de hepatócitos sem suplementos após a remoção do meio KSR/DMSO e adicione 1 mL de meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 ng/mL de HGF e 20 ng/mL de OSM.</li>
		<li>Usando uma pipeta P1000, levante as hepatoferas da microplaca do agarose introduzindo uma pipetagem para cima e para baixo a solução várias vezes.</li>
		<li>Transfira o meio que contem os hepatospheres a um poli-HEMA revestido bem.</li>
		<li>Lave a microplaca de agarose usando 1 mL de meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 ng/mL de HGF e 20 ng/mL de OSM e transfira o meio para o poço revestido de poli-HEMA.</li>
		<li>Repita a etapa 3.6.4 tantas como vezes como possível a fim transferir todos os hepatospheres do microplate do agarose. Nota: É crítico para pipeta com cuidado acima e para baixo a solução que contem os hepatospheres para evitar danificá-los.</li>
	</ol></li>
	<li>Aspirar com cuidado o meio excedente sem remover hepatospheres usando uma pipeta P100 até que ~ 1 mL do meio que contem os hepatspheres remanescem no poço poli-HEMA revestido.</li>
	<li>Mude o meio cada 48 h por 12 dias.</li>
	<li>No dia 20, ao trabalhar com hESCs ou dia 22, se trabalhar com hiPSCs, alterne o meio para o meio de manutenção de hepatócitos.
	<ol>
<li>Remova o meio de maturação de hepatócitos e lave as células uma vez com meio de manutenção de hepatócitos sem os suplementos. Adicionar 1 mL de meio de manutenção de hepatócitos suplementado com 10 ng/mL de HGF, EGF, FGF e VEGF.</li>
	</ol></li>
	<li>Mude o meio para o meio fresco da manutenção do hepatócito cada 48 h.</li>
</ol>4. análise funcional de longo-prazo cultivadas 3D Hepatoferas
<ol><li>Mudar para o meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 μM de HCC, L-glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina (concentrações finais em 100 UI/mL e 100 μg/mL, respectivamente) e 10 ng/mL HGF 48 h antes da realização da análise funcional.</li>
	<li>
Analise a função metabólica de hepatócitos usando os ensaios do citocromo (CYP) P450.
	<ol>
<li>Substitua o meio com 1 mL de meio de maturação de hepatócitos fresco suplementado com substrato de 50 μM de luciferina-6 '-pentafluoro-benzílico (luciferina-PFBE) para detectar a atividade basal do CYP3A ou substrato de 100 μM luciferina-metil éter (luciferina-ME) para detectar CYP1A2 atividade basal (número de repetições = 3). Use meios de cultura de tecido como um controle negativo. Nota: A fim de evitar a reatividade cruzada, recomenda-se não usar os mesmos poços contendo hepatesferas 3D para testar diferentes atividades do CYP P450, mas para realizá-las em poços individuais.</li>
		<li>Incubar células por 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Colete os sobrenadantes usando uma ponta de pipeta P100 e realize o ensaio de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Medir os níveis relativos de atividade basal e normalizar a proteína por mg, conforme determinado pelo ensaio de ácido bicinchoninico (BCA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Teste a produção de proteínas séricas utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA).
	<ol>
<li>Substitua o meio com 1 mL de meio de maturação de hepatócitos fresco suplementado com 10 ng/mL de HGF e 20 ng/mL de OSM (número de repetições = 3). Use meios de cultura de tecido como um controle negativo.</li>
		<li>Incubar células por 24 h a 37 ° C.</li>
		<li>Colete o sobrenadante usando uma ponta de pipeta P100 e meça os níveis relativos de produção de proteínas séricas de acordo com as instruções do fabricante.</li>
