Name: Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprenda a purificar a proteína S100A12 humana e seus oligômeros induzidos por íons para estudos de imunologia celular. Este método garante proteína livre de endotoxinas com alto rendimento para ensaios de estimulação de monócitos.

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Este estudo foi apoiado por subvenções do programa de pesquisa médica inovadora intramural da faculdade de medicina da Universidade de Muenster (KE121201 a CK) e da Fundação alemã de pesquisa (DFG, Fo354/3-1 para D.F.).

Nota: Por favor, consulte a tabela complementar 1 para preparação de buffers e soluções de estoque.
1. expressão protéica em E. coli
<ol><li>
Clonagem
	<ol>
<li>Clone tag-free Human S100A12 (seqüência de referência NCBI: NP_ 005612.1) em vetor de expressão bacteriana pET11b. Para expressar a proteína, transforme a construção em E. coli BL21 (de3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultura
	<ol>
<li>Prepare uma cultura inicial inoculando uma única colônia em 5 mL de meio de crescimento (caldo LB com 100 μg/mL de ampicilina) em um tubo de 14 mL de fundo redondo. Incubar durante a noite a 37 ° c com agitação em 220 rpm. Transfira 2 − 4 mL de cultura overnight para 400 mL de meio de crescimento num balão de 2 L Erlenmayer e incubar a cultura a 37 ° c com agitação a 220 rpm. Nota: A densidade inicial da cultura principal deve ser a densidade óptica em 600 nm (OD600) = 0,1.</li>
		<li>Monitore o OD600 durante o crescimento. Induzir a expressão protéica por adição de 1 M de isopropílico-ß-D-tiogalactopyranosid (IPTG) a uma concentração final de 1 mM em OD600 = 0,5 − 0,6. Incubar a 37 ° c e 220 rpm para 4 h adicionais. Nota: Geralmente, um OD600 de 0,6 será alcançado após 1.5 − 2.5 h em 37 ° c.</li>
		<li>Prepare 50 mL de tampão sonication dissolvendo 50 mM Tris, 50 mM NaCl e 1 mM de ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA) em 40 mL de água desionizada. Ajuste o pH com HCl para 8,0 e faça até 50 mL. Adicionar inibidor da protease (1 comprimido por 50 mL de solução) e equilibrar o tampão a 4 ° c.</li>
		<li>Transfira a cultura bacteriana em frascos apropriados do centrifugador e colha as pilhas em 3.200 x g por 30 minutos em 4 ° c. Descarte o sobrenadante e resuma a pelota em 25 mL de tampão de sonicação gelada. Doravante, mantenha as células no gelo. Nota: as células resguardadas podem ser armazenadas a-20 ° c para a curto prazo e a-80 ° c para longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonication/lise
	<ol>
<li>SONICATE as células para 6 ciclos de 30 s no gelo. Após cada ciclo, as células de repouso para 30 − 60 s para proteger as células do superaquecimento.</li>
		<li>Transfira a suspensão da célula para um tubo de centrifugação de alta velocidade pré-refrigerado 50 mL e Centrifugue num rotor de ângulo fixo a 15.000 x g durante 30 min a 4 ° c. Decantar o lisado limpo que contém as proteínas citosómicas solúveis em um tubo de 50 mL fresco e descartar a pelota.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificação de proteínas
<ol><li>Cromatografia de troca aniónica
	<ol>
<li>Diálise<ol>
<li>Prepare a cromatografia de troca aniónica (AIEX) tampão A dissolvendo 20 mM de Tris, 1 mM de EDTA e 1 mM de etileno glicol-bis (2-aminoetilether)-N, N, N ', n'-ácido tetraacético (EGTA) em água desionizada e ajuste o pH para 8,5 com HCl. Para A diálise Prepare 2 x 5 L e para cromatografia 2x 1 L de tampão AIEX A. Nota: O volume do dialisato deve estar em aproximadamente 100 vezes o volume de amostra. Todos os buffers utilizados para cromatografia devem ser filtrados (0,45 μm ou menor) e desgaseificados (por exemplo, por banho Ultrassônico ou vácuo degassing).</li>
			<li>Corte a tubulação da diálise (corte do peso molecular [MWCO]: 3,5 kDa) em um comprimento apropriado com espaço adicional para que o ar assegure a flutuabilidade da amostra acima da barra de giro do stir. Nota: O glicerol preserva a membrana e deve ser removido antes do uso.</li>
			<li>Para reduzir a viscosidade da solução proteica limpa a partir do passo 1.3.2, diluir a solução com 25 mL de tampão AIEX a para facilitar a aplicação subsequente à coluna de cromatografia. Prenda o primeiro fecho no tubo, coloque a amostra na membrana e prenda o segundo fecho pelo menos 1 cm da extremidade superior da tubagem.</li>
			<li>Coloque o recipiente de 5 L com o tampão AIEX a em uma placa de agitação, adicione uma barra de agitação e a membrana preenchida com solução proteica. Ajuste a velocidade para girar a amostra evitando interferências com a barra de agitação rotativa. Dialyze para 12 − 24 h em 4 ° c, a seguir substitua o amortecedor do dialisato (amortecedor a de AIex) por uma preparação pre-cooled fresca e continue por pelo menos 4 horas adicionais. Transfira a solução de proteína Dialítica para um tubo de 50 mL e filtre através de uma unidade de filtro de 0,45 μm. Nota: Armazenamento possível.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cromatografia</li>
