Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Este protocolo é aplicável a uma ampla gama de projetos de triagem destinados ao desenvolvimento de inibidores de ATPase, seja como sondas para pesquisa básica ou para potenciais compostos clínicos. Este método foi otimizado para aplicativos de triagem semi-high-throughput. Também foi projetado para evitar vários artefatos comuns e não requer o manuseio de materiais perigosos.

Em nosso laboratório temos usado este ensaio para desenvolver novos e específicos inibidores de minodã não muscular II para o tratamento da desordem de uso de metanfetamina. Em teoria, este método pode ser facilmente aplicado a qualquer enzima que produz ATP. A demonstração visual ajuda a esclarecer todos os detalhes técnicos importantes.

Para começar, prepare 4.500 microliters de 20 soluções de actina diluída de micromolar para cada microplato de poliestireno preto de 384 poços diluindo a solução concentrada de estoque de actina no buffer de actina. Misture a solução completamente, pipetando para cima e para baixo 30 vezes para quebrar filamentos de actina para reduzir a viscosidade e a heterogeneidade. Em seguida, centrifufique a solução para remover qualquer proteína precipitada presente.

Transfira cuidadosamente o supernatante para um tubo de centrífuga limpo. Prepare a mistura de enzimas mestres em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros para cada placa de ensaio, combinando 3.252,9 microliters de tampão de miosina para o ensaio envolvendo myosina muscular esquelética II, 171,4 microliters de solução LDH e 171,4 microliters de solução PK. Prepare a mistura de substrato mestre em um tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros para cada placa, combinando 162,1 microliters de ATP, 162,1 microliters de PEP e 324,1 microliters de solução NADH.

Não adicione actina neste momento para evitar agregação e precipitação. Para criar diluições serial de sete etapas de NADH para calibração, prepare oito tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro. Misture 12,3 microliters de solução de estoque NADH com 257,7 microliters de tampão de minosina no primeiro tubo para fazer uma solução de 250 micromolar.

Em seguida, alíquota de 135 microliters de tampão de miosina em cada um dos sete tubos restantes. Transfira 135 microliters da solução do primeiro tubo para o segundo e misture por pipetação. Repita até chegar ao sétimo tubo.

Use o último tubo como controle no-NADH apenas com buffer. Inclua sempre controles positivos e negativos em placas compostas e diluições NADH para calibração em placas de ensaio. Esses controles são extremamente importantes para identificar artefatos durante a análise de dados.

Usando uma pipeta de oito canais, transfira 20 microliters das soluções de calibração NADH para a primeira linha em triplicados em uma placa de ensaio. Agora adicione 4,2 microliters de minosina muscular esquelética II à mistura de enzimas. Vórtice brevemente.

Adicione a miosina à mistura de enzimas antes de dispensar. A longa incubação de soluções de minosina diluída pode resultar em perda de atividade devido à precipitação e vinculação inespecífica a superfícies plásticas. Carregue a mistura de enzimas de miosina preparada em um dos recipientes de amostra de um distribuidor automático.

Na placa, exceto na primeira linha, distribua 8,4 microliters da enzima myosin mistura em cada poço da placa de ensaio. Em seguida, coloque a placa de ensaio e a placa composta sobre os posicionadores de labware de um sistema automatizado de manuseio líquido que é equipado com uma cabeça de ferramenta de pino de 100 nanoliter. Em seguida, execute o método apropriado no software para transferir 100 nanoliters de soluções da placa composta preparada para a placa de ensaio.

Em seguida, coloque a placa de ensaio em um agitador de microplacos para agitar por um minuto à temperatura ambiente a 1.200 rpm. Adicione 4.052 microliters da solução de actina centrifugada à mistura de substrato e vórtice brevemente. Para iniciar a reação enzimática, dispense 11,6 microliters de mistura de substrato actin em cada poço da placa de ensaio usando um dispensador automático, exceto a primeira linha.

Em um agitador de microplacos, agite a placa de ensaio por um minuto à temperatura ambiente a 1.200 rpm. Centrifugar a placa de ensaio a 101 vezes g por 30 segundos. Use um filtro de excitação de largura de banda de 380 nanômetros, 10 nanômetros e 470 nanômetros, filtro de emissão de largura de banda de 24 nanômetros em conjunto com o espelhodicrómico de corte de 425 nanômetros para os ensaios.