		<li>Normalize a por a proteína do magnésio como determinada pelo ensaio de BCA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Immunocytochemistry
<ol><li>
Preparação de secções de parafina contendo hepatesferas.
	<ol>
<li>Lave as hepatoferas três vezes com 1x DPBS.</li>
		<li>Fixar as hepatoferas com metanol gelado por 30 min.</li>
		<li>Lave três vezes com 1x DPBS.</li>
		<li>Incorpore os hepatospheres em 300 μL de uma solução moderada do agarose de 2% dissolvido em H2o usando um poço vazio de uma placa de 24 poços como um molde e deixe-a solidificar por 30 minutos.</li>
		<li>Incorpore o agarose que contem hepatospheres na parafina.</li>
		<li>Seção o bloco de parafina contendo hepatoesferas fixas em 4 μm de espessura seções usando um micrótomo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De-depilação e reidratação das secções. Nota: utilize soluções frescas sempre que possível. Não utilize soluções que tenham estado na calha de coloração durante mais de uma semana.<ol>
<li>Coloque seções em um rack de slides.</li>
		<li>Mergulhe a cremalheira de corrediça que contem seções em uma calha de mancha que contem 300 ml do xileno por 5 minutos.</li>
		<li>Repita o passo 5.2.2.</li>
		<li>Mergulhe em etanol absoluto por 20 s.</li>
		<li>Mergulhe em 95% de etanol por 20 s.</li>
		<li>Mergulhe em 90% de etanol por 20 s.</li>
		<li>Mergulhe em 80% de etanol por 20 s.</li>
		<li>Mergulhe em 70% de etanol por 20 s.</li>
		<li>Rehidrate as secções com água durante 5 min. Nota: Mantenha os slides no mesmo rack de slides e mova-o de uma calha de coloração para a próxima. O volume usado (geralmente ~ 300 mL) depende do tamanho da calha de coloração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperação do antígeno de seções da parafina que contêm hepatospheres.
	<ol>
<li>Calor de-encerado e rehidratado seções em 1x Tris-EDTA (TE) pH 9,0 solução tampão para 15 min em um microondas em 800 W.</li>
		<li>Arrefecer as amostras mergultando-as na água da torneira durante 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining.
	<ol>
<li>Incubar lâminas com solução de bloqueio feita de PBS com 0,1% de polissorbato 20 (PBS/T)/10% BSA para 1 h at RT.</li>
		<li>Substitua a solução de bloqueio pelo anticorpo primário apropriado diluído em PBS/T/1% BSA e incubar a 4 ° c com agitação suave durante a noite.</li>
		<li>Lave as células com PBS/T durante 5 min e repita três vezes.</li>
		<li>Incubar com o anticorpo secundário apropriado diluído em PBS/T/1% BSA e incubar no escuro em RT para 1 h com agitação delicada. Nota: Os anticorpos primários e secundários otimizados estão listados na tabela de materiais.</li>
		<li>Lave as células com PBS/T durante 5 min e repita três vezes.</li>
		<li>Adicionar 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para as células de acordo com as instruções do fabricante e coloque uma lamínula de vidro suavemente para reduzir as bolhas de ar. Mantenha as células fixas a 4 ° c no escuro. Observe a coloração um microscópio com filtro apropriado e lâmpada fluorescente. Nota: armazene as placas em 4 ° c no escuro até a imagem latente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+and+Reproducible+Production+of+Liver+Buds+Entirely+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massive and Reproducible Production of Liver Buds Entirely from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).</li>
</ol>

