Name: Infecção crônica por Salmonella induzida por fibrose intestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a induzir fibrose intestinal crônica em camundongos usando Salmonella Typhimurium ΔAroA. Este modelo reproduz a doença de Crohn humana, permitindo estudos de mecanismos fibroticos e alvos terapêuticos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Ingrid Barta pelos serviços de histologia.

Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de cuidados com animais da Universidade da Colúmbia Britânica.
1. preparação de culturas de Salmonella typhimurium ΔAroA para gavagem oral de camundongos
<ol><li>De um estoque congelado de glicerol de S. Typhimurium ΔAroA, prepare uma placa de raia usando o agar LB contendo 100 μg/mL de estreptomicina com um laço de inocular estéril. Incubar durante a noite a 37 ° c. As placas de raia podem ser armazenadas até uma semana a 4 ° c.</li>
	<li>Um dia antes da infecção, prepare antibiótico dissolvendo 0,5 g de estreptomicina em 2,5 mL de água. Após o filtro que esterilização a solução da estreptomicina, gavagem oral os ratos usando uma agulha da gavagem 22g bulbo-derrubada e uma seringa de 1 ml com 100 μl da solução da estreptomicina (20 mgs estreptomicina/dose). Usando um laço de inocular, inocular 3 mL de caldo LB (50 μg/mL de estreptomicina) em um tubo de cultura com uma única colônia. Incubar a cultura das salmonelas aerobiamente em 37 ° c durante a noite com agitação em 200 rpm.</li>
	<li>No dia da infecção, prepare a dose final da infecção realizando 2 diluições 1/10 consecutivas de culturas de Salmonella overnight em PBS estéril. Isto resultaria num 100 μL de inum contendo aproximadamente 3 x 106 CFU.</li>
	<li>Usando uma agulha de gavagem 22G com ponta de bulbo e uma seringa de 1 mL, gavagem cada rato com 100 μL da salmonela preparada. Nota: Prepare culturas de salmonelas usando técnicas assépticas. A concentração final da inoculação de Salmonella pode ser verificada por diluições seriadas em agar LB com estreptomicina. A estirpe de S. typhimurium ΔAroA pode ser obtida contactando o professor McNagny (kelly@brc.ubc.ca).</li>
</ol>2. avaliação dos encargos das salmonelas nos tecidos
<ol><li>Prepare 2 mL de bloqueio seguro, microtubos de fundo redondo com 1 mL de PBS estéril e um talão de aço inoxidável autoclavado. Pré-pesar os tubos antes da colheita do tecido.</li>
	<li>Resect cecal e tecidos esplênico de camundongos eutanasiados por exposição a dióxido de carbono. Colete o tecido de animais individuais em tubos separados. Pesar os tubos para determinar os pesos dos tecidos.</li>
	<li>Homogeneizar usando um aparelho misturador moinho para 15 min em 30 Hz. transferir 900 μL de PBS por poço em um megablock de 2 mL de 96-bem. Pipetar 100 μL de homogeneatos de tecido para o primeiro poço, misturar bem e realizar diluições seriadas adicionando 100 μL a poços subsequentes até obter uma diluição de 10-6 . Placa 10 μL de cada diluição em triplicados para o agar LB contendo 100 μg/mL de streptomcyin.</li>
	<li>Conte e multiplique CFU médio por um fator de 100 desde que 10 μL da amostra 1000 μL foram chapeados, e o fator apropriado da diluição. Divida o peso total do tecido CFU por pesos teciduais para determinar CFU por grama de tecido. Nota: manter todas as amostras no gelo ou a 4 ° c durante o processamento do tecido. Use pontas da pipeta do largo-orifício ao executar diluições seriais com homogenates do tecido. Prepare a 96-bem megablock contendo PBS com antecedência.</li>
</ol>3. picrosirius coloração vermelha e quantificação de colágeno.
<ol><li>Fixar tecidos cecais durante a noite em formalina tamponada a 10% e preparar para a incorporação de parafina. Corte cortes de 5 μm para coloração de Picrosirius Red como descrito anteriormente25.</li>
	<li>Capture imagens compostas de seções transversais cecal inteiras em um microscópio do brightfield.</li>
	<li>Abra Fiji (ImageJ) e arraste e solte o arquivo de imagem. tif na barra de ferramentas.</li>
	<li>Na barra de menus, selecione imagem &Gt; tipo &Gt; pilha RGB para dividir a imagem em canais vermelhos, verdes e azuis. Deslize a barra horizontal na parte inferior do painel para definir o canal para verde.</li>
	<li>Abrir imagem &Gt; ajustar > ferramenta limite . Ajuste os limites mínimos e máximos para eliminar quaisquer sinais de fundo. Depois que o limite desejado for definido, feche a ferramenta de limite e vá para analisar &Gt; definir medições. Marque área, fração de área, limite paralimite e rótulo de exibição.
</li>
	<li>Porta a seção de tecido com seleções de FreeHand ou ferramenta de seleções de polígono e medir a área% positiva para colágeno clicando em analisar > medida.</li>
	<li>Normalize a área absoluta positiva para o colagénio que mancha à área do tecido. Nota: Fiji (ImageJ) é um programa de código aberto que pode ser baixado em https://fiji.sc. As imagens com as mesmas condições de captura (por exemplo, brilho e foco) devem ter limites de limiar idênticos para quantificação exata. Se houver qualquer coloração de fundo dentro do tecido selecionado, medir a área absoluta e subtrair-lo da área positiva para o colágeno de todo o tecido.</li>
</ol>