		<li>Inicie o sistema de cromatografia líquida (FPLC) com manutenção geral, conecte os buffers de coluna AIEX A e AIEX B (AIEX buffer A com 1 M NaCl) e a resina de troca de ânions contendo coluna. Consulte a tabela 1 para obter parâmetros cromatográficos gerais. Nota: os buffers, a coluna e o equipamento FPLC devem ser equilibrados com a mesma temperatura antes de iniciar a corrida (consultar os parâmetros cromatográficos na tabela 1, tabela 2, tabela 3, tabela 4e tabela 5).</li>
		<li>Equilibrar a coluna com o tampão AIex a, depois carregar a amostra na coluna e eluir as proteínas com um gradiente linear de 0% a 100% tampão de sal alto (AIex B). Consulte a tabela 2 para obter um protocolo de método detalhado.</li>
		<li>Colete 2 mL de frações durante a eluição e analise 10 μL de cada fração em uma eletroforese de gel de poliacrilamida de sódio de 15% com coloração Coomassie (SDS-PAGE). Pool as frações contendo proteína S100A12 para diálise. Nota: O peso molecular de S100A12 é 10.575 da.</li>
	</ol></li>
	<li>Cromatografia de interação hidrofóbica dependente de cálcio (HIC)
	<ol>
<li>Diálise<ol>
<li>Dialyze a solução da proteína de encontro a 20 milímetros Tris, 140 milímetro NaCl, pH 7,5 que segue o procedimento descrito na seção 2.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cromatografia<ol>
<li>Prepare 1 L de tampão de cromatografia HIC A dissolvendo 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 25 mM CaCl2 em água deionizada e ajuste o pH para 7,5. Para HIC tampão B, dissolver 20 mM Tris, 140 mM NaCl e 50 mM EDTA. Ajuste o pH para 7,0 e filtre e Degas os buffers. Adicionar CaCl2 à amostra a uma concentração final de 25 mm e filtrar por 0,45 μm. equilibram os amortecedores HIC e a amostra a 4 ° c (temperatura da coluna).</li>
			<li>Inicie o sistema de cromatografia líquida com manutenção geral, conecte os buffers de coluna HIC A e B e a coluna. Consulte a tabela 3 para obter mais parâmetros cromatográficos.</li>
			<li>Equilibrar a coluna, carregar a amostra e estender o bloco ' lavar amostra não acoplada ' até que o sinal UV atinja o nível basal novamente. Comece então a eluição com um quelante do cálcio que contem o amortecedor (EDTA). Consulte a tabela 4 para obter um protocolo de método detalhado. Nota: As experiências precedentes mostraram que um excesso do cálcio parece ser benéfico para a ligação de S100A12 à resina da cromatografia.</li>
			<li>Colete frações de pico de 2 mL e analise 10 μL de cada fração em uma página de SDS 15% Coomassie manchada. Piscina pura S100A12 frações e Dialize contra HEPES-tampão salino (HBS; 20 mm HEPES, 140 mm NaCl, pH 7,0) como descrito na secção 2.1.1. Nota: o coeficiente de extinção da S100A12 monomérica é 2980 M-1 cm-1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. detecção e remoção de endotoxina
<ol><li>
Detecção de endotoxina
	<ol>
<li>Para determinar a contaminação da endotoxina, medir as concentrações de proteínas diluídas a partir do passo 2.2.2.4. (por exemplo, 1:10 e 1:100 em HBS) usando um ensaio de detecção de endotoxina fluorescente (tabela de materiais) com base em ensaio IMUNOENZIMÁTICO (ELISA). Realize este ensaio seguindo o protocolo do fabricante. Nota: Use soluções HBS recém-preparadas dissolvidas em água desionizada ultrapura para evitar (nova) contaminação por endotoxina pelo tampão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Remoção de endotoxina e concentração de proteínas
	<ol>
<li>Carregar 15 mL de amostra em uma unidade de filtro centrífugo 50 kDa e centrifugar a 3.200 x g e 10 ° c por aproximadamente 10 min. Transfira o fluxo-através em uma embarcação fresca (no gelo) e reabasteça e Centrifugue o tubo do filtro de 50 kda tão frequentemente como necessário. Lave a membrana do filtro duas vezes com HBS para recuperar o máximo de proteína possível após cada passo.</li>
		<li>Concentre o fluxo de contenção de S100A12 usando um filtro centrífugo de 3 kDa até que o volume seja reduzido para um quinto até um décimo do volume de carregamento inicial (centrifugação a 3.200 x g, 10 ° c por aproximadamente 30 min). Encha o filtro sempre que necessário, enxague a membrana e transfira a solução concentrada para um novo tubo após cada recarga. Descarte o fluxo. Filtrar novamente através 50 kDa como descrito acima. Nota: Durante este procedimento, a perda de proteína é notável (até 50%), mas a preparação restante da proteína é esgotada completamente do LPS. Este método rende cerca de 10 − 15 mg de proteína de 400 mL de cultura.</li>
