Name: Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Aprenda a rastrear a formação dinâmica de domínios de cromatina mediados por PRC2 em células-tronco embrionárias de camundongo usando CRISPR/Cas9 e genotipagem. Este método permite pausar e analisar eventos em tempo real.

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Agradecemos aos Drs. L. vales, D. Ozata e H. mou a revisão do manuscrito. O laboratório de D.R. é apoiado pelo Instituto médico de Howard Hughes e pelos institutos nacionais da saúde (R01CA199652 e R01NS100897).

Geração de mESCs induzível do salvamento de eed
1. cultura celular
<ol><li>Use pilhas de haste embrionárias do rato C57BL/6 livre de alimentador (mESCs) que possuem um transgene CreERT2 estàvel integrado, que possa translocate ao núcleo em cima da administração de 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)13.</li>
	<li>Cresça os mESCs no meio ESC convencional14,15, suplementado com 1000 U/ml LIF, inibidor de 1 μm Erk PD0325901 e 3 μm GSK3 inibidor CHIR99021. Para o meio ESC convencional, use DMEM Knockout contendo 15% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1X penicilina/estreptomicina e 0,1 mM 2-Mercaptoetanol.</li>
	<li>Use placas revestidas com 0,1% de solução de gelatina para cultivo de mESCs.</li>
</ol>2. geração de clonal EED Knockout (KO) mESCs
<ol><li>Guia de design RNAs (gRNAs) para excluir exon 10 e exon 11 de cópia endógena de EED em mESCs usando a ferramenta de design CRISPR em Benchling16. EED-KO-gRNA-1 atinge o intron imediatamente a montante do exon 10 e EED-KO-gRNA-2 atinge o intron imediatamente a jusante de exon 11. A aplicação simultânea destes gRNAs exclui o exon 10 e o exon 11 pela junção de extremidade não-homologous (NHEJ).</li>
	<li>Clone gRNAs em pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) usando instruções em Ran et al., 201317.</li>
	<li>Num formato de placa de 6 poços, transfecção 2 x 105 mESCs com 1 mg de cada eed-ko-grna-1 e eed-ko-grna-2 (ver tabela de materiais) utilizando o reagente de transfecção seguindo as instruções do fabricante. Mude a mídia 24 h após a transfecção.</li>
	<li>Dois dias após o transfection, isolam pilhas positivas de GFP usando a classificação fluorescência-ativada da pilha (FACS). Espere que a eficiência do transfection varie em torno de 10-30%. Classifique em torno de 5 x 105 células para capturar suficiente GFP células positivas para o chapeamento.</li>
	<li>Placa os isolados GFP positivo mESCs em 15 placas do cm pre-Coated com gelatina 0,1% (10-20 X103 pilhas por a placa) para a colheita da colônia.</li>
	<li>Cresça as pilhas no meio do ESC por aproximadamente uma semana até que as únicas colônias sejam visíveis. Mude a mídia a cada 2 dias.</li>
	<li>Escolha um mínimo de 48 colônias usando 20 μL de ponta de micropipeta. Raspe sobre a colônia ao aspirar na ponta da micropipeta. Não quebre a colônia em células simples. Transfira a colônia para uma placa de poço contendo accutase (20 mL) 96.</li>
	<li>Incubar as colônias por 10 min a 37 ° c até que todas as células sejam dissociadas.</li>
	<li>Adicione 200 mL de mídia ESC em cada poço usando pipeta multicanal.</li>
	<li>Misture bem e placa as células em duas placas separadas 96 bem usando pipeta multicanal.</li>
	<li>Use uma das placas de 96 poços para genotipagem e manter o outro crescendo até que a genotipagem seja concluída. Use a solução de extração de DNA para extrair o DNA da placa de 96 poços seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Use os primers de genotipagem Gnt_EED-ko-up e Gnt_EED-KO_down, que abrangem o site excluído e executam a genotipagem PCR com Taq DNA polymerase seguindo as instruções do fabricante. Nota: outros tipos de DNA polymerases também podem ser usados para genotipagem, no entanto, Taq DNA polimerase oferece conveniência como a reação de PCR pode ser diretamente carregada em um gel quando seu buffer de reação colorida é usado.<ol>