David C. Hay é co-fundador e acionista da Stemnovate Ltd e Higherbifes Ltd. O restante dos autores certifica que eles não têm conflitos de interesse no assunto ou materiais discutidos neste artigo.

O desenvolvimento de sistemas definidos e sem Xeno para produzir hepatoferas humanas em 3D é necessário tanto para empreendimentos in vitro como in vivo. Presentemente a maioria de aproximações da diferenciação do hepatócito das pilhas de haste pluripotentes humanas são executadas em culturas aderentes bidimensionais. Estes ambientes faltam muitas das indicações ambientais envolvidas na gênese e na homeostase do tecido que incluem; interações de células heterotípicas, produção matricial e remodelação, resultando em má tradução para a biologia in vivo18,19.
Como resultado, a pesquisa se concentrou em abordagens alternativas para gerar hepatoesferas de células-tronco pluripotentes. Um número de estudos 3D avançou o campo, mas aqueles são dependentes em produtos animais20,22,24 para fornecer o apoio e/ou exigir o uso do tecido humano21,22 que complica tecnologia e compromete a reprodutibilidade experimental e a aplicação.
O procedimento descrito em nosso artigo (Figura 1) é definido, eficiente, altamente reprodutível e rentável, permitindo a produção de esferas funcionais do fígado, que permanecem funcionais durante um ano in vitro e fornecem o apoio crítico do fígado em vivo14. Importante, esta plataforma permite que o usuário controle o tamanho das esferas do fígado 3D, limitando a formação de centros Necrotic densos e a perda de phenotype.
A transferência das hepatesferas 3D para as placas revestidas de poli-HEMA representa um passo crítico neste protocolo. É importante pipeta delicadamente nesta fase no procedimento para evitar danificar a esfera. Além disso, as mudanças de mídia devem ser realizadas cuidadosamente para evitar o estresse de cisalhamento e distorção da estrutura da esfera.
Nesses estudos, as hepatoferas 3D apresentavam estrutura organizada (figura2 e Figura 3), função do citocromo P450 (Figura 4) e proteínas hepáticas secretadas, incluindo albumina e alfa-fetoproteína (Figura 5). Este procedimento foi executado com sucesso em quatro linhas pluripotentes das pilhas de haste com resultados comparáveis. Olhando adiante, esta tecnologia poderia ser empregada como uma plataforma para desenvolver uns tecidos endodermal e mesenquimais mais adicionais com arquiteturas complexas.

A capacidade de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) para autorenovar, mantendo a pluripotência, proporciona uma oportunidade para produzir tipos de células humanas e tecidos demanda. os hpscs foram eficientemente diferenciados em células de hepatócitos (hlcs) usando sistemas de cultura aderentes (2D) bidimensionais1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Estes sistemas têm sido utilizados para modelar com sucesso a doença monogênica, ciclo de vida do vírus, lesão hepática induzida por drogas (Díli), exposição fetal a toxinas e doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)11,12,13 ,14,15. No entanto, esses modelos possuem algumas desvantagens, que limitam seu uso rotineiro. Aqueles incluem a expressão fetal do marcador, o phenotype instável e a arquitetura pobre do tecido16,17,18,19, que poderia igualmente limitar a extrapolação à função do órgão in vivo.
Para superar essas limitações, as plataformas de diferenciação tridimensional (3D) foram desenvolvidas para imitar a arquitetura tecidual in vivo. Embora habilitando, essas abordagens dependem do uso de produtos e matrizes de origem animal para conduzir a gênese do tecido20,21,22, limitando a escala-acima e aplicação generalizada.
Aqui, detalhamos procedimentos para gerar grandes quantidades de hepatesferas 3D de hPSCs usando materiais definidos e automontagem de células. Notavelmente, o tecido gerado pelo nosso procedimento permanece funcional por mais de um ano na cultura celular e é capaz de suportar a função hepática in vivo23.
Em resumo, nossa aproximação definida da diferenciação permite a geração de hepatospheres humanos estáveis das pilhas de haste embrionárias humanas (hESCs) e das pilhas de haste pluripotentes induzidas (iPSCs). Acreditamos que o procedimento descrito representa um avanço significativo na geração de hepatoesferas 3D para pesquisa científica básica e aplicada.