		<li>Ajuste a solução proteica para 1 mg/mL com HBS livre de endotoxina e meça o conteúdo LPS conforme descrito na etapa 3.1.1. Caso a solução proteica ainda não seja testada como livre de LPS (< 0,1 EU/mL), elimine as contaminações remanescentes usando uma resina de remoção de endotoxina. Nota: Com uma concentração proteica de 1 mg/mL, a contaminação de 0,1 EU/mL LPS equivale a aproximadamente 0, 1 pg de proteína LPS/μg.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. separação química da reticulação e do Oligomer
<ol><li>
Reticulação química
	<ol>
<li>Prepare soluções de estoque altamente puras (endotoxina-livres) de 1 M de CaCl2 e 100 mm de ZnCl2 em água desionizada ultrapura (tabela de materiais). Use este buffer, feito recentemente, para a próxima etapa.</li>
		<li>Incubar 10 mL de S100A12 purificados endotoxina-livres (concentração 1 mg/mL em HBS) durante 30 min à temperatura ambiente (RT) com 25 mM de CaCl2 para dimeric/tetrameric, ou 25 mm CAcl2 e 1 mm ZnCl2 para HEXAMERIC/tetrameric S100A12 oligômeros.</li>
		<li>Prepare o chapéu cabeado dissolvendo 8 mgs de BS3 em 500 μL de água endotoxina-livre diretamente antes do uso (o chapéu cabeado de 8 mg para a solução de proteína íon-cravada de 10 ml iguala uma concentração final de 1,4 milímetros). Misture o chapéu cabeado e a amostra introduzindo com pipeta e incubar por 30 minutos adicionais em RT. extinguir a reacção adicionando 1 M de Tris-HCl, pH 7,5 a uma concentração final de 50 mm e filtrar através de 0,45 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cromatografia de exclusão de tamanho
	<ol>
<li>Equilibrar a amostra reticulada a 12 − 15 ° c (temperatura da coluna) e iniciar o sistema de cromatografia líquida com manutenção geral. Conecte o buffer de coluna (HBS) e a coluna de exclusão de tamanho. Consulte a tabela 5 para obter informações detalhadas.</li>
		<li>Equilibram a coluna em HBS, carregam a amostra e coletam frações máximas (1 − 2 mL) durante a corrida. Analise essas frações em um gradiente de 4 − 20% de SDS-PAGE e frações de pool com as principais bandas do complexo proteico desejado. Nota: A hidrólise de reagentes do éster do NHS como BS3 em soluções aquosas conduz a uma absorvância forte em 280 nanômetro. Chapéu cabeado não acoplado (peso molecular: 572 g/mol) elutos no final da corrida e resulta em um pico forte.</li>
		<li>Concentre as soluções utilizando unidades filtrantes centrífugas com MWCOs de 10 kDa (dímero), 30 kDa (tetramer) ou 50 kDa (hexamer). Determine a contaminação da endotoxina conforme descrito na seção 3,1. Se necessário, retire os LPS restantes com uma resina de remoção de endotoxina seguindo as recomendações do fabricante (tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. testes funcionais em monócitos
<ol><li>Preparação de monócitos
	<ol>
<li>Isole monócitos de casacos Buffy humanos por centrifugação de gradiente de densidade e enriquecimento de monócitos subsequente usando um kit de separação de esferas magnéticas (tabela de materiais). Nota: Este protocolo resultará em aproximadamente 5 − 7 x 107 monócitos (um casaco Buffy) com uma pureza de 83 − 95%. Desde que o número, mas igualmente a compreensibilidade das pilhas depende fortemente do doador, o protocolo pode ter que ser escalado acima (dependendo da contagem de pilha exigida).</li>
		<li>Para a centrifugação da densidade, equilibram a solução da separação (densidade = 1, 77 g/mL) a RT e transferem 20 mL em 50 mL de tubos de centrifugação (2 tubos por o revestimento Buffy). Diluir o sangue do casaco Buffy humano com a solução de sal tamponada de Hank (HBSS) para um volume total de 60 mL e camada de 30 mL desta mistura cuidadosamente em cima do meio de separação. Centrífuga a 550 x g por 35 min em RT. desative o freio de centrífuga.</li>
		<li>Após a centrifugação, as células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMCs) estão localizadas diretamente em cima do meio de separação. Transfira estas pilhas em um tubo de centrifugador fresco de 50 mL, faça até 50 mL com HBSS, e Centrifugue-o em 170 x g por 10 minutos aspirar o sobrenadante e ressuscitar a pelota da pilha em um volume pequeno de HBSS introduzindo com pipting.</li>
		<li>Encha o tubo até 50 mL e centrifugue em 290 x g por 10 min. aspirar o sobrenadante novamente, ressuscite as células em hbss (50 ml) e centrifugar a 170 x g por 10 min. contar as células e ressuscite-los em buffer de separação celular (tabela de materiais < /C9 >) a uma concentração de 5 x 107 células/ml. Nota: Em vez de HBSS, salina tampão fosfato (PBS) pode ser usado para lavar as células.</li>