<li>Observar um produto de DNA de menor peso molecular em células com um apagamento homozygous relativo ao Wild-Type (WT) caso. Nota: para gerar PRC2 células nulas, a deleção homozygous de exons 10 e 11 é necessária para destabilizar e degradar EED, uma subunidade essencial do núcleo PRC213. A eficiência de segmentação CRISPR é de cerca de 10%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Valide a supressão do exon 10 e 11 de EED e da perda de proteína de EED pelo sequenciamento de Sanger e pela mancha ocidental, respectivamente.</li>
	<li>Confirme a depleção de EED e H3K27me2/ME3 de cromatina em células EED KO por ChIP-Seq usando anticorpos contra H3K27me2/ME3 e EED. Use o protocolo dado em Oksuz et al., 201715 para experimentos com chip-Seq.</li>
</ol>3. Engenharia de eed Knockout mESCs para abrigar CRE-ERT2 based induzível eed expressão
<ol><li>Design gRNA (EED-gRNA-inducible) para introduzir um corte dentro do intron seguinte exon 9 de EED usando a ferramenta de design CRISPR em Benchling16 (ver tabela de materiais).</li>
	<li>Clone gRNAs em pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) usando instruções em Ran et al., 201317.</li>
	<li>Projete um ADN modelo doador que compreenda a seqüência do cDNA do EED após o exon 9 e uma etiqueta do C-terminal Flag-HA a montante de uma seqüência do T2A-GFP, tudo na orientação reversa com respeito à seqüência endógena do gene.<ol>
<li>Flanqueando a gaveta com um Splice-Acceptor e uma sequência de poliadenilação aninhada entre os locais de loxP invertidos heterólogos (lox66 e lox71)18.</li>
		<li>Inclua pelo menos 500 BP de braços de homologia de cada extremidade. Divida o molde do doador em 2 segmentos de fragmentos do gene de gBlocks (veja gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" e gBlock-2-Cage-Mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") e monte-os em Vetor de PCR Blunt usando a clonagem de Gibson seguindo as instruções do fabricante. Nota: gblock-2 contém um resíduo aromático (Y365) dentro da gaiola de EED que é importante para a interação com H3K27me312. gBlock-2-WT contém resíduo tipo selvagem, enquanto gblock-2-Cage-Mutant contém a gaiola-mutante de EED (Y365A), incapaz de ligar a H3K27me3. Induzível WT eed resgate é denotado como i-WT-r e induzível gaiola-mutante eed resgate é denotado como i-MT-r para a conveniência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Em um formato da placa de 6 poços, transfecção 2 x 105 mESCs com 1 magnésio do grna (eed-grna-inducible) e 1 magnésio dos moldes do doador (i-WT-r ou i-MT-r) usando o reagente do transfection e isole pilhas positivas do GFP usando FACS.</li>
	<li>Siga as etapas 2.3-2.11 para isolar colônias individuais prontas para genotipagem para direcionamento bem-sucedido.</li>
	<li>Use os primers de genotipagem Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-Rev-1, que abrangem a gaveta inserida e executam a PCR genotipagem usando Taq DNA polymerase. Nota: a eficiência de segmentação para CRISPR é de cerca de 10%.<ol>
<li>Confirme a integração correta da gaveta pelo PCR usando os primers Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-Rev-2 , que são fora dos braços da homologia. Nota: a integração homozygous da gaveta é necessária para realizar o salvamento eficiente de EED. Anote que as pilhas com integração homozygous produzirão um único produto grande do ADN em comparação ao WT EED, que produzirá um produto curto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confirme a integração do cassette pelo sequenciamento de Sanger.</li>
	<li>Confirme a inversão da gaveta e a expressão de EED e outros componentes do núcleo PRC2 (por exemplo, EZH2 e SUZ12) em cima da administração 4-OHT pelo western blotting.</li>
	<li>Confirme a expressão de T2A-GFP e percentual de flip por citometria de fluxo. Observe que a expressão de GFP é indicativa de inversão da gaveta e a expressão de EED.</li>
</ol>4. após a nucleação e disseminação da atividade PRC2 na cromatina
<ol><li>Confirme que os mESCs i-WT-r e i-MT-r não têm expressão com vazamento de GFP por citometria de fluxo. No caso de expressão com vazamento de GFP, isole células GFP-negativas por FACS antes de iniciar o experimento.</li>
	<li>Expanda os mESCs i-WT-r e i-MT-r em placas de 5 15 cm (5x 106 células por placa).</li>