<ol><li>Danese, S., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis.</a> New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).</li>
<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Crohn's disease.</a> The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+inflammatory+bowel+disease+pathogenesis%3A+linking+host+genetics+and+the+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome.</a> Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).</li>
<li>Xavier, R. J., Podolsky, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).</li>
<li>Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+immunopathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).</li>
<li>Ogura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+frameshift+mutation+in+NOD2+associated+with+susceptibility+to+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn's disease.</a> Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).</li>
<li>Jostins, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+have+shaped+the+genetic+architecture+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease.</a> Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).</li>
<li>Rivas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+resequencing+of+GWAS+loci+identifies+independent+rare+variants+associated+with+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease.</a> Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).</li>
<li>Rioux, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+new+susceptibility+loci+for+Crohn+disease+and+implicates+autophagy+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis.</a> Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).</li>
<li>Uhlig, H. H., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+intestinal+inflammation+as+tools+to+understand+the+pathogenesis+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease.</a> European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).</li>
<li>Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+microbiota+on+the+pathogenesis+of+IBD%3A+lessons+from+mouse+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).</li>
<li>Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+enteric+Salmonella+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of enteric Salmonella infections.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).</li>
<li>Barthel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Enteric+Salmonella+Infection+in+Mice+Leads+to+Severe+and+Persistent+Intestinal+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic-dependent+Salmonella+typhimurium+are+non-virulent+and+effective+as+live+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li>
<li>Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+Salmonella+virulence+and+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).</li>
<li>Valdez, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+drives+an+accelerated+inflammatory+response+during+Salmonella-induced+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice.</a> Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).</li>
<li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORalpha+and+group+3+innate+lymphoid+cells+drive+fibrosis+in+a+mouse+model+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn's disease.</a> Science Immunology. 1 (3), eaaf8864(2016).</li>
<li>Burke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrogenesis+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Fibrogenesis in Crohn's disease.</a> American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).</li>
<li>Hogan, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+and+regeneration+of+the+respiratory+system%3A+complexity%2C+plasticity%2C+and+mechanisms+of+lung+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function.</a> Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).</li>
<li>Fiocchi, C., Lund, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Themes+in+fibrosis+and+gastrointestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).</li>
<li>Rieder, F., Fiocchi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis+in+IBD%E2%80%94a+dynamic%2C+multifactorial+process%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).</li>
<li>Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgery+for+adult+Crohn%27s+disease%3A+what+is+the+actual+risk%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Surgery for adult Crohn's disease: what is the actual risk?</a> Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).</li>
<li>Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picrosirius+staining+plus+polarization+microscopy%2C+a+specific+method+for+collagen+detection+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+J%22%5BJournal%5D)">Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections.</a> Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).</li>
<li>Lo, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-22+Preserves+Gut+Epithelial+Integrity+and+Promotes+Disease+Remission+during+Chronic+Salmonella+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection.</a> Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).</li>
<li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IL-13+triggers+TGF-beta1-dependent+tissue+fibrosis+in+chronic+2%2C4%2C6-trinitrobenzene+sulfonic+acid+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).</li>
<li>Fichtner-Feigl, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-13+signaling+via+IL-13R+alpha2+induces+major+downstream+fibrogenic+factors+mediating+fibrosis+in+chronic+TNBS+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis.</a> Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).</li>
<li>Johnson, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+fibrosis+is+reduced+by+early+elimination+of+inflammation+in+a+mouse+model+of+IBD%3A+impact+of+a+%26%2334%3BTop-Down%26%2334%3B+approach+to+intestinal+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a &#34;Top-Down&#34; approach to intestinal fibrosis in mice.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).</li>
<li>Darfeuille-Michaud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+adherent-invasive+Escherichia+coli+associated+with+ileal+mucosa+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).</li>
<li>Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+infection+with+Crohn%27s+disease-associated+adherent-invasive+Escherichia+coli+leads+to+chronic+inflammation+and+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Persistent infection with Crohn's disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis.</a> Nature Communications. 4, 1957(2013).</li>
<li>Imai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellin-mediated+activation+of+IL-33-ST2+signaling+by+a+pathobiont+promotes+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis.</a> Mucosal Immunology. , (2019).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos financeiros de interesse para divulgar.