<table><tbody><tr><td><forte>Cultura celular e ensaios funcionais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>10766834</td><td></td></tr><tr><td>suplemento B27&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2058&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14190250</tr><tr><td>DPBS com Cálcio e Magnésio</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td></td><td></td>14040133</tr><tr><td>Reagente de dissociação celular suave</td><td>STEMCELL Technologies&nbsp;</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>17705021</td><td></td></tr><tr><td>Ativista Humana A&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Fetoproteína Alfa Humana ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Fibrobaslt Básico Humano</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Gropwth Epitelial Humano</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento de Hepatócitos Humanos</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Oncostatina Humana M&nbsp;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Laminina Recombinante Humana 521&nbsp;</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Sérica Humana ELISA</td><td>Alpha Diagnostics</td><td>1190</td><td></td></tr><tr><td>Fator de Crescimento Vascular Humano</td><td>Bio-techne</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal de sódio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Substituição de Soro Knockout&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>Esferoides de micro-molde&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>Z764000</tr><tr><td>mTeSR1 médio&nbsp;</td><td>Tecnologias STEMCELL&nbsp;</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Sistema de Ensaio e Triagem</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Sistema de Ensaio e Triagem</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>poli-HEMA (poli 2-hidroxietil metacrilato)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Mouse recombinante Wnt3a&nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida&nbsp;</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microondas</td><td>Bosch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leika</td><td>RM2125RT</td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Termocientífico</td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Anticorpos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Anticorpos primários</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A6684&nbsp;</td><td>1:100 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>Universidade de Dundee</td><td>Universidade de Dundee</td><td>1:200 (ovelhas)</td></tr><tr><td>E-caderina</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (camundongo)</td></tr><tr><td>HNF-4&alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:100 (coelho)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td>X0943</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td>1:100 (ovelhas)</td></tr></tbody></table>

produção livre de soro de hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

O desenvolvimento de fontes renováveis de tecido hepático é necessário para melhorar a modelagem baseada em células e desenvolver tecido humano para transplante. Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) representam fontes promissoras de esferas hepáticas humanas. Nós desenvolvemos um método livre e definido do soro da diferenciação celular para gerar as esferas humanas tridimensionais do fígado dadas forma das pilhas de haste pluripotentes humanas. Uma limitação potencial da tecnologia é a produção de esferas densas com material inoperante para dentro. A fim de contornar isso, temos empregado tecnologia de micropoços de agarose em densidades de células definidas para controlar o tamanho das esferas 3D, impedindo a geração de núcleos apoptóticos e/ou necróticos.  Notavelmente, as esferas geradas por nossa abordagem exibem a função hepática e o fenótipo estável, representando um recurso valioso para a pesquisa científica básica e aplicada. Nós acreditamos que nossa aproximação poderia ser usada como uma tecnologia da plataforma para desenvolver uns tecidos mais adicionais para modelar e tratar a doença humana e no futuro pode permitir a geração de tecido humano com arquitetura complexa do tecido.