	<li>Induzir a expressão de WT ou Cage-Mutant EED pela administração de 0,5 mM 4-OHT para 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 8 dias (placa de 1 15 cm por condição). Mude a mídia após 12 h para tratamentos com mais de 12 h. isolar as células recombinadas com êxito por FACS usando GFP. Ajuste o tempo dos tratamentos de forma que todas as condições sejam coletadas de uma só vez.</li>
	<li>Executar ChIP-Seq para H3K27me2, H3K27me3 para investigar o seu depósito temporal para cromatina em resposta à re-expressão de WT ou Cage-Mutant EED. Use o protocolo ChIP-Seq, incluindo a preparação da biblioteca detalhada em Oksuz et al., 201715.</li>
	<li>Use o controle de pico em cada amostra para permitir a comparação quantitativa entre os diferentes pontos temporais19.<ol>
<li>Para o controle de espiga, use a cromatina da Drosophila melanogaster (em uma proporção de 1:50 para a cromatina derivada de mesc), bem como o anticorpo H2Av específico de Drosophila (1 μL de anticorpo H2Av por 4 μg de cromatina de Drosophila de acordo com instruções do fabricante) em cada amostra.</li>
		<li>Prepare a cromatina da Drosophila de forma semelhante à dos mESCs usando o protocolo detalhado em Oksuz et al., 201715.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mapeie a seqüência de leituras para ChIP-Seq para mm10 genoma com bowtie 2 usando parâmetros padrão20.</li>
	<li>Normalize o mouse ChIP-Seq lê para Spike-em Drosophila ler contagens21. Calcule o fator de normalização de Spike-in usando a seguinte fórmula: 1 x 106/Unique Drosophila ler contagens. Esperar para obter cerca de 1 x 106Drosophila ler contagens e 20 x 106 mouse ler contagens por experimento.<ol>
<li>Não inclua a cromatina da Drosophila ao sequenciamento das amostras de entrada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use genomecov ferramenta de bedtools para converter arquivo Bam em bedgraph22. Em seguida, converta o bedgraph no arquivo Bigwig usando a ferramenta bedgraphtobigwig de USCS23,24. Consulte o seguinte script: Gen = "caminho para o genoma mm10" Chr = "trajeto aos tamanhos do cromossoma mm10" inp_bam = "caminho para o arquivo Bam de entrada" Multiply = "calcula o fator de normalização de Spike-in" bedtools genomecov-BG-Scale $multiply-IBAM $inp _ Bam-g $gen > Output. bedGraph classificar-K1, 1-K2, 2n output. bedGraph > output_sorted. bedGraph Método bedGraphToBigWig output_sorted. bedGraph $chr output.bw
</li>
	<li>Visualize as densidades de leitura do ChIP-Seq carregando os arquivos Bigwig no navegador do genoma USCS24.</li>
</ol>5. monitoramento da emergência e crescimento dos focos H3K27me3 nos núcleos do mESCs
<ol><li>Placa 1x 104 mESCs em corrediças de câmara de 8 poços pré-revestidas com 0,1% de gelatina.</li>
	<li>No dia seguinte, começar a realizar 4-OHT consecutivos (0,5 mM) induções para recolher as células expressando EED para pontos de tempo indicados (0 h, 12 h, 24 h e 36 h). Mude a mídia após 12 h para tratamentos com mais de 12 h.</li>
	<li>Fixar os mESCs com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente (RT) por 10 min.</li>
	<li>Permeabilize as células com PBS/0,25% Triton X-100 em RT por 30 min.</li>
	<li>Bloqueie as células com PBS/5% de burro sérico/0,1% Triton X-100 (buffer de bloqueio) em RT por 30 min.</li>
	<li>Diluir H3K27me3 anticorpo primário 1:500 no buffer de bloqueio e adicionar sobre as células.</li>
	<li>Incubar as células com anticorpo primário durante a noite a 4 ° c.</li>
	<li>No dia seguinte, realize 3 lavas com PBS/0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Diluir o anticorpo secundário (Alexa fluor 595) 1:1000 no buffer de bloqueio e adicionar às células.<ol>
<li>Realize todas as incubações no escuro nos seguintes passos como anticorpos secundários conjugados com Alexa fluor são sensíveis à luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar o anticorpo secundário durante 2 h na RT.</li>
	<li>Realize 3 lavas com PBS/0,1% Triton X-100.</li>
	<li>Diluir DAPI (1 mg/mL) 1:4000 com PBS/0,1% Triton X-100 e adicionar às células.</li>
	<li>Incubar as células com DAPI por 10 min em RT.</li>
	<li>Monte as células com o Aqua Mount.</li>
	<li>Imagem das células com microscopia confocal na ampliação de 63X.</li>
	<li>Processar e pseudocolorir as imagens usando uma distribuição de ImageJ, Fiji25.</li>
</ol>