Nossa compreensão da patogénese de IBD foi aumentada extremamente por modelos do rato da inflamação intestinal. Embora tais modelos individuais não Recapitulem todas as características da doença humana complexa e multifatorial, têm sido úteis na identificação de características-chave da progressão da doença. As estenoses fibrotic associadas com o IBD remanesce uma necessidade clínica não atendidas principal porque os tratamentos atuais são ineficazes em inverter o desenvolvimento da doença. Além disso, a fibrose intestin...

A colite ulcerosa (UC) e a doença de Crohn (DC) são as duas principais formas de DII e são caracterizadas como distúrbios inflamatórios crônicos e recidivantes do trato gastrointestinal 1,2. Estes distúrbios têm um grande impacto na qualidade de vida dos pacientes. Os sintomas de DII incluem dor abdominal, diarreia, náuseas, perda de peso, febre e fadiga3. Estudos recentes identificaram fatores genéticos e ambientais que contribuem para a patogênese da doença; Pensa-se que tais fatores de risco contribuem para a ruptura da barreira epitelial, resultando na translocação ou Superamostragem de antígenos luminais4. Como consequência, isso inicia uma resposta inflamatória aberrante à flora comensal mediada pelas células imunológicas intestinais4. As características das complicações associadas ao IBD podem estender-se a sítios além do trato gastrointestinal que afetam váriosórgãos, incluindoarticulações, pele e fígado1,2. As características da UC incluem inflamação severa e difusa tipicamente localizada no cólon1. A patologia da doença afeta a mucosa e a submucosa do intestino, resultando em ulcerações mucosas superficiais1. Por outro lado, a DC pode afetar qualquer parte do trato gastrointestinal, embora a evidência de doença seja comumente encontrada no cólon e no íleo distal2. Além disso, a inflamação em CD é transmural, afetando todas as camadas da parede intestinal2.
Vários genes de suscetibilidade ao IBD que foram identificados indicariam que a desregulação da barreira epitelial ou imunidade são contribuintes críticos para a progressão da doença5. As mutações no domínio 2 do oligomerização do nucleotide (NOD2) expressada por monócitos foram encontradas para ser associadas com a susceptibilidade aumentada ao CD; Isto destaca uma ligação entre a deteção imune inata alterada de componentes bacterianos e a doença6. Os estudos mais recentes da associação do genoma-largo (GWAS) revelaram as vias adicionais envolvidas potencial na patogénese de IBD que incluem variações genéticas em: STAT1, NKX2-3, IL2RA, IL23R caminhos dependentes ligada à imunidade adaptativa , MUC1, MUC19, e PTGER4 na manutenção da barreira intestinal, e autofagia mediada por ATG16L7,8,9. Embora estes estudos de genética de base populacional tenham melhorado a nossa compreensão do IBD, os alelos de susceptibilidade sozinhos são provavelmente insuficientes para iniciar e sustentar a doença crónica3. Outros fatores não genéticos, incluindo alterações na composição do microbioma intestinal e redução da diversidade, têm sido associados à inflamação intestinal. No entanto, não está claro se a disbiose intestinal precede ou é a consequência de respostas imunes disreguladas3. Embora a etiologia do IBD permaneça obscura, nossa compreensão da patogénese da doença foi aumentada por modelos experimentais do rato da inflamação intestinal10,11. Esses modelos individualmente não representam plenamente a complexidade da doença humana, mas são valiosos para elucidar as vias fisiopatológicas que podem ser relevantes para o DII e para a validação de estratégias terapêuticas tentativas10, o 11. Tais modelos de mouse tipicamente dependem do início da inflamação por indução química ou infecção, transferência de células imunes, ou manipulação genética. Além disso, essas estratégias geralmente envolvem perturbações na integridade epitelial ou modulação da imunidade inata ou adaptativa.
