Name: Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a gerar modificações genômicas definidas usando CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas. Este método cria linhagens isogênicas para estudar função gênica e doenças com precisão.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento do Instituto Nacional de coração, pulmão e sangue (NHLBI), institutos nacionais de saúde através de subsídios U01HL099656 (PG e D.L.F.) e U01HL134696 (PG e D.L.F.).

1. projeto e construção do RNA do guia (gRNA)
Nota: cada gRNA é composto de 2 60 pares de base (BP) oligonucleotídeos que são recozidos para gerar um 100 BP duplo encalhado (DS) oligonucleotide (Figura 1a-C). A linha do tempo para o projeto gRNA, geração e eficiência de corte de testes é de aproximadamente 2 semanas (Figura 2).
<ol><li>Selecione a região de DNA de interesse a ser editado pelo genoma e identifique 3-4 23 sequências BP que se encaixam no formato, 5 '-G (N19) NGG-3 '. Essas sequências devem ser localizadas dentro de 20 BP da região de interesse. Observação: a segmentação pode ser realizada no sentido ou na vertente antisense.</li>
	<li>Avalie as sequências de gRNA para redundância genômica e probabilidade fora do alvo usando um recurso como CRISPOR (http://crispor.tefor.net).</li>
	<li>Incorpore a sequência alvo de 20 BP (excluindo o motivo adjacente do protoespaçador ou PAM) em oligonucleotídeos 2 60-Mer como mostrado (as sequências são 5 ' a 3 ' e vermelho e verde são complementos inversos como mostrado na Figura 1C).</li>
	<li>Encomende o 2 60 BP oligonucleotídeos do fornecedor de escolha. Uma vez que os oligonucleotídeos são recebidos, ressuscitem cada um a uma concentração final de 100 μm em DDH2O. faça um estoque de trabalho de 10 μm.</li>
	<li>Anneal os dois oligonucleotídeos e geram um fragmento de dsDNA de 100 BP usando o polymerase do ADN (tabela dos materiais). Combine 5 μL do oligonucleotide dianteiro de 10 μM e 5 μL do oligonucleotide reverso de 10 μM em um tubo da tira da reacção em cadeia do polymerase (PCR) e incubar em 95 ° c por 5 minutos. refrigere a reação por 10 minutos na temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Configurar o PCR como descrito na tabela 1. Realize a amplificação de PCR em um ciclador térmico utilizando os parâmetros descritos na tabela 2.</li>
	<li>Visualize os produtos do PCR em um gel do Agarose do brometo do etídio de 1,5% (w/v) (EtBr) electrophoresed em 80-100 v para 40 min. extirpar a faixa de 100 BP (Figura 3a), visualizado em uma caixa leve do diodo emissor de luz, do gel usando uma lâmina de navalha e purificar usando um gel Kit de extração (tabela de materiais).</li>
</ol>2. projeto de primers do PCR para a seleção
<ol><li>Realize a triagem do DNA editado usando primers de PCR para diante e reverso que são projetados especificamente para amplificar uma região de 400-500 BP do gene de interesse (tabela 2). Use o ADN isolado de toda a linha do iPSC do controle para confirmar um amplicon limpo ao executar o PCR da seleção.</li>
	<li>Visualize produtos do PCR em um gel de 1,5% (w/v) que segue a electroforese em 80-100 V para 1 h. Nota: o sequenciamento de clones editados é realizado usando uma cartilha aninhada que é projetada após a confirmação do conjunto de primer de triagem. As amostras são enviadas para uma fonte comercial para seqüenciamento.</li>
</ol>3. preparação de plasmídeo vetorial gRNA_cloning
<ol><li>Para linearizar o vetor de clonagem, tome um tubo de centrifugação de 1,5 mL e adicione 1-5 μg de DNA do vetor gRNA_cloning juntamente com 4 μL do tampão enzimático de restrição AFLii e 1,5 μL de enzima de restrição AFLII. Coloque a reacção a 24 μL de ddH2o. Misture a reacção introduzindo a pipting para cima e para baixo. Incubar a 37 ° c durante a noite (O/N).</li>
	<li>Electrophorese em um gel do agarose de 1% em 80-100 V para 1 h e as faixas do imposto (o tamanho de faixa esperado são ~ 3519 BP).</li>
	<li>Extraia e purifique como na etapa 1,6.</li>
</ol>4. montagem do vetor gRNA
<ol><li>Configurar reações e montar fragmentos de DNA usando o kit de montagem (tabela de materiais) em 1:5 rácios de AFLII digerido grna clonagem de vetor para 100 BP gel purificada inserir, conforme descrito na tabela 3.</li>
	<li>Incubar a reacção a 50 ° c durante 15 min. diluir a reacção 1:3 em ddH2o e utilizar 3 μl para transformação bacteriana, de acordo com as instruções do fabricante (tabela de materiais). Células de placa em placas de canamicina lb/agar.</li>
	<li>Escolha 3-5 colônias por gRNA. Inocular cada colônia em 4 mL de LB e crescer O/N a 37 ° c em uma incubadora de agitação orbital.</li>
	<li>Purifique o DNA plasmídeo usando um kit de isolamento de plasmídeo protocolo e sequencia cada grna usando os seguintes primers para garantir a clonagem bem-sucedida: forward: gtacaaaaaagcaggctttaaagg; Reverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.</li>
</ol>5. teste gRNA eficiência de corte
<ol><li>HESCs da placa em fibroblastos embrionários murino irradiados (mefs) em uma placa de 6 poços, como descrito previamente21. Quando as células atingem 70-80% de confluência, prepare o Mix mestre de transfecção delineado na tabela 4.</li>
	<li>Misture com pipetagem e incubar em RT durante 15 min. Adicionar gota gota às células e incubar a 37 ° c por 48 h (com uma mudança de mídia após 24 h).</li>
	<li>Células de colheita para classificação após 48 h.<ol>
<li>Remover MEFs enzimaticamente (tabela de materiais) com uma incubação de 3 min RT.</li>