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</ol>

D.R. é co-fundador da Constellation Pharmaceuticals e da Fulcrum Therapeutics. Os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Uma abordagem poderosa para entender os detalhes mecanísticos durante a formação de um determinado domínio da cromatina, é primeiro interromper o domínio e, em seguida, rastrear sua reconstrução em andamento dentro das células. O processo pode ser pausado a qualquer momento durante a reconstrução para analisar detalhadamente os eventos em andamento. Estudos prévios sobre os domínios da cromatina não conseguiram resolver tais eventos, pois foram realizados em condições de estado estacionário (por exemplo, comparando o tip...

Os genomas eucarióticos são altamente organizados e as mudanças na acessibilidade da cromatina controla diretamente a transcrição do gene1. O genoma contém tipos distintos de domínios de cromatina, que se correlacionam com a atividade transcricional e o tempo de replicação2,3. Estes domínios da cromatina variam no tamanho de alguns kilobases (KB) a mais de 100 KB e são caracterizados por um enriquecimento em modificações distintas do histona4. As questões centrais são: como esses domínios são formados e como eles são propagados?
Um dos domínios mais bem caracterizados da cromatina é promovido através da atividade do complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 é um complexo de múltiplas subunidades composto por um subconjunto do grupo polycomb (PcG) de proteínas5,6, ecatalisa a mono-, di-e trimetilação de lisina 27 de histona H3 (H3K27me1/ME2/ME3)7,8, 9,10. H3K27me2/ME3 estão associados a um Estado repressivo da cromatina, mas a função de H3K27me1 é obscura6,11. Um dos componentes centrais do PRC2, o desenvolvimento embrionário do ectoderma (EED), liga-se ao produto final da catálise PRC2, H3K27me3, através de sua gaiola aromática e esta característica resulta na estimulação alosterica de PRC212,13. A atividade enzimática PRC2 é crucial para preservar a identidade celular durante o desenvolvimento como a expressão inadequada de certos genes de desenvolvimento que são contraindicados para uma linhagem específica, seria prejudicial5,6 . Assim, desvendar os mecanismos pelos quais o PRC2 promove a formação de domínios de cromatina repressiva em mamíferos é de fundamental importância para a compreensão da identidade celular.
Todos os sistemas experimentais passados projetados investigar a formação do domínio da cromatina que inclui domínios PRC2-negociados da cromatina, foram executados condições de estado estacionário, que são incapazes de seguir os eventos de desdobramento da formação do domínio da cromatina em Células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para gerar um sistema celular induzível que monitora o recrutamento inicial e a propagação de domínios de cromatina. Especificamente, nós nos concentramos em rastrear a formação de domínios de cromatina repressiva mediada por PRC2 que compõem H3K27me2/3. Esse sistema que pode captar os detalhes mecanísticos da formação do domínio da cromatina, pode ser adaptado para incorporar outros domínios da cromatina, como os domínios amplamente estudados, compreendendo H2AK119ub ou H3K9me. Em combinação com a genômica e as tecnologias de imagem, essa abordagem tem o potencial de abordar com sucesso várias questões-chave na biologia da cromatina.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-Hidroxitamoxifeno (5 mg)</td><td>Sigma</td><td>H7904-5MG</td><td>Para indução de expressão de EED</td></tr><tr><td>16% Solução aquosa de paraformaldeído (10x10 ml)</td><td>Microscopia eletrônica Sciences</td><td>15710</td><td>Para imunofluorescência</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>Para cultura de mESCs</td></tr> Solução <tr><td>de gelatina a 2%</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ml</td><td>Para mESCs cultura</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Innovative Cell Tech/FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>Para mESCs cultura</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>Para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Aqua-Mount Meio de montagem</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>Para imunofluorescência</td></tr><tr><td>CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>Para