Agregados tridimensionais da linha de células-tronco embrionárias (H9) ou da linha de células-tronco pluripotentes induzidas (P106) foram diferenciados para a linhagem de hepatócitos utilizando nosso procedimento definido (Figura 1). As pilhas de haste pluripotentes foram aprontado primeiramente para o endoderme definitivo antes da especificação do hepatoblast. Depois disso, os hepatoblastos foram amadurecidos em hepatoesferas 3D que poderiam ser mantidas na cultura por até um ano23.
Para estudar a estrutura das esferas 3D, foram fixadas as esferas de 30 dias de hESC ou iPSC, seccionadas e coradas para detectar a presença de proteínas expressas em hepatócitos e células mesenquimais. Foram utilizados o fator nuclear de hepatócitos 4 alfa (HNF4α) e o marcador mesenquimais vimentina, revelando a presença de uma camada externa composta por células hepatócito em torno de um núcleo de células mesenquimais (Figura 2). Seguimos esses experimentos analisando a expressão de proteínas expressas em hepatócitos: albumina, CYP3A e e-caderina. A imunocoloração revelou que a expressão dessas proteínas foi restrita à camada externa das esferas (Figura 3).
As análises funcionais das hepatoferas foram realizadas no dia 30 culturas. O CYP1A2 e o CYP3A são enzimas importantes dentro dos hepatócitos funcionais. Sua atividade foi avaliada por meio de ensaios estabelecidos. As hepatesferas derivadas de H9 exibiram atividade do CYP3A de 220.375 ± 74514 proteína RLU/mL/mg e atividade do CYP1A2 de 732.440 ± 33.330 proteína RLU/mL/mg (Figura 4A). A atividade do CYP3A em hepatesferas derivadas de P106 foi de 132117 ± 43.391 proteína RLU/mL/mg e a atividade do CYP1A2 foi de 409.907 ± 121.723 RLU/mL/mg de proteína (Figura 4B). Quando comparado com dois lotes de hepatócitos primários humanos, as esferas do fígado 3D apresentavam níveis respeitáveis de atividade do CYP10.
A análise da síntese e secreção de albumina e alfa-fetoproteína (AFP) revelaram que as hepatesferas derivadas de H9 secretaram 683,9 ± 84 e 159 ± 20 ng/mL/24 h/mg de proteína de albumina e alfa-fetoproteína, respectivamente (Figura 5A). Considerando que as hepatesferas derivadas de P106 secretaram 497 ± 41 e 756 ± 24 ng/mL/24 h/mg de proteína de albumina e alfa-fetoproteína, respectivamente (Figura 5B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig1.jpg"> Figura 1 : Procedimento de diferenciação Stepwise para gerar hepatoesferas 3D de hESCs. Os suportes azuis representam dias de diferenciação para hiPSCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig2.jpg"> Figura 2 : Reorganização estrutural de hepatoesferas 3D. Imagens representativas da expressão de hepatócitos nucleares de fator 4 alfa (HNF4α-verde) e vimentina (vermelho) em (A) hepatoesferas 3D derivadas de H9 e (B) hepatoesferas 3D derivadas de P106 e seus correspondentes controles de imunoglobulina G (IgG) . As barras de escala representam 60 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig3.jpg"> Figura 3 : Avaliação da expressão de marcadores hepáticos em hepatesferas 3D. Imagens representativas da expressão de marcadores de hepatócitos-albumina, CYP3A, e-caderina e seus correspondentes controles de IgG em hepatoferas 3D derivadas de (a) H9-e (B) P106. Barras de escala = 60 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig4.jpg"> Figura 4 : Função do citocromo P450 em hepatoesferas 3D. Medição da atividade do citocromo P450 1A2 e 3A em (a) hepatoesferas 3D derivadas de H9 e (B) hepatesferas 3D derivadas de P106. Os dados representam a média de três repetições biológicas, e as barras de erro constituem o desvio padrão (DP). A atividade é citada como unidades de luz relativa (RLU) por mL por mg de proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59965/59965fig5.jpg"> Figura 5 : Análise da secreção de proteínas hepatosphere. A secreção de albumina e alfa-fetoproteína (AFP) foi analisada em (A) hepatoesferas 3D derivadas de H9 e (B) hepatesferas 3D derivadas de P106. Os dados são representativos de três repetições biológicas, e as barras de erro representam o SD. a proteína secretada é citada como nanogramas de proteína por mL por 24 h por mg de proteína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59965/59965fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este protocolo descreve uma aproximação para produzir hepatospheres das pilhas de haste pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e um self-assembly da pilha. Este protocolo é reprodutível em um número de linhas de pilha, cost-effective e permite a produção de hepatospheres humanos estáveis para a aplicação biomédica.