Salmonella enterica Sorovares são patógenos intestinais que podem infectar humanos e camundongos. Após a ingestão, Salmonella pode colonizar o intestino por invasão direta de epithelia, células M, ou antígeno apresentando células12. Camundongos infectados por via oral com S. Typhimurium conduz à colonização primeiramente de locais sistemáticos tais como o spleen e os nós de linfa mesentérica com abundância relativamente baixa no intervalo do soldado12. No entanto, o pré-tratamento de camundongos com estreptomicina aumenta a eficiência da colonização de Salmonella do intestino diminuindo os efeitos protetores do hospedeiro da microbiota normal13. As características patológicas deste modelo incluem o rompimento ou o ulceração da barreira epithelial, do recrutamento do granulocyte, e do edema severo13. Alternativamente, a infecção com a vacina grau S. O mutante de typhimurium δaroa conduz à colonização crônica do ceco e dos dois pontos que persiste até o dia 40 após a infecção14. O S. A estirpe de typhimurium ΔAroA tem um defeito na biossíntese de aminoácidos aromáticos; Isto rende a estirpe do mutante avirulent e pode ser utilizado como uma vacina altamente eficaz15. A infecção oral nos ratos conduz a uma resposta inflamatório associada Th1-e Th17-cytokine, a remodelação extensiva do tecido, e ao depósito do colagénio. A patologia tecidual está associada a níveis elevados de fator pró-fibrótico, como TGF-β1, CTGF e IGF14. A cicatriz fibrótica transmural relatada neste modelo é reminiscente das formações de estenose observadas frequentemente em IBD. A indução de fibrose por Salmonella requer virulência codificada pelas ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPI)-1 e 2 12. É importante, este S. O modelo de infecção por tymphimurium ΔAroA é um sistema útil para o estudo de respostas fibróticas em camundongos mutantes mantidos em um fundo C57/Bl6. A cepa C57/Bl6 é extremamente sensível a S. Infecção de typhiumurim SL1344 devido a uma mutação da perda--função no gene que codifica a proteína de macrófago resistência-associada natural (nramp)-116,17. Nós encontramos que as pilhas lymphoid inata Il-17a e rorα-dependentes são contribuintes importantes à patogénese neste modelo18.
Uma complicação importante do CD é o depósito disregulado e excessivo da matriz extracelular (ECM) que inclui o colagénio2,19. Embora o trato gastrointestinal tenha uma capacidade relativamente alta de regeneração, a cicatrização fibrótica pode surgir devido a respostas decicatrização deferidas não resolvidasque estão associadas à inflamação crônica e severa20,21. Em CD, isso resulta em efeitos deletérios na arquitetura tecidual, levando a comprometimento significativode órgãos21,22. A natureza transmural da inflamação observada em CD, em última análise, precede o espessamento da parede intestinal associada à estenose sintomática ou à formação de estenoses21. Cerca de um terço dos pacientes com CD necessitam de ressecção intestinal para esta complicação22. Não existem terapias antifibróticas efetivas no IBD, dado que o uso de imunossupressores como a azatioprina ou antitnfα biológica não tem impacto ou apenas reduziu modestamente a exigência de intervenções cirúrgicas19,20 . Quando a fibrose for pensada ser a conseqüência da inflamação crônica, as pilhas da origem mesenquimais tais como fibroblasto e pericitos são pensadas para ser as fontes celulares preliminares do ECM em cicatrizes fibrótica21,24. Crônica S. A infecção por ΔAroA de typhimurium é um modelo robusto do rato da fibrose intestinal que pode oferecer introspecções na patogénese de características CD-like.