		<li>Para o isolamento de monócitos de PBMCs, use um kit de isolamento magnético de células negativas e siga o protocolo do fabricante. Contagem de monócitos e ressuscição em meio de monócitos (RPMI 1640, 15% de soro de bezerro fetal inativado por calor [FCS], 4 mM L-glutamina, 100 U/mL de penicilina/estreptomicina) a uma concentração de 2 x 106 células/ml.</li>
		<li>Para os monócitos de cultura, os pratos de cultura de revestimento (por exemplo, 100 mm) com um hidrofóbico, filme permeável a gás, adequado para células de suspensão (tabela de materiais). Esterilize as placas usando a luz UV por aproximadamente 30 min. Transfira as pilhas a estas placas da cultura e deixe-as descansar sobre-noite em 37 ° c e em 5% CO2. Nota: Use 15 − 25 mL de suspensão celular por prato revestido.</li>
	</ol></li>
	<li>Estimulação de monócitos
	<ol>
<li>Estimulação com S100A12 (wildtype) Nota: Para distinguir a S100A12 não tratada (produto final da secção 2.2.2) de proteínas reticuladas, S100A12 a seguir é referida como "wildtype".<ol>
<li>Transfira as células descansadas em um tubo centrífugo de 50 mL e centrifugue a 350 x g por 10 min. Aspire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em meio de estimulação (rpmi 1640, 5% de calor-INATIVADO FCS, 4 mm L-glutamina, 100 U/ml de penicilina/ estreptomicina) na concentração de 2 x 106 células/ml.</li>
			<li>Para estimulação, use 24 placas de suspensão bem e adicione 250 μL de suspensão celular por poço (0,5 x 106 células/poço). Adicionar 50 μg/ml de polimixina B aos poços pretendidos, seguidos por LPS em diferentes concentrações (25, 50, 100 e 200 PG/ml) ou tipo selvagem S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/ml). Além disso, aplique a proteína ou não tratada ou calor-desnaturado (99 ° c, 10 min) em diferentes concentrações para as células. Nota: Um tratamento térmico curto desnatura a proteína S100A12 mas tem menos a nenhum efeito em LPs.</li>
			<li>Incubar placas para 4 h a 37 ° c e 5% CO2. Colha as células transferindo a suspensão celular de cada poço para 1,5 mL de tubos de reação. Centrifugador a 500 x g durante 10 min. Transfira os sobrenadantes para tubos frescos e meça a libertação de TNFα em diferentes diluições (por exemplo, 1:2, 1:5, 1:10) com um kit de TNFΑ Elisa humano seguindo as recomendações do fabricante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Estimulação com oligômeros S100A12<ol>
<li>Prepare e semeie monócitos em 24 placas de suspensão bem como descrito acima. Estimular células adicionando oligômeros S100A12 da etapa 4.2.3. em diferentes concentrações molares (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM). Nota: A fim comparar as habilidades dos oligômeros diferentes para estimular monocytes, os oligômeros foram aplicados às pilhas em concentrações comparáveis do molar.</li>
			<li>Incubar por 4 h a 37 ° c e 5% CO2, colher as células e medir a libertação de TNFα nos sobrenadantes como descrito acima.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste protocolo, nós descrevemos a expressão bacteriana tag-livre do S100A12 humano e de sua purificação assim como a separação em oligômeros íon-induzidos diferentes para a estimulação imune da pilha. Comparado à literatura publicada na purificação da proteína S100A128,23,24, o uso de CAcl elevado2 (25 milímetros) na cromatografia hydrofóbica-interação é a nosso conhecimento original. Vários protocolos aplicando conc...

S100A12 é uma proteína de ligação de cálcio que é predominantemente produzida por granulócitos humanos. A proteína é superexpressa durante a inflamação (sistêmica) e seus níveis séricos, particularmente em (auto) doenças inflamatórias como a artrite idiopática juvenil sistêmica (Aijs), a febre familiar do Mediterrâneo (FMF) ou a doença de Kawasaki (KD) pode informar sobre atividade da doença e resposta à terapêutica. Dependendo dos receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), como os receptores Toll-like (TLRs), o sistema imunológico inato pode ser ativado por padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como lipopolissacarídeos (LPS) ou danos associados a padrões moleculares (DAMPs; também denominado ' alarmins '). Os DAMPs são moléculas endógenas, como proteínas celulares, lipídios ou ácidos nucleicos1. As funções húmidas são bem descritas para os membros da família de proteínas calgranulina, S100A8/A9 e S100A122, quetambém são relatados para operar como peptídeos antimicrobianos de quelaçãode íonsmetálicos divalentes3,4, 5,6. Dependendo da força disponível do íon S100A12 lata, como outros membros da família S100, arranja em homomultimers diferentes e até recentemente o impacto de S100A12-oligomerisation no PRR-interação, particular TLR4, era desconhecido.