imunofluorescência</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dicloridrato) - 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>Para inibidor de ERK de imunofluorescência</td></tr><tr><td>, PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>Para cultura de mESCs</td></tr><tr><td>ESGRO Proteína LIF de camundongo recombinante</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>Para cultura de mESCs</td></tr><tr><td>FBS Stem Cell Qualified</td><td>Atlanta</td><td>S10250</td><td>Para cultura de mESCs</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Para clonagem de modelo de doador</td></tr><tr><td>Inibidor de GSK3, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>Para cultura de mESCs</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) coelho mAB</td><td>Cell Signaling</td><td>9728S</td><td>Anticorpo para ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Cell Signaling</td><td>9733S</td><td>Anticorpo para ChIP-seq</td></tr><tr><td>Histone H2Av motivo</td> <td>ativo</td><td>39715</td> do anticorpo (pAb) <td>Pico-no controle para o</td></tr><tr><td>nocaute DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td> de ChIP-seq <td>para a cultura de mESCs</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>para a cultura de mESCs</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td>para a transfecção</td></tr><tr><td>Bioline BIO-21079</td> do<td>ADN de MangoTaq polimerase</td><td>para a PCR da genotipagem</td><td></td></tr><tr><td>Soro de burro normal (10 mL)</td> <td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Para imunofluorescência</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma / Roche</td><td>P0781</td><td>Para cultura mESCs</td></tr><tr><td>pSpCas9 (BB) -2A-GFP (PX458)</td> <td>Addgene</td><td>48138</td><td>Para clonagem de gRNA</td></tr><tr><td>Solução de extração de DNA QuickExtract</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>para genotipagem PCR</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Kit de</td> clonagem de PCR sem corte zero Sigma <td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td>para clonagem de modelo de doador</td></tr><tr><td>Primers/gBlocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>Sequência: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pares para nocautear EED em C57BL/6 ESCs para sistemas i-WT-r e i-MT-r.</td></tr><tr><td>Sequência EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs emparelha para nocautear EED em C57BL / 6 ESCs para sistemas i-WT-r e i-MT-r.</td></tr><tr>Sequência induzível <td></td><td></td><td>por EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA e doador para gerar o sistema i-WT-r no fundo EED-KO.</td></tr><tr><td>i-WT-r Doador</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA e Doador para gerar o sistema i-WT-r no fundo EED-KO.</td></tr><tr>Sequência induzível <td></td><td></td><td>por EED-gRNA</td><td>: atggcaccccgaaattagaa. gRNA e doador para gerar o sistema i-WT-r no fundo EED-KO.</td></tr><tr><td>i-MT-r Doador</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA e Doador para gerar o sistema i-MT-r no fundo EED-KO.</td></tr><tr><td>Genotyping Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sequência: ctgtaggctgccatctgtga. O alelo do tipo selvagem produzirá um produto de 1,9 kb. O alelo nocaute produzirá um produto de 200 pb.</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sequência: agccagggctacacagagaa. O alelo do tipo selvagem produzirá um produto de 1,9 kb. O alelo nocaute produzirá um produto de 200 pb.</td></tr><tr><td>Sequência Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>: tgcagtgaaacaaatttggaa. Quando o é inserido, os primers produzirão 1863 pb. O alelo do tipo selvagem produzirá um produto de ~ 200 pb.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sequência: gagaggggtggcactgtaaa. Quando o é inserido, os primers produzirão 1863 pb. O alelo do tipo selvagem produzirá um produto de ~ 200 pb.</td></tr><tr><td>Sequência Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>: ccccctctttttttct. Quando o é inserido, os primers produzirão 3200 bp. O alelo do tipo selvagem produzirá um produto de 1560 pb.</td></tr><tr><td>Sequência Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>: atgcctgggtgaatgaaaaaa. Quando o é inserido, os primers produzirão 3200 bp. O alelo do tipo selvagem produzirá um produto de 1560 pb.</td></tr></tbody></table>