		<li>Lave as células 1x com meio hESC (tabela 5) e raspe em meio hESC + 10 μm Y-27632 dicloridrato de (tabela de materiais).</li>
		<li>Células da pelota a 300 x g por 3 min e ressuscição em 0,5 ml de meio hESC + 10 μm Y-27632 dicloridrato.</li>
		<li>Filtre em um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro de células de 35 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), portão em células ao vivo e classificar as células positivas de proteína verde fluorescente (GFP).</li>
	<li>Transfira um máximo de 1,5 x 104 células ordenadas diretamente em um prato de 10 cm2 revestido com 1:3 matriz de membrana basal (tabela de materiais) e Mefs irradiados em meio hESC (tabela 5) contendo dicloridrato de Y-27632.</li>
	<li>Mude o meio diário usando o meio hESC (tabela 5) sem o dicloridrato de de Y-27632 e escolha manualmente clones após 10-15 dias, quando as colônias são ~ 1 milímetro no diâmetro.<ol>
<li>Usando uma pipeta e um microscópio de P200, raspe com cuidado um único clone e extraia pilhas na pipeta.</li>
		<li>Dispersar as células gentilmente pipetando 3-4x em uma placa de 96 bem no meio elaborado com a colônia.</li>
		<li>Dispense em tubos de tiras de PCR para triagem e pellet as células por centrifugação em 10.000 x g por 5 min. Pick 20 colônias por grna.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. rastreio de clones
<ol><li>Isole o DNA incubando pelotas de células em 20 μL de tampão proteinase K (tabela 5) (1 h a 55 ° c e 10 min a 95 ° c) e vórtice vigorosamente. Centrifugar a 10.000 x g durante 5 min e recolher o sobrenadante.</li>
	<li>Realize a triagem de PCR (seção 2) em um volume total de 20 μL usando uma mistura mestra, incluindo primers projetados para amplificar a região de interesse e 5 μL da síntese de proteinase K. Use o ADN genomic isolado da linha celular que era gene editado como um controle.</li>
	<li>Avalie as alterações de tamanho dos produtos de PCR após 1 h eletroforese a 70-90 V em um gel de agarose 2,5% (w/V) (Figura 3B, C). Qualquer diferença de tamanho é indicativa de clivagem.</li>
</ol>7. edição precisa do genoma em pilhas de haste pluripotentes usando o único ADN do oligo da Costa (ssODNs)
<ol><li>Design 100 BP ssODNs centrado em torno da seqüência gRNA mais eficiente determinado a ter a melhor eficiência de corte.</li>
	<li>Impeça o re-Cleavage do ODN recombined introduzindo mutações silenciosas na seqüência do gRNA. Uma única mutação silenciosa na seqüência PAM é suficiente, mas se não for possível, 3-4 mutações silenciosas funcionarão. Nota: para facilitar a triagem de clones direcionados, a introdução de um local de restrição dentro de ~ 20 BP da seqüência gRNA é ideal.</li>
	<li>Projete um ODN com as mudanças de base desejadas para criar a mutação do interesse e um ODN sem a mudança da base (s). Nota: estas alterações não devem ser mais do que ~ 20 BP do local de corte CRISPR/CAS9 previsto, uma vez que a recombinação cai consideravelmente a distâncias maiores.</li>
	<li>Encomendar os dois ssODNs do fornecedor de escolha e ressuscita na água para fazer 1 μg/μL estoques. Armazene estoques em-20 ° c.</li>
</ol>8. instalação do transfection
<ol><li>Para transfecção o ssodn e os Plasmids de crispr-CAS9, a placa a linha de pilha do alvo em um prato de 6 poços em mefs irradiados para alcangar 70-80% confluência após uma incubação de o/N.</li>
	<li>Configurar a reação de transfecção conforme descrito na tabela 6. Misture a reacção introduzindo pipetagem e incubar durante 15 min em RT. Adicione a mistura de reação de transfecção gota gota às células.</li>
	<li>Após 48 h, prepare as células para classificação de células conforme descrito na seção 5,3.</li>
	<li>Escolha colônias ~ 10 dias após o chapeamento de células individuais usando uma pipeta 200 μL. Transfira 100 μL de células para um poço de uma placa de 24 ou 48 poços previamente revestida com gelatina e MEFs irradiados em meio hESC com dicloridrato de Y-27632. Utilize os restantes 100 μL para isolamento de ADN, conforme descrito na secção 6.</li>
</ol>9. verificação de mutações em colônias únicas
<ol><li>Para verificar a integração bem-sucedida do ssODN, tome 5 μL de DNA isolados de cada colônia para realizar a PCR usando os primers de triagem projetados na seção 2. Purify os produtos do PCR (tabela dos materiais) e prepare a digestão da enzima da limitação usando o local original da enzima criado no ssODN. Nota: esta digestão também inclui o tampão da enzima de restrição e a concentração recomendada pelo fabricante de enzima de restrição num volume de 40 μL.</li>
	<li>Misture a reacção introduzindo pipetagem e incubar a temperatura recomendada pelo fabricante durante 1-3 h.</li>
	<li>Visualize os produtos digeridos do PCR em um gel do Agarose do EtBr de 1,5% (w/v) electrophoresed em 80-100 V para 40 minutos. Se a integração bem-sucedida do ssODN ocorreu, sequencia mutações específicas usando uma cartilha aninhada.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
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<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste protocolo, o uso de CRISPR-CAS9 junto com dois moldes do reparo de ssODN para gerar mudanças heterozygous ou homozygous específicas do genoma é demonstrado em pilhas de haste pluripotentes humanas. Este método conduziu à geração bem sucedida de linhas de pilha isogênicos que expressam mudanças genomic heterozygous com uma eficiência perto de 10%. Este protocolo foi aperfeiçoado para ambos os ESCs e os iPSCs humanos crescidos em MEFs irradiados que apoiam o crescimento e a sobrevivência da pilha após a cultura de pi...

Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são ferramentas valiosas para modelar a doença humana devido à sua capacidade de renovação, mantendo a capacidade de gerar tipos de células de diferentes linhagens1,2 ,3,4. Estes modelos abrem a possibilidade interrogar a função do gene, e compreendem como as mutações e os fenótipos específicos são relacionados às várias doenças5,6. No entanto, para entender como uma alteração específica está ligada a um fenótipo específico, o uso de um controle isogênico pareado e de linhagens celulares mutantes é importante para o controle da variabilidade da linha para a linha7,8. A transcrição ativador-como os nucleases efetoras (TALENs) e os nucleases do dedo do zinco foram usados para gerar mutações da inserção ou do apagamento (indels) em modelos genéticos diversos, incluindo pilhas preliminares; Mas esses nucleases podem ser complicados de usar e caros9,10,11,12,13,14. A descoberta da repetição palindromic curta interespaçada agrupada regularmente (CRISPR)-a nuclease de CAS9 revolucionou o campo devido à eficiência na formação do Indel em virtualmente toda a região do genoma, na simplicidade do uso, e na redução no custo15 , 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , a 19.
Um desafio em usar a tecnologia de edição baseada do genoma de CRISPR-CAS9 foi a geração ou a correção de mutações específicas em um alelo sem criar uma mutação do Indel no segundo alelo20. O principal objetivo deste protocolo é superar esse desafio usando dois modelos de reparo de oligonucleotídeo (ssODN) de cadeia única para reduzir a formação de Indel no segundo alelo. Ambos ssODNs são projetados para conter mutações silenciosas para evitar o re-corte pela nuclease CAS9, mas apenas um contém a alteração de interesse. Este método aumenta a eficiência de gerar uma modificação genética heterozygous específica sem induzir a formação do Indel no segundo alelo. Usando este protocolo, as experiências de edição do gene em seis posições genomic independentes demonstram a introdução exata da mudança genomic desejada em um alelo sem formação do Indel no segundo alelo e ocorre com uma eficiência total de ~ 10%. O protocolo descrito foi adaptado de Maguire et al.21.