<table><tbody><tr><td>Tubos de trava de segurança de fundo redondo de 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22363344</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de pipeta de orifício grande</td><td>Fisher</td><td>2707134</td><td></td></tr><tr><td>placas megablock de 2 mL</td><td>Sarstedt</td><td>82.1972.002</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de gavagem</td><td>FST</td><td>18061-22</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>Moinho misturador</td><td>Retsch</td><td>MM</td><td></td></tr></tbody></table>

infecção crônica por salmonella induzida por fibrose intestinal

Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis

A fibrose tecidual caracterizada pelo acúmulo patológico de matriz extracelular, como o colágeno, é o desfecho de inflamação persistente e reparo disregulado. Na doença inflamatória intestinal (DII), a fibrose leva a formações críticas recorrentes para as quais não há nenhuma terapia eficaz além da ressecção cirúrgica. Devido ao seu início tardio, os processos que impulsionam a fibrose são menos estudados e em grande parte desconhecidos. Conseqüentemente, as complicações fibrótica representam um desafio principal no IBD. Neste protocolo, um modelo in vivo robusto de fibrose intestinal é descrito em que o pré-tratamento com estreptomicina de camundongos C57Bl/6 seguidos por gavagem oral com o mutante de Salmonella typhimurium ΔAroA de grau vacinal leva à colonização persistente do patógeno e fibrose do cálio. Metodologias para a preparação de S. O δaroa de typhimurium para a inoculação, quantificando cargas do micróbio patogénico no ceco e no spleen, e avaliando a deposição do colagénio em tecidos intestinais é explicado. Este modelo de doença experimental é útil para examinar os fatores hospedeiros que aumentam ou exacerbam a fibrose intestinal semelhante a um CD.

Tratamento com estreptomicina seguido de infecção oral por S. O δaroa de typhimurium conduz à inflamação e à fibrose intestinais robustas especialmente no ceco (Figura 1). Os fardos patogénicos típicos de 108 a 109 UFC por 1 g de ceco e 104 CFU por 1 g de baço podem ser recuperados de animais infectados (Figura 2). A avaliação da fibrose em secções cecais coradas de picrosirius indica fibrose de pico 21 dias após a infec...

Este protocolo descreve um modelo do rato da fibrose intestinal conduzida salmonela que se assemelha a características patológicas chaves de Crohn ' doença de s que inclui a inflamação e a fibrose transmural. Este método pode ser usado para avaliar os fatores hospedeiros que alteram os desfechos fibróticos usando camundongos mutantes mantidos em um fundo genético C57Bl/6.

Infecção crônica por Salmonella induzida por fibrose intestinal

Tissue fibrosis characterized by the pathological accumulation of extracellular matrix such as collagen is the outcome of persistent inflammation and ...

A fibrose tecidual é a principal forma de os órgãos falharem ao longo do tempo, em resposta à inflamação crônica ou ao envelhecimento. E na verdade, eu diria que se você não morrer de um agente infeccioso ou câncer, você provavelmente morrerá de fibrose de órgãos à medida que envelhece. Infelizmente, não há muitos modelos de ratos ótimos para imitar fibrose de tecido humano.Então o que desenvolvemos é um modelo de camundongo da doença de Crohn, que é uma doença humana que causa fibrose do intestino e é em grande parte intratável. Na verdade, a única maneira de tratá-lo é através da remoção cirúrgica do tecido fibroso e re-ligação do intestino. A vantagem do nosso modelo é que ele é totalmente penetrante em todas as cepas de camundongos e imita muito de perto a doença de Crohn humana e a fibrose persiste por mais de um mês, que é realmente um modelo robusto.A parte mais desafiadora deste procedimento é o manuseio dos camundongos e, especialmente, o gavage oral, uma vez que requer muita prática de certificação especial. Ao realizar este procedimento pela primeira vez, deve-se estar ciente de que trabalhar com Salmonella requer precauções de segurança adequadas e técnica estéril. O de