Otimize o número de flashes, ganho de detector, dimensões da placa e altura de medição antes de executar os ensaios. Execute a medição em modo de alta concentração. Certifique-se de que a temperatura interna do leitor de placas estabilizou a 25 graus Celsius.

Coloque a placa no leitor da placa e agite por mais 30 segundos para tornar a forma da superfície líquida semelhante em cada poço e permitir que a placa atinja a temperatura de medição. Escaneie a placa em intervalos de 45 segundos e grave fluorescência NADH por 30 minutos. Com os dados exportados, plote a intensidade observada de fluorescência contra o tempo para cada poço.

Realize uma regressão linear simples para determinar a inclinação e interceptação das respostas de fluorescência para cada poço. A inclinação é proporcional à taxa de consumo naDH que pode ser usada como uma aproximação muito boa da taxa de consumo ATP. A interceptação é proporcional à concentração de NADH no início da medição.

Em seguida, construa uma curva de calibração para NADH plotando as interceptações obtidas para a primeira linha da placa contra a concentração de NADH. As interceptações estimam as intensidades reais de fluorescência no início com muito mais confiança do que a média da intensidade de fluorescência bruta lê no início. Realize uma regressão linear simples para obter a inclinação e interceptação da linha de calibração NADH.

Aqui, as interceptações descrevem o sinal de fundo de fluorescência sem o presente naDH, enquanto a inclinação corresponde à intensidade de fluorescência teórica extrapolada de uma solução naDH molar. Para converter as alterações de fluorescência às taxas de consumo atp dividem a inclinação da resposta de fluorescência obtida para o resto dos poços pela inclinação da linha de calibração NADH. Em seguida, plote as taxas de consumo da ATP contra a concentração do inibidor.

Para determinar as constantes inibitórias, use qualquer software estatístico apropriado capaz de encaixe de curva não linear, como o Origin 2017. Selecione a curva não linear adequada para encaixar os dados de dose-resposta a uma equação quadrática correspondente a um modelo simples de equilíbrio de ligação um-para-um. Y é a taxa de consumo ATP.

Y-mínimo é a taxa de consumo ATP na ausência de inibidor. Y-máximo é a taxa teórica de consumo atp em 100% de inibição. t e t são a concentração total da enzima e inibidora da miosina, respectivamente.

KI é a constante inibitória. Neste estudo, as reações de minosina esquelética e cardíaca II ATPase mostraram traços lineares de intensidade de fluorescência, independentemente da minosina utilizada ou da presença de inibidores. As taxas de ATPase ativadas por basal e actina mostraram dependência linear na concentração de minosina esquelética ou muscular cardíaca II.Um coeficiente de janela de triagem ou fator Z de 0,78 indicou um ensaio confiável com controles positivos e negativos muito bem separados.

Blebbistatin, para-Aminoblebbistatin e para-Nitroblebbistatin mostraram curvas regulares de dose-resposta em ou abaixo de seus valores de solubilidade relatados. As constantes inibitórias para as IIs de miose muscular cardíaca e esquelética foram determinadas pela montagem de uma equação quadrática representando um modelo simples de ligação de equilíbrio aos dados. Traços de intensidade de fluorescência para blebbistatina obtidos em um ensaio ATPase usando mísia muscular esquelética II mostraram sinal de diminuição linear normal dependendo da quantidade de inibidor presente.

No entanto, acima da solubilidade da blebbistatin, observou-se um aumento inesperado no sinal devido à formação de cristais blebbistatin brilhantemente florescente. No caso da para-Nitroblebbistatin com traços normais de intensidade de fluorescência bruta, as taxas de reação obtidas acima da solubilidade divergiram da determinada curva dose-resposta devido à precipitação. Usando este método, desenvolvemos novos inibidores de minosina, potentes e seletivos que podem ser usados como ferramentas científicas em pesquisas básicas ou como candidatos diretos no futuro.

É sempre recomendável usar um ATPase diferente ou outro ensaio funcional específico para a enzima de interesse para distinguir entre hits reais e falsos positivos. Todas as proteínas ligam superfícies plásticas. Esse problema pode afetar muito os resultados, especialmente se a proteína estiver presente em baixas concentrações.

Evite sempre o manuseio líquido desnecessário e use tubos não vinculantes. Ensaios alternativos de ATPase geralmente requerem o manuseio de ácido sulfúrico, substâncias tóxicas ou materiais radioativos. Em contraste, o ensaio ATPase ligado ao NADH requer reagentes apenas sem toxicidade ou muito baixa.