Name: Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprenda a estudar o crescimento de neuritos em neurônios corticais de embrião de rato usando co-transfecção com EGFP. Este método melhora a eficiência de transfecção e permite identificar células transfectadas com precisão para pesquisas em neuroregeneração.

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Este trabalho foi apoiado por fundos do Conselho de auxílios de pesquisa de Hong Kong, saúde e fundo de investigação médica (Hong Kong), regime de subvenção direta da faculdade de administração, o fundo de dotação da United College e o TUYF caridade fiduciário.

Todos os procedimentos seguidos estavam de acordo com os padrões éticos do Comitê de ética em experimentação animal da universidade chinesa de Hong Kong.
1. preparação de COVERSLIP
<ol><li>Coloque uma lamínula circular estéril de 18 mm em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços.</li>
	<li>Cubra a lamínula com 5 μg/mL de solução de poli-D-lisina em uma incubadora humidificada de 37 ° c por pelo menos 1 h.</li>
	<li>Aspirar a solução de poli-D-lisina da placa de cultura do tecido e enxaguar as coberturas revestidas uma vez com água estéril.</li>
</ol>2. dissecção do Neuron embrionário do rato
<ol><li>Sacrifique um rato de Sprague-Dawley cronometrado-grávido em uma idade gestational de 18 dias (E18) pela deslocação cervical ou pelo Asphyxiation do CO2 . Nota: Por favor, verifique os regulamentos locais para o sacrifício de ratos grávidas.</li>
	<li>Abra a cavidade abdominal do rato grávido com tesouras de dissecação e transfira o útero a um prato de Petri de 10 cm.</li>
	<li>Abra o útero e o saco amniótico com cuidado com as tesouras de dissecação pequenas e remova a placenta do embrião do rato usando tesouras de dissecação pequenas. Transfira todo o embrião para uma placa de Petri de 10 cm com soro pré-resfriado com tampão de fosfato suplementado com glicose (PBS-glicose, 10 mM fosfatos de sódio, cloreto de potássio 2,68 mM, cloreto de sódio de 140 mM e 3 g/L de glicose) usando um par de fórceps pequeno.</li>
	<li>Corte ao longo da sutura sagital do crânio e abra-o com cuidado com um par de tesouras de dissecação pequenas. Transfira o cérebro embrionário com uma pequena espátula plana para um prato de Petri de 10 cm com PBS-glicose gelada.</li>
	<li>Separe os dois hemisférios cerebrais do cerebelo e do tronco cerebral usando duas pinças #5 um microscópio de dissecção. Nota: Por favor, veja referência12 para a estrutura do cérebro de rato.</li>
	<li>Retire as meninges usando a pinça #5.</li>
	<li>Isole o córtex dos hemisférios cerebrais com duas pinças #5 retas.</li>
	<li>Transfira o córtex isolado para a PBS-glicose gelada em um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
</ol>3. cultura primária do Neuron cortical
Nota: Todos os procedimentos nas etapas 3 e 4 são realizados dentro de um gabinete de biossegurança classe II.
<ol><li>Liquidar o córtex isolado por gravidade a 4 ° c por 5 min e aspirar a PBS-glicose.</li>
	<li>Adicione 1 mL de 0, 5% de Trypsin-EDTA ao córtex isolado e misture suavemente tocando e incubar o tecido em um banho de água de 37 ° c por 10 min para permitir a digestão enzimática. Bata suavemente no tubo para misturar a cada 2 min.</li>
	<li>Adicionar 4 mL de meio de manutenção (por exemplo, meio Neurobasal) à mistura tecido/tripsina. Nota: Todo o meio de manutenção utilizado neste protocolo é complementado com penicilina-estreptomicina e B-27 suplemento13.</li>
	<li>Dissociar o tecido suavemente por trituração usando uma pipeta de 1 mL.</li>
	<li>Pellet as células dissociadas por centrifugação em 200 x g por 5 min. aspirar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas 3,5 a 3,7 duas vezes.</li>
	<li>Ressuscitem o pellet celular em 1 mL de meio de manutenção.</li>
	<li>Adicionar 10 μL de 0,4% de solução de trypan Blue a 10 μL de suspensão celular para contagem de células viáveis por um hemociômetro.</li>
	<li>Placa os neurônios em uma densidade de 65.000/cm2 (células viáveis) em 1 ml de meio de manutenção por poço em uma placa de 12 poços.</li>
</ol>4. transfection e fixação da pilha
<ol><li>Aos 2 dias in vitro (DIV2), transfecção 0,5 μg do construto de EGFP (pegfp-C1) aos neurônios junto com ou sem de 0,5 μg de POI usando 1 μl do reagente do transfection (por exemplo, Lipofectamine 2000). Use as instruções do fabricante. Nota: Construções de expressão de mamíferos foram preparadas usando um kit de preparação de plasmídeo livre de endotoxina. O tratamento com produtos químicos/moléculas (Neste manuscrito citocalasina d (cyto d) e fator de crescimento do nervo (NGF) foi usado) pode ser feito em 6 h após o transfection.</li>
	<li>Aspirar o meio de cultura 24 h pós-transfecção e lavar as células transfectadas uma vez com 37 ° c PBS (10 mM fosfatos de sódio, cloreto de potássio 2,68 mM, cloreto de sódio 140 mM).</li>
	<li>Fixe as pilhas com o paraformaldeído de 4% em PBS por 10 minutos no escuro na temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave as células fixas três vezes com PBS.</li>
	<li>Adicione uma quantidade mínima de meio de montagem de fluorescência em uma corrediça de vidro do microscópio. Transfira cuidadosamente a lamínula da placa de 12 poços para o meio de montagem com a amostra virada para a corrediça de vidro. Nota: Sele a borda do lamela com lustrador de prego se um meio de montagem aquoso é usado.</li>
</ol>5. medição de neurite outgrowth
<ol><li>Use um objetivo de 40x para capturar imagens usando um microscópio EPI-fluorescente.</li>
	<li>Capture imagens de pelo menos 40 neurônios intactos com sinal de EGFP por transfecção.</li>
	<li>Abra a imagem capturada no software ImageJ com o plugin NeuronJ11 para medir o comprimento do neurite mais longo, do corpo da célula até a ponta do cone de crescimento, de cada Neuron imaged.</li>
	<li>Analise os dados obtidos com o software para determinar o efeito das proteínas alvejadas no crescimento do neurite.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse com o conteúdo deste artigo.