<table><tbody><tr><td>Tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml com tampa de filtro de células</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de tecidos de poliestireno de 6 poços</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII endonuclease de restrição</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr>Aparelho <td></td><td></td><td></td><td>classificador de células ativadas por fluorescência (FACS)</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Kit de montagem</td><td>Gibson New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>LB placas de ágar contendo 50 &mu; g / ml de reagente</td> de haste de lipofectamina de canamicina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td> <td>(STEM00001)</td><td></td></tr> <tr><td>Fator de crescimento de matrigel reduzido (TFG)</td> <td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionários murinos (MEFs)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Extração de gel de nucleospin e kit de limpeza de PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação orbital</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCas9_GFP vector</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>tubos de tira PCR</td><td>EUA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade e 5 vezes; Tampão de Phusion</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep</td><td>Kit Invitrogen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen 19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM eletrocompetente Células de Escherichia coli</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC meio</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>dicloridrato de Y-27632/inibidor de ROCK (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de modificações genómicas definidas usando crispr-cas9 em células-tronco pluripotentes humanas

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

As células-tronco pluripotentes humanas oferecem um poderoso sistema para estudar a função gênica e modelar mutações específicas relevantes para a doença. A geração de modificações genéticas heterozygous precisas é desafiante devido à formação negociada do Indel de CRISPR-CAS9 no segundo alelo. Aqui, demonstramos um protocolo para ajudar a superar essa dificuldade usando dois modelos de reparo em que apenas um expressa a mudança de sequência desejada, enquanto ambos os modelos contêm mutações silenciosas para evitar a formação de recorte e INDEL. Esta metodologia é mais vantajosa para a edição de genes codificando regiões de DNA para gerar controle isogênico e linhas de células-tronco humanas mutantes para estudar doenças humanas e biologia. Além disso, a otimização das metodologias de transfecção e triagem foi realizada para reduzir o trabalho e o custo de um experimento de edição de genes. Globalmente, este protocolo é amplamente aplicável a muitos projetos de edição de genoma utilizando o modelo de células-tronco pluripotentes humanos.

Geração de gRNAs e triagem para indels
Cada gRNA será clonado em um vetor de plasmídeo e expressado usando o promotor U6. A enzima de restrição AFLII é usada para linearizar o plasmídeo (addgene #41824) e está localizada após o promotor U6. A faixa de 100 BP gerada após o recozimento do 2 60 BP oligos é clonada no vetor da expressão de gRNA usando o conjunto do ADN. Uma vez que os plasmídeo de grna são gerados, são transfected em hESCs ou em iPSCs junto com um plasmíd...