A forma monomérica da proteína (92 aminoácidos, 10,2 kDa) consiste em duas estruturas de hélice-loop-hélice da EF-mão conectadas por um vinculador flexível. O C-Terminal EF-Hand contem o clássico CA2 +-o motivo obrigatório visto que o N-Terminal EF-Hand exibe uma estrutura prolongada proteína-específica do laço S100 (' pseudo-EF-mão ') e revela a afinidade reduzida de CA2 +-. CA2 +-a ligação por S100A12 pode induzir uma mudança conformacional principal no C-Terminus das proteínas, que conduz à exposição de um remendo hydrofóbico em cada monómero e dá forma à relação do dimerização. Assim, condições fisiológicas, a menor estrutura quaternária formada por S100A12 é um dímero não covalente (aproximadamente 21 kDa), no qual os monómeros individuais estão em orientação antiparalela. Quando arranjado como dímero, S100A12 é relatado para seqüestro Zn2 + , bem como outros íons metálicos divalentes, por exemplo,2 + com alta afinidade7. Estes íons são coordenados na interface de dímero S100A12 por aminoácidos h15 e D25 de uma subunidade e H85, bem como H89 da antiparalelante outra subunidade8,9,10. Enquanto estudos anteriores propõem que Zn2 +-carregado S100A12 pode induzir a organização da proteína em Homo-tetramers (44 kDa) e para resultar em aumento CA2 +-afinidade11,12, recente titulação de metal estudos6 sugerem CA2 +-ligação por S100A12 para aumentar a afinidade da proteína para Zn2 +. Uma vez que os S100A12 EF-hands são ocupados inteiramente por CA2 +, o CA adicional2 + é pensado para ligar entre dímeros, provocando a formação do hexamer (aproximadamente 63 kDa). A arquitetura da estrutura quarternary forma é claramente diferente daquela do tetramer. Propõe-se que a interface do tetrâmero é interrompida para dar origem a novas interfaces dímero-dímero que beneficia a formação de hexamer10. S100A12 é quase exclusivamente expresso por granulócitos humanos, onde constitui cerca de 5% de toda a proteína citosólica13. Em sua função úmida S100A12 foi historicamente descrita como agonista do receptor multiligante para produtos finais de glicação avançada (RAGE), então denominado proteína de ligação à raiva recém-identificada extracelular (EN-RAGE)14. Embora nós relatado mais cedo S100A12-ligação bioquímica a Rage e a TLR415, Nós demonstramos recentemente monócitos humanos para responder à estimulação S100A12 em uma maneira TLR4-dependente16. Isto exige o arranjo de S100A12 em seu ca2 +/Zn2 +-estrutura quarternary forma induzida16.
Aqui nós descrevemos um procedimento da purificação para o S100A12 humano de recombinação e seus oligômeros íon-induzidos para estimulações imunes da pilha16,17. Isso se baseia em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que inicialmente inclui uma coluna de troca de ânions para isolar e concentrar a proteína e remover contaminações em massa (por exemplo, endotoxinas/lipopolissacarídeos)18. Resinas de cromatografia de troca iónica separam proteínas com base em diferentes encargos de superfície líquida. Para proteínas ácidas como S100A12 (ponto isoelétrico de 5,81), um sistema tampão com um pH de 8,5 e uma resina de troca aniónica forte leva a uma boa separação. As proteínas ligadas foram eluidas com um gradiente de tampão de alto sal. Com um aumento de íons negativos de força iônica no tampão de eluição competir com proteínas para cargas na superfície da resina. Proteínas individualmente eluir dependendo de sua carga líquida e em conseqüência disso, os bufferes descritos nisto permitem isolar e concentrar a proteína S100A12 overexpressada. Devido a grupos carregados negativamente em lipopolissacarídeos, essas moléculas também se ligam a resinas de troca de ânions. Entretanto, sua carga líquida mais elevada conduz à eluição mais atrasada no inclinação elevado-sal aplicado. A segunda etapa do procedimento de purificação foi introduzida para fins de polimento. Isto faz uso da capacidade de ligação de cálcio de S100A12 e remove as impurezas remanescentes em uma coluna de interação hidrofóbica. O emperramento do cálcio de S100A12 conduz a uma mudança conformacional e a uma exposição de remendos hydrofóbicos na superfície da proteína. Nessa condição, S100A12 interage com a superfície hidrofóbica da resina. Em cima do cálcio-quelante pelo EDTA, esta interação é invertida. Na presença de íons, especialmente cálcio e zinco, S100A12 organiza em oligomers condição. Para estudar relações estrutura-função dos oligomers diferentes, nós estabilizamos o dimeric, tetramérica e o S100A12 de recombinação forma com um chapéu cabeado químico e separamos os complexos em uma coluna da cromatografia do tamanho-exclusão. Finalmente, para analisar a funcionalidade e a atividade biológica da proteína purificada e seus oligomers íon-induzidos, a liberação do citocinas de S100A12 e de LPs estimulou o monocyte pode ser comparada.