Como afirmado antes, PC12 e seus subclones são amplamente empregados para estudar a extensão do neurite, pois têm excelente eficiênciadetransfecção 2,3. Em contrapartida, os neurônios primários têm uma baixa taxa de transfecção, que é um grande obstáculo para o estudo dos reguladores de crescimento do neurite por transfecção7. Aqui, nós descrevemos um protocolo conveniente para quantificar o conseqüência do neurite em neurônios preliminare...

Neurites, incluindo os axônios e dendritos, são as projeções de neurônios envolvidos no estabelecimento das redes neurais. O crescimento dinâmico dos neuritos é essencial para o neurodesenvolvimento. No entanto, os mecanismos regulamentares subjacentes permanecem pouco claros. Em particular, o dano de neurite é freqüentemente observado em várias doenças neurodegenerativas e após lesões cerebrais1. Portanto, a investigação dos papéis de moléculas putativas em várias vias regulatórias de crescimento de neurite melhoraria nossa compreensão do processo. Além disso, pode revelar alvos terapêuticos novos para várias desordens neurológicas. As linhas celulares neuronais são modelos valiosos para estudar processos neuronais, incluindo o crescimento de neurite, pois são fáceis de manipular e transfecção2,3. No entanto, a deriva genética tem sido relatada a ocorrer em algumas linhas celulares comumente usadas, o que pode levar a variações em suas respostas fisiológicas4. Além disso, a expressão diferencial da proteína foi mostrada entre linhas de pilha neuronal e neurônios preliminares. Por exemplo,PC12, umalinha celular neuronal derivada da glândula adrenal do rato que é amplamente utilizada para estudar o conseqüência do neurite2,3, nãoexpressa receptores NMDA5. Além disso, tem sido proposto que a responsividade reduzida da linha neuro-2a neuroblastoma mouse para neurotoxinas em comparação com os neurônios primários é devido à falta de expressão de certos receptores de membrana e canais iônicos6. Conseqüentemente, os neurônios preliminares são um modelo mais desejável e representativo para a investigação do outgrowth do neurite. No entanto, o uso de neurônios primários é dificultado pela sua baixa eficiência de transfecção7.
Aqui, nós descrevemos um método que envolva o co-Transfection da proteína do interesse (POI) e do EGFP aos neurônios corticais principais do rato. O EGFP atua como um marcador morfológico para a identificação de neurônios transfectados com sucesso e permite a mensuração de neuritos. Nós validamos este método usando compostos/moléculas que foram relatadas para modular o outgrowth do neurite. Além disso, FE65, uma proteína do adaptador neuronal que seja mostrada para estimular o outgrowth do neurite, foi usada para ilustrar esta aproximação8,9. Este protocolo envolve (1) o isolamento de neurônios corticais primários de embriões de ratos do dia embrionário 18 (E18), (2) a cotransfecção de neurônios com EGFP e o POI (FE65 neste estudo) e (3) a imagem e análise dos neurônios usando o processamento de imagens software ImageJ com o plugin NeuronJ10,11.