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Esta metogenética grande quantidade de hepatosferas 3D de células-tronco pluripotentes humanas usando os materiais finos e células de montagem. O principal avanço dessa técnica é que permite controlar o tamanho das esferas hepáticas 3D, limitando a formação de centros necroses e perda de fenótipo. Demonstrando o procedimento comigo será Yu Wang, um pós-doutorado em nosso laboratório.Prepare-se para apresentar moldes de ágarose dissolvendo dois gramas de baixa temperatura de fusão em 100 mililitros de água esterilizada destilada. Aqueça cuidadosamente a mistura no micro-ondas com o intervalo tremendo para dissolver completamente a agarose. Adicione 520 microliters da agarose derretida a um molde de 256 bem formato e permita que ele solidifique.Em seguida, transfira cada microplacão agarose em um único poço de uma placa de 12 poços. Adicione 1,5 mililitros de DPBS com cálcio e magnésio a cada poço e pipeta para cima e para baixo para remover bolhas. Para preparar a suspensão celular, comece aspirando o meio a partir de uma cultura indiferenciada de células-tronco pluripotentes humanas, ou HPSCs.Enxágüe as células adicionando cinco mililitros de DPBS de temperatura ambiente, cálcio ou magnésio livre e, em seguida, remova o buffer. Adicione cinco mililitros de reagente de dissociação celular às células e incubar a 37 graus Celsius por seis a oito minutos. Observe o desprendimento celular sob um microscópio e estenda a incubação por mais um ou dois minutos, se necessário.Pare a reação removendo o reagente de dissociação celular e adicionando cinco mililitros de MT fresco servem um meio complementado com 10 inibidores de rocha micromolar, Y27632. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para dissociar células. Conte as células viáveis com o hemótmetro e a coloração azul trypan, a fim de calcular o número total de células necessárias.Transfira o número desejado de células para um tubo de centrífuga estéril de 15 ou 50 mililitros e centrífuga a 200 vezes G por cinco minutos para decarar as células. Descarte o supernascer e suspenda derreta as células em MT servem um meio com 10 inibidores de rochas micromolar para uma concentração final de 2,1 milhões de células por mililitro. Em seguida, salve as células adicionando 190 microlitadores de suspensão celular preparada por micro poço de ágarose e incubando as micro placas agarose a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono por duas horas.Após a incubação, adicione um mililitro de fresco, quente, T-serve um meio com inibidor de rocha para cada poço. Devolva as placas para a incubadora e deixe-as lá por 24 horas. No dia seguinte, examine a esfera de formação.Prepare os poços revestidos de hidroxilatil poli-dois ou poli-hema dissolvendo dois gramas de polímola em 100 mililitros de 95% de etanol e agitando a solução durante a noite em uma placa quente de 55 graus Celsius. No dia seguinte, adicione 250 microliters da solução a cada poço de uma placa de 24 poços e seque a placa durante a noite em um forno de 60 graus Celsius. Inicie a diferenciação do hepatocito removendo cuidadosamente o MT para servir um meio das células anteriormente semeadas e substituindo-o por um mililitro de meio de diferenciação de endoderme fresco.Para células-tronco embrionárias humanas, atualize o meio a cada 24 horas durante três dias. É importante iniciar a diferenciação hepatocito 24 horas após a semeadura para evitar a diferenciação celular espontânea. Após indução definitiva do endódermo, troque o meio de diferenciação de hepatoblast por cinco dias.Substitua o meio a cada dois dias, realizando a última alteração no último dia de especificação hepatoblasto. Para transferir as hepatoferas para os poços revestidos de polímatio preparados, lave as células com meio de maturação hepatócida e, em seguida, adicione um mililitro do médio suplementado com 10 nanogramas por mililitro HGF e 20 nanogramas por MILilitro OSM. Pipetar a solução várias vezes para levantar as hepatosferas da micro placa agarose e transferi-las para um políquema revestido bem.Lave a micro placa agarose com um mililitro do meio de maturação hepatocitada suplementada e transfira bem o meio para o políquema revestido. Usando uma pipeta P-100, aspire cuidadosamente o excesso de meio sem remover hepatosferas até que haja cerca de um mililitro de médio esquerda no poço. Atualize o meio a cada 48 horas durante 12 dias.Se trabalhar com células-tronco embrionárias, troque o meio de manutenção de hepatócitos no dia 20, removendo o meio de maturação, lavando as células com meio de manutenção e, em seguida, adicionando um mililitro de meio de manutenção suplementada. Depois disso, refresque o meio a cada 48 horas. Mudanças imediatas devem ser realizadas cuidadosamente para evitar estresse grave e distorção desta estrutura esférica.A coloração para hepatócito em marcadores mesenquimais revela que as hepatosferas formadas usando esta técnica são compostas de células semelhantes a hepatócitos em torno de um núcleo de células mesenquimais. Outras proteínas tipicamente expressas em hepatócitos também são encontradas na camada externa das esferas. A análise funcional das enzimas citocromáticas P450 ou CYP em culturas de hepatosfera de 30 dias mostrou que as esferas 3D apresentam níveis respeitáveis de atividade CYP em comparação com hepatócitos primários humanos.Além disso, pode-se demonstrar que as hepatosferas secretam proteínas hepáticas como Albumina e alfa-fetoproteína. A coisa mais importante a ser lembrada para este protocolo é gentilmente pipeta para cima e para baixo a solução contendo hepatosferas 3D ao transferi-las para a placa revestida de políquema. Isso ajuda a evitar danificá-los.Uma vez dominada, essa metodologia permite a geração de esferas hepáticas 3D que permanecem funcionais ao longo de um ano in vitro com múltiplas aplicações em modelagem de falecidos e triagem de medicamentos. Olhando para o futuro, essa tecnologia poderia ser empregada como uma plataforma para desenvolver tecidos entodérmicos e mesenquimais com arquiteturas complexas.