Os vários métodos para purificante S100A12 foram descritos até agora. Jackson et al.19, por exemplo, publicaram um protocolo com purificação por meio de uma coluna de troca de ânions e uma posterior cromatografia de exclusão de tamanho. O polimento de purificação em uma coluna de exclusão de tamanho leva a bons resultados, mas ― devido a, por exemplo, volumes de carregamento limitados ― é menos flexível na escalabilidade. Uma abordagem diferente, publicada por Kiss et al.20, descreve a purificação da proteína etiquetada via coluna Ni2 + Affinity como a primeira etapa de purificação, seguida de clivagem enzimática para remover a tag e outras etapas de purificação. Em contraste com os estudos aforecited19,20, aproteína produzida como descrito neste protocolo é determinada para experiências em pilhas imunes. Conseqüentemente, a contaminação remanescente da endotoxina da cultura bacteriana é um desafio. Embora diferentes abordagens para a remoção da endotoxina tenham sido descritas até o momento, não há um método uniforme que funcione igualmente bem para qualquer solução protéica21,22.
Em resumo, nosso protocolo combina as vantagens de uma expressão tag-free em um sistema bacteriano com remoção eficiente da endotoxina e elevado rendimento da proteína pura.

<table><tbody><tr><td>vetor pET11b</td><td>Novagen</td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>BL21(DE3) competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>100x Aminoácidos não essenciais</td><td>Merck</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>25% HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&minus; 20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina de sódio sal</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis(sulfosuccinimidil)suberato) - 50 mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>Cálcio clorido Dihydrat</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Solução Descolorante</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração Coomassie Briliant Blue R250</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanos</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td>Kit de isolamento de células negativas magnéticas</td></tr><tr><td>EDTA sal dissódico di-hidratado</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>Detecção de endotoxinas ensaio</td></tr><tr><td>Água ultrapura sem endotoxinas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A</td><td>Água ultrapura para preparação de tampões livres de endotoxinas</td></tr><tr><td>EndoTrap red</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>Resina de remoção de endotoxinas</td></tr><tr><td>FBS (inativada pelo calor)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Carl Roth</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (teste de endotoxina de alta qualidade)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alfa - Conjunto OptEia ELISA</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-&szlig;-D-tiogalactopiranosida)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de E. coli O55:B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, humano</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td>Solução de separação (centrifugação por gradiente de densidade)</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Merck</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>Phenyl Sepharose High Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>Resina para cromatografia de interação hidrofóbica</td></tr><tr><td>Polimixina B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos inibidores de protease</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Resina para cromatografia de troca</td></tr><tr><td>aniônica Tampão RoboSep</td><td>Stemcell</td><td>20104</td><td>Tampão de separação celular (seção 5.1.4)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>Merck</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Carl Roth</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de zinco</td><td>Carl Roth</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 &micro; filtro de seringa m</td><td>Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>tubos de fundo redondo de 14 mL</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>balão Erlenmyer de 2 L</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>placas de suspensão de 24 poços</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>copo de medição de 5 L</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>tubos de centrífuga cônicos de 50 mL</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 MWCO 3 kDa</td><td>Unidade de</td><td></td> Filtro Centrífugo Merck UFC900324 <td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 MWCO 50 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Prato de cultura (100 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de diálise</td><td>Closures Spectrum</td><td>132738</td><td></td></tr><tr><td>Ímã EasySep 'The Big Easy'Stemcell</td><td></td> <td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Tubos coletores de fração 5 mL</td><td>Filme Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Lumox, 25 &micro; m, 305 mm x 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>Filme para placas de cultura de monócitos</td></tr><tr><td>Membrana de diálise Spectra/Por (3,5 kDa)</td><td>Spectrum</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de filtro Steritop</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Incubadora (com agitação)</td> <td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Purificador KTA UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC Sistema</td></tr><tr><td>Coletor de frações</td><td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga (com rotor A-4-81)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de ângulo fixo</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>Nanofotômetro</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de fluorescência</td><td>Tecan</td><td>medidor de pH M200PRO</td><td></td>infinito</tr><tr><td></td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação do s100a12 humano e seus oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Neste protocolo, nós descrevemos um método para purificar a proteína cálcio-obrigatória humana S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos da cultura de Escherichia coli para estimulações imunes da pilha. Este protocolo baseia-se em uma estratégia de cromatografia em duas etapas, que compreende a pré-purificação de proteínas em uma coluna de cromatografia de troca de ânions e uma etapa de polimento subsequente em uma coluna de interação hidrofóbica. Esta estratégia produz S100A12 proteína de alta pureza e rendimento a custos gerenciáveis. Para ensaios funcionais em células imunes eventual contaminação de endotoxina remanescente requer monitoramento cuidadoso e mais etapas de limpeza para obter proteína livre de endotoxina. A maioria das contaminações da endotoxina pode ser excluída por cromatografia de troca de ânions. Para esgotar contaminações residuais, este protocolo descreve uma etapa da remoção com filtros centrífugos. Dependendo do íon-força disponível S100A12 pode arranjar em homomultimers diferentes. Para investigar o relacionamento entre a estrutura e a função, este protocolo descreve mais mais o íon-tratamento da proteína S100A12 seguida pelo reticulação químico para estabilizar S100A12 oligômeros e sua separação subseqüente pelo tamanho-exclusão Cromatografia. Finalmente, nós descrevemos um ensaio Cell-Based que confirme a atividade biológica da proteína purified e confirme a preparação LPS-livre.