<table><tbody><tr><td>#5 pinças</td><td>Regine</td><td>5-COB</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circle Cover Sheets</td><td>Thermo Scientific</td><td>CB00180RA</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina D</td><td>Invitrogen</td><td>PHZ1063</td><td>Dissolvido em DMSO</td></tr><tr><td>D-(+)-Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido</td> Tesoura de dissecação <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>, 10 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação, 12,5 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem de fluorescência</td><td>Dako</td><td>S302380</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfecção Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Médio</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF 2.5S Proteína Nativa de Camundongo</td><td>Gibco</td><td>13257019</td><td></td></tr><tr><td>Nugent Utility Forceps, 10 mm, Ponta Reta</td><td>Instrumentos</td><td>de Precisão Mundial 504489</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>#6084-1</td><td></td></tr><tr><td>pCI FE65</td><td></td><td></td><td>Consulte as referências 8 e 15</td></tr><tr><td>Comprimidos PBS</td><td>Gibco</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Espátula</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4147</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), fenol solução vermelha</td><td>do azul de</td><td>Gibco</td> 25300062 <td></td></tr><tr><td>Trypan, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

O conseqüência do neurite é um evento fundamental na formação dos circuitos neural durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Dano de neurite severo e disfunção sináptica ocorrem em várias doenças neurodegenerativas e degeneração relacionada à idade. A investigação dos mecanismos que regulam o conseqüência do neurite não somente derramaria a luz valiosa em processos desenvolventes do cérebro mas igualmente em tais desordens neurológicas. Devido à baixa eficiência do transfection, é atualmente desafiante estudar o efeito de uma proteína específica no conseqüência do neurite em neurônios mamíferos preliminares. Aqui, nós descrevemos um método simples para a investigação do conseqüência do neurite pelo co-transfection de neurônios corticais do rato preliminar com EGFP e uma proteína do interesse (POI). Este método permite a identificação de neurônios transfected do POI através do sinal de EGFP, e assim o efeito do POI no conseqüência do neurite pode ser determinado precisamente. Este ensaio baseado em EGFP fornece uma aproximação conveniente para a investigação dos caminhos que regulam o outgrowth do neurite.

Para testar essa metodologia, utilizou-se o fator NGF de crescimento do cito D e do nervo, que demonstrou inibir e estimular o crescimento doneurite, respectivamente,14,15,16. O comprimento do neurite dos neurônios transfected com EGFP foi medido após o tratamento com cyto D ou NGF. A eficiência do transfection de EGFP aos neurônios era 2,7% (1.068 neurônios contados). Como mostrado na <strong cl...

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo simples para estudar o conseqüência do neurite em neurônios corticais do rato embrionário cotransfecting com EGFP e a proteína do interesse.

Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

A baixa eficiência de transfecção é um grande obstáculo para determinar como a proteína reativa o crescimento de neurite nos neurônios primários. Nosso protocolo supera esse problema por co-transfecção do EGFP para identificar células transfeccionadas com sucesso. A alta taxa de co-transfecção do EGFP e as proteínas de interesse garantem a precisão do ensaio.E, consequentemente, a coloração da imunofluorescência é agora necessária. Como o crescimento da neurita ocorre durante a regeneração neural, este método pode ser aplicado à identificação de novos alvos para restaurar a rede neuronal danificada em traumas cerebrais ou doenças neurodegenerativas. Antes de iniciar o procedimento, coloque uma cobertura circular estéril de 18 milímetros em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 12 poços e cubra cada mancha com cinco microgramas por milímetro de solução poli-D-lysina em uma incubadora umidificada de 37 graus Celsius por pelo menos uma hora.No final da incubação, aspire a solução Poly-D-Lysine e enxágue as tampas com água estéril. No dia 18, coloque o útero colhido de um rato Sprague Dawley grávida em uma placa de Petri de 10 centímetros e use uma pequena tesoura de dissecaçã