um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

A organização e a estrutura dos domínios da cromatina são exclusivas para linhagens de células individuais. Sua desregulação pode levar a uma perda na identidade celular e/ou doença. Apesar dos esforços enormes, nosso entendimento da formação e propagação dos domínios da cromatina ainda é limitado. Os domínios da cromatina foram estudados em condições de estado estacionário, o que não é propício para seguir os acontecimentos iniciais durante o seu estabelecimento. Aqui, apresentamos um método para reconstruir os domínios da cromatina inducivelmente e seguir sua re-formação em função do tempo. Embora, aplicado primeiramente ao exemplo da formação repressivas PRC2-negociada do domínio da cromatina, poderia facilmente ser adaptado a outros domínios do cromatina. A modificação e/ou a combinação deste método com a genômica e as tecnologias de imagem fornecerá ferramentas inestimáveis para estudar o estabelecimento de domínios de cromatina em grande detalhe. Acreditamos que esse método irá revolucionar nossa compreensão de como os domínios da cromatina se formam e interagem uns com os outros.

Um esquema geral do sistema de resgate condicional Figura 1 mostra o esquema de segmentação para resgatar condicionalmente células eed ko com WT ou Cage-Mutant (Y365A) eed que é expressa a partir do locus eed endógeno. Depois de bater para fora EED, uma subunidade de núcleo de PRC2 que é essencial para sua estabilidade e atividade enzimática, uma gaveta dentro do intron que segue o exon 9 de EED é introduzida (Figura 1). A gaveta consiste na ...

Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.

Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Delineamos um sistema para avaliar a formação dinâmica dos domínios da cromatina. Utilizamos este sistema para acompanhar o recrutamento e a disseminação de domínios de cromatina mediada pela PRC2 em células. O processo pode ser pausado a qualquer momento para analisar os eventos em andamento.Este sistema poderia ser orientado para monitorar mudanças dinâmicas em qualquer processo celular e, portanto, não se limita ao rastreamento da formação de domínios de cromatina. Comece projetando rnAs guia para excluir exon 10 e 11 de uma cópia endógena do desenvolvimento de ectoderme embrionário, ou EED, em células-tronco embrionárias do mouse usando a Ferramenta de Design CRISPR. Clone o guia RNAs no plasmídeo CRISPR/Cas9 de acordo com as instruções do manuscrito.Em um formato de placa de seis poços, transfem 200.000 células-tronco embrionárias de camundongos, ou mESCs, com um micrograma de cada RNA guia usando reagentes de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Mude a mídia 24 horas após a transfecção. Dois dias após a transfecção, isole as células GFP-positive usando FACS.A eficiência da transfecção varia de cerca de 10 a 30%, então classifique cerca de 500.000 células para capturar células positivas de GFP suficientes para chapeamento. Aplaque as células isoladas GFP-positive em placas de 15 centímetros que são pré-revestidas com gelatina de 0,1% para colheita de colônias. Cresça as células no meio ESC por cerca de uma semana até que colônias únicas sejam visíveis, certificando-se de mudar a mídia a cada dois dias.Escolha um mínimo de 48 colônias usando uma ponta de pipeta de 20 microliter para raspar sobre a colônia enquanto aspira. Sem quebrar a colônia em células únicas, transfira-a para uma placa de 96 poços contendo Accutase. Incubar as colônias a 37 graus Celsius por 10 minutos para dissociar as células.Em seguida, adicione 200 microliters de mídia ESC a cada poço com uma pipeta multicanal. Misture bem e coloque as células em duas placas separadas de 96 poços. Use uma das placas para genotipagem, e mantenha a outra crescendo até que a genotipagem seja concluída.Extrair DNA da placa usando reagentes comerciais e seguindo as instruções do fabricante. Use primers genotipagem que abrangem o local excluído para executar pcr genotipagem com polimerase de DNA Taq. Observe um produto de DNA de menor peso molecular nas células com uma exclusão homozigosa em relação às células do tipo selvagem.Design guia RNA para introduzir um corte dentro do intron seguinte exon 9 de EED usando uma ferramenta de design CRISPR, e cloná-lo no plasmídeo CRISPR/Cas9 de acordo com as instruções do manuscrito. Projete um DNA de modelo de doador que inclua a sequência de EED cDNA após o exon 9 e uma tag C-terminal Flag-HA a montante de uma sequência T2A-GFP, tudo em orientação reversa em relação à sequência genética endógena. Flanquear o com um aceitador de emendas e uma sequência de poliadenilação aninhada entre locais heterologos invertidos de loxP, e inclua pelo menos 500 pares de bases de braços de escoologia de cada extremidade.Divida o modelo de doador em dois segmentos de gBlocks Gene Fragments e monte-os em um vetor PCR Blunt usando clonagem Gibson seguindo as instruções do fabricante. Em formato de placa de seis poços, transfeto 200.000 mESCs com um micrograma do RNA guia e um micrograma dos modelos doadores. Em seguida, isole as células GFP positivos usando FACS.Isole colônias individuais para genotipagem de acordo com as instruções do manuscrito. Use a citometria de fluxo para confirmar que os mESCs não têm expressão vazada de GFP e, se o fizerem, isole células GFP-negativas pelo FACS antes de iniciar o experimento. Expanda as células em cinco placas de 15 centímetros, e induza a expressão de EED do tipo selvagem ou mutante da gaiola, administrando 5 micromolar 4-hidroxitamoxifen por cinco durações de tempo diferentes que variam de zero horas a oito dias.Mude a mídia após 12 horas para tratamentos que duram mais do que isso. Isole as células recombinadas com sucesso pela FACS usando GFP, e execute ChIP-seq para H3K27me2 e H3K27me3 para investigar sua deposição temporal para cromatina em resposta à reexpressão do EED tipo selvagem ou mutante da gaiola. Para validar os sistemas induíveis de resgate selvagem e de resgate de mutantes induíveis, a mancha ocidental foi realizada em extratos inteiros após a indução de EED tipo selvagem ou mutante de gaiola com tratamento de 4-hidroximoxifen.A análise da citometria de fluxo foi utilizada para confirmar a eficiência da expressão T2A-GFP em células i-WT-r antes e depois do tratamento 4-hidroxytamoxifen, o que demonstra a virada bem sucedida do invertido. ChIP-seq de H3K27me3 foi realizado após reexpressão de EED tipo selvagem ou mutante de gaiola. O surgimento de H3K27me3 é observado às 12 horas após a expressão EED do tipo selvagem em locais de nucleação discretos e, em seguida, em 24 horas em regiões distantes dos locais de nucleação inicial.ChIP-seq também foi usado para rastrear a deposição temporal de H3K27me2, que parece preceder o depoimento de H3K27me3. Os focos H3K27me3 e seu crescimento também foram visualizados com microscopia de fluorescência. Após 12 horas de expressão EED tipo selvagem, há evidências da formação de focos H3K27me3.Esses focos aumentam em número e tamanho em 24 horas e eventualmente se espalham para grandes regiões do núcleo em 36 horas. O desenho preciso das construções de DNA é muito importante para gerar o sistema de resgate indutível desejado. Este método pode fornecer um controle temporal e especial de mutações de proteínas em camundongos.Dessa forma, pode-se determinar o efeito de mutações em um tecido específico ou em um estágio específico de desenvolvimento. No momento, estamos usando este sistema para monitorar o estabelecimento dinâmico de outro domínio de cromatina, o complexo repressivo Polycomb 1.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo descreve o protocolo para cisalhamento da cromatina usando digestão enzimática de nuclease microcócica. O cisalhamento da cromatina é uma etapa essencial na imunoprecipitação da cromatina ou fluxo de trabalho ChIp, que ajuda a investigar a interação proteína-DNA em células de leucemia mielóide crônica humana. No protocolo de recurso, o cisalhamento da cromatina é realizado usando sonicação.