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

O estudo da função genética e da doença são dificultados pela natureza desaprodução da população humana. Os diferentes antecedentes genéticos das linhas celulares iPS específicas do paciente e controlam o paciente podem afetar a eficiência de diferenciação e fenótipos encontrados em um determinado ensaio funcional. O uso de linhas geneticamente idênticas ou isogênicas onde a única diferença é a mutação particular de interesse é fundamental para superar essas questões.Muitas doenças humanas são causadas por mutações heterozigas, que podem ser difíceis de gerar com o sistema CRISPR-Cas9. Isso se deve à geração de mutações indejadas no alelo não direcionado que podem ocorrer em uma frequência muito alta. Nossa técnica supera esse problema usando dois modelos de reparo dos quais apenas um abriga a mutação de interesse.Qualquer investigador que experimente essa técnica deve ser hábil na cultura de células-tronco pluripotentes humanas. A demonstração de vídeo da colheita de colônias será útil para mostrar o tamanho correto e a morfologia, bem como a técnica usada para a colheita e triagem. Demonstrando este procedimento será Leo Cardenas.Para começar, emplaque eSCs humanos em MEFs irradiados em uma placa de 6 poços. Prepare a mistura mestre de transfecção. Misture por pipetação e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, então, adicione a mistura mestre de transfecção cair sábia a cada poço com células e incubar a 37 graus Celsius por 48 horas. Mude a mídia a cada 24 horas. Para colher as células, primeiro, incubar as células com Triplo E por três minutos à temperatura ambiente para remover mefs enzimaticamente.Adicione 0,5 mililitros de meio HESC com 10 inibidores de ROCK micromolar. Células de pelotas a 300 vezes g por três minutos e rein suspendam em 0,5 mililitros de meio ESC humano com 10 inibidores de ROCK micromolar. Filtre a suspensão celular em um tubo de cinco mililitros através de uma tampa de filtro de célula de 35 mícrons.Usando a triagem celular ativada pela fluorescência, portal em células vivas e classificar as células verdes fluorescentes procedentes. Em seguida, transfira um máximo de 1,5 vezes 10 para as quatro células classificadas diretamente em um prato de 10 centímetros revestido com uma ou três matriz de membrana de porão e MEFs irradiados e meio ESC humano contendo inibidor de ROCHA. Mude o meio diariamente usando o meio ESC humano sem inibidor de ROCHA.Após 10 a 15 dias, as colônias têm aproximadamente um a dois milímetros de diâmetro. Sob um microscópio, use uma pipeta P200 para raspar cuidadosamente um único clone e desenhar células na pipeta. Disperse as células em um poço de uma placa de 96 poços, cano suavemente três a quatro vezes no meio elaborado com a colônia.Em seguida, escolha 20 colônias para cada RNA guia e dispense em tubos de tira PCR para triagem. Pelota as células por centrifugação a 10.000 vezes G por cinco minutos. Agora, incubar pelotas de células em 20 microliters de tampão Proteinase K para isolar DNA e vórtice vigorosamente.Centrifugar a 10.000 vezes G por cinco minutos. Em seguida, realize a triagem pcr do DNA editado. Adicione aos tubos 20 microlitros de uma mistura mestre, incluindo primers dianteiros e invertidos, projetados para amplificar a região de interesse, bem como cinco microlitros do digestor Proteinase K.Use DNA genômico isolado da linha iPSC de controle para confirmar um amplicon limpo ao realizar o PCR de triagem. Avalie as mudanças de tamanho dos produtos PCR após uma hora de eletroforese a 70 a 90 volts em um peso de 2,5% em volume de gel de agarose. Qualquer diferença de tamanho é indicativo de decote.Para transfetar o DNA oligo de fio único e os plasmídeos CRISPR-Cas9, plaque a linha de células-alvo em um prato de 6 poços em MEFs irradiados para atingir 70 a 80% de confluência após uma incubação durante a noite. Configure a reação de transfecção como descrito. Misture a reação por pipetação e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, adicione a mistura de reação de transfecção cair em sabedoria para as células. Depois de 48 horas, prepare as células para a classificação celular como anteriormente. Cerca de 10 dias depois de emplacar células individuais, use uma pipeta de 200 microliter para colher colônias em tubos de tira PCR e em um poço de uma placa de 12 poços pré-revestida com gelatina e MEFs.Transfira 100 microliters das células para cada poço de uma placa de 24 ou 48 poços, previamente revestido com gelatina e MEFs irradiados em meio ESC humano com inibidor de ROCHA. Use os 100 microliters restantes para isolamento de DNA. Para verificar a integração bem-sucedida do DNA oligo de uma única cadeia, pegue cinco microlitros de DNA isolados de cada colônia para realizar PCR usando os primers de triagem previamente projetados.Purifique os produtos PCR e prepare os 40 microliters de digestão enzimada de restrição usando o local enzimádicos único criado no DNA oligo de fio único. Misture a reação por pipetação e incubar na temperatura recomendada pelo fabricante por uma a três horas. Em seguida, visualize os produtos PCR digeridos adicionados com um corante de carga em um peso de 1,5% em volume de gel de agarose brometo de etídio, eletroforese a 80 a 100 volts por 40 minutos.Se ocorreu uma integração bem sucedida do DNA oligo de uma única cadeia, sequencia mutações específicas usando uma cartilha aninhada. Neste estudo, para a construção do RNA guia, uma banda de 100 pares base foi extirpada de um gel de 1,5%. Após a transfecção celular, a validação do corte guia de RNA foi visualizada utilizando-se um gel de 2,5%.Um produto PCR de par base de 180 base mostrou um controle sem cortes e diferentes clones com mudanças de banda indicando formação indeléda. Diferentes guias as RNAs tinham diferentes eficiências de corte. Para evitar o re-corte CRISPR-Cas9 dos alelos editados, a sequência PAM foi modificada usando uma mutação silenciosa G a A.Uma mutação silenciosa na sequência PAM gerou um site de restrição único, que ajuda a rastrear a integração bem sucedida em um ou dois alelos. As linhas de células-tronco editadas pelo genoma podem ser usadas em diferenciações a jusante e ensaios funcionais para estudar o efeito de uma dada mutação no desenvolvimento humano e na doença. Essa metodologia permite a geração de linhas celulares isogênicas com mutações heterozigosas ou homozigosas específicas, implicadas em uma grande variedade de doenças humanas.Esses modelos de doenças abrem caminho para o desenvolvimento de novas terapias celulares, bem como oferecem plataformas para a descoberta de medicamentos.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este vídeo demonstra uma técnica de edição de genoma baseada em nuclease de dedo de zinco em células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Como as hPSCs podem ser potencialmente diferenciadas em vários tipos de células, essa tecnologia é útil para estudos patológicos e farmacológicos in vitro de maneira específica do paciente.