an-enhanced-green-fluorescence-protein-based-assay-for-studying

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Imagens de células vivas é de utilidade particular quando se estuda a dinâmica do tráfico organela. Aqui nós descrevemos um protocolo para geração de imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso em neurônios cultivados com grande campo de microscopia de fluorescência. Este protocolo é flexível e pode ser adaptado para outras organelas imagem, tais como mitocôndrias, endossomos, e peroxissomos.

Imagens ao vivo de vesículas com núcleo denso na Primária Cultivadas neurônios do hipocampo

Este artigo descreve um protocolo de romance e de reagente conjunto projetado para a medição sensível de efeitos neurotóxicos de compostos e tratamentos em co-culturas de neurônios e astrócitos usando análise de conteúdo de alta. Resultados demonstram que a análise de conteúdo de alta tecnologia representa um romance empolgante para a avaliação de neurotoxicidade.

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

FRAP tem sido utilizada para quantificar a mobilidade de proteína de fluorescência verde (GFP) marcadas proteínas em células em cultura. Examinamos as frações móveis / imóveis da GFP, analisando o percentual de recuperação de fluorescência após a fotodegradação. Neste estudo, foi realizada na FRAP espinhas de neurônios do hipocampo.

Recuperação de fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) de fluorescência Proteínas Tagged em espinhas dendríticas dos neurônios do hipocampo Cultivadas

Neste vídeo, descrevemos um método baseado em luminescência para avaliar a neurotoxicidade de compostos de pequenas moléculas promotores de crescimento de neuritos na viabilidade de neurônios derivados de hNPC. O ensaio mede o nível de ATP intracelular, um indicador da viabilidade celular, para avaliar a neurotoxicidade após o tratamento com o composto de teste.

Ensaio baseado em luminescência para avaliar a neurotoxicidade de compostos de teste em neurônios

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de imunofluorescência baseado em EGFP para identificar a eficácia das proteínas-alvo no crescimento de neuritos de neurônios corticais primários. Os neurônios primários são transfectados com uma proteína fluorescente, EGFP, e uma proteína-alvo e, em seguida, um imunoensaio é realizado para investigar o efeito da proteína-alvo no crescimento de neuritos.

Ensaio de imunofluorescência para avaliar o efeito de proteínas-alvo no crescimento de neuritos

Morfogênese neuronal ea migração são eventos cruciais subjacentes ao desenvolvimento do cérebro. Aqui, descrevemos os métodos para manipular geneticamente cultivadas neurônios granulares do cerebelo e do cerebelo em desenvolvimento para a avaliação da morfologia e características migratórias dos neurônios.

Manipulação genética de Cerebelar Granule Neurônios<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Estudar Neuronal Morfologia e Migração

Descrevemos um ensaio óptico para vesícula sináptica (SV) reciclagem em neurônios cultivados. Combinar este protocolo com duplo transfeccao de expressar uma proteína de interesse e o marcador pré-sináptica nos permite localizar sites pré-sináptica, sua vesícula sináptica, capacidade de reciclagem e determinar o papel da proteína de interesse.

Um ensaio óptico para vesícula sináptica reciclagem nos neurônios cultivados superexpressão de proteínas pré-sináptica

O protocolo apresentado descreve um método para um ensaio de crescimento de neurite e avaliação neurotoxicidade de compostos de moléculas pequenas.

Um ensaio de crescimento de neurita e avaliação de neurotoxicidade com neurônios derivados de células progenitoras neugenitoras humanas

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Usando camundongos fluorescentes transgênicos, protocolos detalhados são descritos para avaliar o transporte in vivo axonal de endosários e mitocôndrias dentro de axônios motores e sensoriais do nervo ciático intacto em animais vivos.

Expansão do Kit de Ferramentas para Imagens In Vivo do Transporte Axonal

Aprenda a estudar o crescimento de neuritos em neurônios corticais de embrião de rato usando co-transfecção com EGFP. Este método melhora a eficiência de transfecção e permite identificar células transfectadas com precisão para pesquisas em neuroregeneração.

Um ensaio com base em proteínas de fluorescência verde reforçada para estudar o crescimento do neurite em neurônios primários

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