serum-free-production-three-dimensional-human-hepatospheres-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo incidirá sobre a geração de endoderme hepática humana de populações humanas de células-tronco embrionárias.

Geração robusto de Hepatócito-like Células de populações humanas células-tronco embrionárias

O método aqui apresentado descreve um sistema de diferenciação -Ready escalável e boas práticas de fabrico (BPF) para gerar células de hepatócitos-like humanos a partir de células-tronco pluripotentes. Ele serve como um sistema eficaz e padronizado para gerar células de hepatócitos-like humanos para a pesquisa básica e aplicada fígado humano.

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Aqui, relatamos um protocolo para desenvolver um sistema tridimensional (3-D) a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) chamado corpo embrionóide sem soro (SFEB). Este modelo 3-D pode ser usado como uma cultura de fatia organotípica para modelar o desenvolvimento cortical humano e para a interrogação fisiológica do desenvolvimento de circuitos neurais.

Desenvolvimento de corpos de embrióide livres de soro derivado de HiPSC para a interrogação de culturas de células estaminais 3-D usando ensaios relevantes para o fisiologismo

O protocolo aqui apresentado descreve uma plataforma para a identificação de moléculas pequenas para o tratamento de doença hepática. Apresenta-se uma descrição passo a passo detalhando como diferenciar iPSCs em células com características de hepatócitos em placas de 96 poços, para usar as células para a tela para pequenas moléculas com potencial atividade terapêutica.

Usar humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas hepatócitos células para descoberta de drogas

Este protocolo descreve uma abordagem semi-automática para produzir células hepatócito de células-tronco pluripotentes humanas em um formato de 96 placa bem. Este processo é rápida e econômica, permitindo que a produção de qualidade assegurada lotes de hepatócitos células para pesquisa humana básica e aplicada.

Produção semi-automática do hepatócito como células de células-tronco pluripotentes

Este protocolo detalha um monolayer, método soro-livre para gerar eficientemente Hepatocyte-como pilhas das pilhas de haste pluripotentes humanas (hPSCs) em 18 dias. Isto implica seis etapas como hPSCs se diferenciam seqüencialmente em tipos de células intermediárias, como a raia primitiva, endoderma definitivo, foregut posterior e progenitores de broto hepático antes de formar células como hepatócitos.

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

O objetivo deste artigo é fornecer uma abordagem padronizada para induzir a diferenciação de progenitor hepático humano das células-tronco pluripotentes. O desenvolvimento deste procedimento com formulações de mídia prontas para uso oferece ao usuário um sistema fácil de gerar células hepáticas humanas para pesquisa biomédica e tradução.

Especificação progenitora hepática de células-tronco pluripotentes usando um sistema de diferenciação definido

Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).

Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas

Aqui apresentamos um método não genético para gerar esferoides hepáticos autólogos humanos usando células mononucleares isoladas do sangue periférico em estado estacionário.

Esferoides do fígado humano do sangue periférico para estudos de doença hepática

Este protocolo descreve a geração de organoides hepáticos endodérmicos rápidos e reprodutíveis (eHEPOs). Com este protocolo, os eHEPOs podem ser produzidos em 2 semanas e expandir a longo prazo (mais de 1 ano) sem perder sua diferenciação e funcionalidade.

Geração de Organoides Hepáticos Endodérmicos Funcionais

Aprenda a produzir hepatosferas 3D funcionais a partir de células-tronco pluripotentes humanas usando um sistema de cultura definido e livre de soro. Este método permite controlar o tamanho das esferas, limitando necrose e mantendo a funcionalidade hepática por longos períodos.

Produção livre de soro de Hepatesferas humanas tridimensionais de células-tronco pluripotentes

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