chronic-salmonella-infection-induced-intestinal-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Estabelecer um modelo de camundongo bacteriana crônica infectados com...

Crônico Salmonella Modelo de camundongos infectados

Modelos experimentais de doença inflamatória intestinal nos permitiram analisar a complexa inata e adaptativa respostas imunes associadas com a patogênese. Usando pontuação histológico, quantificação de citocinas pró-inflamatórias e atividade da mieloperoxidase, pode-se começar a avaliar essas respostas visto na doença inflamatória intestinal.

Investigando inflamação intestinal em DSS-induzida Modelo de IBD

Fonte: Lo, B. C., et al. Fibrose intestinal induzida por infecção crônica por salmonela. J. Vis. Exp. (2019)O vídeo demonstra a quantificação da carga bacteriana em um modelo murino de infecção crônica com Salmonella typhimurium resistente à estreptomicina. Após a eutanásia e dissecação estéril, tecidos cecais e esplênicos são colhidos, homogeneizados com contas de aço para liberar bactérias e diluídos em série. As diluições são placadas em ágar seletivo, e colônias visíveis são contadas para...

Quantificação da Carga Bacteriana Tecidular em um modelo camundongo de infecção intestinal crônica

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

A interrupção do fluxo biliar resulta em lesão hepática colestática inflamatória grave com uma sequência característica de alterações morfológicas dependentes do tempo. Aqui apresentamos um protocolo para a ligadura cirúrgica do ducto colédoco em camundongos que permite induzir uma forte resposta fibrótica após 21 a 28 dias.

Ligadura do ducto biliar em ratos: Indução de Inflammatory Lesão hepática e fibrose por colestase obstrutiva

Neste estudo, nós descrevemos um procedimento detalhado da fibrose intestinal TNBS-negociada, que exibe a patofisiologia comparável à fibrose de Crohn. Nós igualmente discutimos esta aproximação à luz do rapamicina facilitamos efeitos inibitórios na fibrose intestinal.

Visão mecanicista do desenvolvimento da fibrose intestinal mediada por TNBS e avaliação dos efeitos inibitórios da rapamicina

Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

Um modelo murino de exposição fetal à inflamação materna para estudar os efeitos da coioamnionite aguda no desenvolvimento intestinal recém-nascido

O presente protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de colite semelhante a Crohn em roedores. A inflamação transmural leva à estenose no local de instilação do TNBS, e o alargamento mecânico é observado no segmento proximal à estenose. Essas mudanças permitem estudar o estresse mecânico na colite.

Um modelo de roedor induzido pela TNBS para estudar o papel patogênico do estresse mecânico na doença de Crohn

Este protocolo descreve a indução da sepse monobacteriana Gram-negativa em um sistema modelo de rato. O modelo é útil na investigação das respostas inflamatórias e letais do hospedeiro durante a sepse.

Caracterizando Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis em camundongos

Este protocolo demonstra como o modelo de camundongo deficiente em 5'-inositol fosfatase (SHIP) contendo domínio de homologia 2 Src de inflamação ileal e fibrose semelhante à doença de Crohn (DC) pode ser usado para testar novas terapias para DC.

Avaliando intervenções terapêuticas no modelo de camundongo deficiente em SHIP de ileíte e fibrose semelhantes à doença de Crohn

Aprenda a induzir fibrose intestinal crônica em camundongos usando Salmonella Typhimurium ΔAroA. Este modelo reproduz a doença de Crohn humana, permitindo estudos de mecanismos fibroticos e alvos terapêuticos.

Infecção crônica por Salmonella induzida por fibrose intestinal

Explorar mais vídeos