Cisalhamento da cromatina: um método para gerar fragmentos de cromatina usando digestão enzimática

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões por Chip-Seq

Extração de sal sequencial das proteínas da cromatina vinculada é uma ferramenta útil para determinar as propriedades de vinculação de grandes complexos de proteínas. Esse método pode ser empregado para avaliar o papel das subunidades individuais ou domínios na afinidade total de uma proteína complexa em massa de cromatina.

Extrações de sal sequenciais para a análise da cromatina em massa vincular propriedades de cromatina modificando complexos

Apresentamos uma imunoprecipitação da cromatina nativa modificada sequenciamento (ChIP-seq) metodologia para a geração de conjuntos de dados sequência apropriadas para um quadro analítico de nucleossoma densidade ChIP-seq integrando acessibilidade nuclease micrococcal (MNase) com medidas de modificação de histona.

Geração de imunoprecipitação da cromatina nativa sequenciamento de bibliotecas para análise da densidade nucleossoma

A plasticidade da arquitetura nuclear é controlada por mecanismos epigenéticos dinâmicos, incluindo não-codificantes RNAs, DNA methylation, nucleossoma reposicionamento, bem como composição de histona e modificação. Aqui descrevemos um protocolo de isolamento Formaldehyde-Assisted de elementos normativos (FAIRE) que permite a determinação de acessibilidade de cromatina de forma reprodutível, barata e simples.

Formaldeído-assistida isolamento de elementos reguladores para acessibilidade de cromatina medida em células de mamíferos

Este protocolo concentra-se na preparação de cromatina a partir de tecidos congelados instantâneos e é adequado para Imunoprecipitação de Cromatina de Reticulação (X-ChIP) seguida de análise quantitativa de PCR (X-ChIP-qPCR) ou abordagens de sequenciamento de próxima geração (X-ChIP-seq).

Extração de cromatina de tecido hepático quimérico congelado para análise de imunoprecipitação de cromatina

Este protocolo apresenta uma técnica para mapeamento de alta resolução de locais de replicação em cromatina estruturalmente preservada in situ que emprega uma combinação de rotulagem EdU-streptavidin-Nanogold pré-incorporação e ChromEMT.

Domínios replicativos de imagem em Cromatina Ultraestruturalmente Preservada por Tomografia Eletrônica

Este protocolo descreve o método Capture Hi-C usado para caracterizar a organização 3D de regiões genômicas alvo de tamanho megabaseado em alta resolução, incluindo limites de domínios topologicamente associados (TADs) e interações de cromatina de longo alcance entre elementos regulatórios e outros elementos de sequência de DNA.

Decifrando a organização da cromatina 3D de alta resolução via captura Hi-C

Aqui, apresentamos uma adaptação da técnica de captura da conformação cromossômica (3C) em detalhes com ênfase no envolvimento e aprendizagem da graduação.

Obtendo um A com os 3Cs: Captura de Conformação Cromossômica para Graduandos

Apresentamos um protocolo de microscopia de localização de molécula única em três cores (SMLM) que permite o mapeamento reprodutível de eucromatina, heterocromatina e RNAP II para análise espacial. Esse protocolo permite a marcação eficiente de multicor em ambientes nucleares densos, incluindo alvos associados à cromatina, possibilitando detecção simultânea e confiável.

Um Protocolo de Microscopia de Localização de Molécula Única Multirótulo para Investigação da Cromatina em Ambiente Nuclear Denso

Aprenda a rastrear a formação dinâmica de domínios de cromatina mediados por PRC2 em células-tronco embrionárias de camundongo usando CRISPR/Cas9 e genotipagem. Este método permite pausar e analisar eventos em tempo real.

Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

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