Após a pré-purificação na coluna AIEX (Figura 1a-C) e subsequente HIC dependente de cálcio (Figura 2a, B), obteve-se proteína altamente pura (Figura 2C). Além, as medidas do endotoxina revelaram a remoção bem sucedida dos LPS. O teor de LPS após AIEX foi medido numa diluição de 1:10 acima do limite de detecção do ensaio, ou seja, acima de 500 EU/mL. Após a primeira filtração através de uma unidade d...

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Este protocolo descreve um procedimento completo de purificação para a proteína de ligação de cálcio humano, S100A12, e em particular, pois são diferentes oligômeros induzidos por íons para implicações de pesquisa a jusante. Com esta técnica, somos capazes de manter o alto rendimento de proteína muito pura e livre de endotoxinas. Ligação e separação química na coluna de cromatografia de exclusão de tamanho é um método convincente para gerar proteínas homo-oligomericas para outros ensaios funcionais.Nossa técnica nos permite aspectos mecanicistas do S100A12 como ligante receptor de reconhecimento de padrões e informações de arte para desenvolver idealmente novas intervenções direcionadas e melhorar os ensaios diagnósticos. Além de assistir a este vídeo, recomendamos uma leitura cuidadosa do protocolo, pois descrevemos um procedimento complexo e multi-passos. Para começar, corte uma tubulação de diálise em um comprimento apropriado, em torno de 30 centímetros, com espaço adicional para o ar.Mergulhe a membrana em água deionizada por 15 a 30 minutos para remover glicerol. Para reduzir a viscosidade da solução de proteínas desmatadas, diluir a solução com 25 mililitros de tampão AIEX A.Conecte o primeiro fechamento na tubulação. Carregue a amostra na membrana e conecte o segundo fechamento a pelo menos um centímetro da extremidade superior da tubulação.Em uma sala resfriada a quatro graus Celsius, coloque o recipiente com tampão AIEX A em uma placa de mexida, adicione uma barra de meximento e a membrana cheia de solução proteica. Ajuste a velocidade para girar a amostra para que não haja interferência na barra de agitação rotativa. Dialise por 12 a 24 horas a quatro graus Celsius, em seguida, substitua o buffer dialisado por buffer pré-resfriado gratuito A e continue por pelo menos quatro horas adicionais.Transfira a solução de proteína dialisada da tubulação para um tubo de 50 mililitros através de uma unidade de filtro de 0,45 míclica. Inicie o FPLC com manutenção geral. Conecte os buffers de coluna AIEX A e AIEX B às válvulas tampão e a resina de troca de ânion contendo coluna para as portas da coluna do FPLC.Ajuste os parâmetros cromatográficos gerais em conformidade. Inicie o programa AIEX no software FPLC e escolha o volume de equilíbrio para buffer A.Posteriormente, carregue a amostra na coluna e elute as proteínas com um gradiente linear de tampão de sal de 0% a 100% de altura. Colete duas frações mililitros durante a eluição.Analise as frações elucidadas após o término da corrida. Para isso, carregue 10 microlitadores de cada fração em uma página de Coomassie manchada de 15% SDS e identifique frações contendo S100A12. Acumule estes S100A12 contendo frações para diálise em soro fisiológico com tampol atrofes.Para continuar a purificação da proteína, após a diálise proteica, adicione um cloreto de cálcio à amostra a uma concentração final de 25 mililitros, o que facilitará a ligação de S100A12 à resina na próxima etapa. Em seguida, filtre a amostra através de um filtro com um tamanho de derramamento de 0,45 mícrons. Equilibre os buffers e amostras de HIC a quatro graus Celsius.Em seguida, conecte os buffers de coluna HIC A e B e a coluna ao sistema e ajuste os parâmetros. Inicie o método para equilibrar a coluna com um a dois volumes de coluna de HIC A tampão e carregue a amostra e o bloco de amostra desvinculado da lavagem com um sinal UV atinge novamente o nível da linha de base. Em seguida, inicie a elução com um quedor de cálcio contendo EDTA tampão.Colete dois mililitros de frações de pico durante a eluição. Depois de analisar 10 microliters de cada fração em uma página de Coomassie manchada de 15% SDS identificar frações puras de S100A12. Acumule essas frações e diálise contra HBS.Primeiro, carregue 15 mililitros de amostra em uma unidade de filtro centrífugo de 50 kilodalton. Centrifugar a 3200 vezes g a 10 graus Celsius por aproximadamente 10 minutos. Transfira o fluxo filtrado para um novo vaso, no gelo.Agora, use um mililitro de HBS para enxaguar a membrana do filtro e para diluição da solução concentrada na ponta do filtro. Centrifugar novamente para recuperar o máximo de proteína possível no fluxo. Para filtrar a solução, repita o carregamento da amostra e a centrifugação quantas vezes