Edição do genoma baseada em nuclease de dedo de zinco: uma técnica para modificar o genoma em células-tronco pluripotentes humanas por mecanismo de reparo dependente de homologia de fita dupla

Ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhoraram muito a eficiência do direcionamento de genes em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Este manuscrito descreve um protocolo para geração de repórter hiPSC específico de linhagem usando recombinação homóloga assistida por sistema CRISPR/Cas.

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

A edição do genoma de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) pode ser feita de forma rápida e eficiente. Apresentado aqui é um procedimento experimental robusto para projetar geneticamente hPSCs, como exemplificado pela edição do locus de porto seguro AAVS1 para expressar EGFP e introduzir resistência a antibióticos.

Estabelecimento de Genoma-editados pluripotentes humanas Lines Stem Cell: A partir de Segmentação de Isolamento

Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.

Genoma Edição e Directed Diferenciação de hPSCs para interrogar Determinantes Lineage no desenvolvimento pancreático humano

Este protocolo descreve detalhadamente a geração de células-tronco livre pegada pluripotentes induzidas (iPSCs) de células do pâncreas humanas em condições de livre de alimentador, seguido pela edição usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas e caracterização de modificado clones de célula única.

Eficiente geração e edição de IPSCs livre de alimentador de células pancreáticas humanas utilizando o sistema CRISPR-Cas9

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Aqui descrito é um protocolo para marcação endogenamente expressas proteínas com etiquetas fluorescentes em células-tronco pluripotentes induzidas humana usando CRISPR/Cas9. Células presumidamente editadas são enriquecidas por fluorescência ativada celular classificação e linhas celulares clonal são geradas.

Proteína endógena de marcação em humanos induzida por células-tronco pluripotentes usando CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas é uma tecnologia poderosa para projetar os genomas complexos de plantas e animais. Aqui, detalhamos um protocolo eficiente editar o genoma humano usando diferentes endonucleases de Cas. Destacamos importantes considerações e parâmetros de projeto para otimizar a eficiência de edição.

Edição do genoma em linhas de células de mamíferos usando CRISPR-Cas

Aqui, descrevemos um método detalhado para edição de genes sem costura em células-tronco pluripotentes humanas usando um plasmídeo doador baseado em piggyBac e o mutante Cas9 nickase. Duas mutações pontuais foram introduzidas no éxon 8 do locus do fator nuclear 4 alfa do hepatócito (HNF4α) em células-tronco embrionárias humanas (hESCs).

Introduzindo mutações pontuais em células-tronco pluripotentes humanas usando edição de genoma contínua

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

O protocolo descreve métodos para edição de epigenoma baseada em Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) em linhagens de células humanas usando transfecção de DNA de plasmídeo e nucleofecção de mRNA.

Edição de Epigenoma CRISPR em Células Humanas usando Transfecção de DNA de Plasmídeo e Entrega de Nucleofecção de mRNA

Aprenda a gerar modificações genômicas definidas usando CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas. Este método cria linhagens isogênicas para estudar função gênica e doenças com precisão.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

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