for necessário.Em seguida, para concentrar o S100A12 contendo fluxo através, carregue-o em um filtro centrífugo de três quilodalton e centrífuga a 3200 vezes g, 10 graus Celsius por aproximadamente 30 minutos. Agora, o volume é reduzido para 1/5 até 1/10 do volume inicial de carregamento. Transfira a solução concentrada para um novo tubo.Repita o passo de concentração quantas vezes for necessário. Após a ligação química, de acordo com o manuscrito, realize cromatografia de exclusão de tamanho. Equilibre a coluna no HBS, carregue a amostra e colete frações de pico de um a dois mililitros durante a execução.Depois de analisar essas frações em uma página SDS de quatro a 20%, acumule frações com as principais bandas do complexo proteico desejado. Em seguida, concentre as soluções como feito anteriormente. Para isolar monócitos de casacos de buffy humanos por centrifugação gradiente de densidade, primeiro equilibre a solução de separação à temperatura ambiente.Transfira 20 mililitros em tubos de centrífugas de 15 mililitros, dois tubos por casaco de buffy. Diluir o sangue do casaco de buffy humano com HBSS para um volume total de 60 mililitros e camada 30 mililitros desta mistura cuidadosamente em cima do meio de separação. Centrifugar a 550 vezes g por 35 minutos em temperatura ambiente.Desligue o freio da centrífuga. Após a centrifugação, as células sanguíneas periféricas mononucleares estão localizadas diretamente em cima do meio de separação. Com uma pipeta, transfira essas células para um tubo de centrífuga fresco de 50 mililitros.Encha o tubo com HBSS a 50 mililitros e centrífuga a 170 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernatante e resuspenque a pelota de célula em um pequeno volume de HBSS por pipetação. Em seguida, encha o tubo até 50 mililitros e centrífuga a 290 vezes g por 10 minutos.Aspire o supernasso novamente. Resuspengue as células em 50 mililitros de HBSS e centrífuga a 170 vezes g por 10 minutos. Aspire o supernasciente e resuspenque a pelota celular em um pequeno volume de um mililitro de tampão de separação, conte as células e adicione tampão a uma concentração de cinco vezes 10 às sete células por mililitro.Para o isolamento monócito das células sanguíneas periféricas mononucleares, use um kit de isolamento celular negativo magnético e siga o protocolo do fabricante. Use um contador celular automatizado para contar os monócitos e resuspend em meio monócito para uma concentração de duas vezes 10 às seis células por mililitro. Para cultivar monócitos, coloque um prato de cultura celular com um filme permeável de gás hidrofóbico adequado para células suspensas.Coloque as placas sob luz UV por aproximadamente 30 minutos para esterilização. Transfira de 15 a 25 mililitros da suspensão celular para essas placas de cultura e deixe-os descansar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a pré-purificação na coluna AIEX e subsequente HIC dependente de cálcio, obteve-se proteína altamente pura.Como controle adicional, os monócitos humanos foram estimulados com LPS e produziram proteína silvestre. A exposição proteica a diferentes íons resulta em arranjo de diferentes oligômeros S100A12. O aumento das concentrações de zinco induz o arranjo de S100A12 em tetramers e hexamers após a separação na página SDS manchada de quatro a 20% Coomassie.Quando um excesso de íons foi aplicado antes da ligação cruzada, induziu uma mudança pronunciada do equilíbrio oligômero. O S100A12 foi cruzado na presença de 25 milimônios de cálcio ou 25 mililitros de cálcio e um mililitro de zinco. Após a ligação cruzada no tampão HBS com cloreto de cálcio de 25 milimilas e um cloreto de zinco milimila, hexamer e tetramer foram separados.Tetramer e dimer foram separados em tampão HBS com cloreto de cálcio de 25 milialares. Um exemplo de oligômeros agrupados e concentrados após a separação em uma página de SDS de quatro a 15% de gradiente mostra dimer, tetramer e hexamer. A estimulação monócito com hexameric S100A12 resultou em liberação alfa TNF pronunciada.Após a remoção da endotoxina, é importante não reintroduzir a contaminação nas amostras durante a posterior geração e purificação dos oligômeros. A análise a jusante de qualquer processo relacionado à oligomerização S100A12 é concebível. Da mesma forma, podem ser analisados aminoácidos e condições de íons que afetam o processo de oligomerização em si.Atualmente estamos usando oligômeros S100A12 separados de acordo com o protocolo descrito para desenvolver ligantes e anticorpos específicos para bloquear a sinalização da proteína através do TLF4 e para desenvolver e melhorar os ensaios diagnósticos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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