Micro-fragmentação do tecido adiposo humano para a caracterização do Phenotyping e do Secretome da pilha

Usando este sistema, podemos coletar os aglomerados submeímetros de tecido adiposo humano, no qual todo o microambiente de células regenerativas está intacto. Todo o sistema microvascular também está intacto, e assim podemos usar esse tipo de micro órgãos para transplante in-vivo para cultura in vitro e para isolamento celular para caracterização posterior. A principal justificativa para o uso do sistema no laboratório de pesquisa é que o processo é totalmente livre de enzimas, e por isso permite o processamento rápido e eficiente do tecido adiposo humano mantendo uma microarcização e será a microvasculatura do tecido totalmente intacta.

E assim podemos estudar diretamente um produto de terapia celular que já se mostrou muito útil na clínica. Esta tecnologia de sistema fechado é uma técnica de fácil utilização para colheita, processamento e reinjeção de tecido adiposo refinado intraoperatório, e pode ser aplicada com sucesso em ortopedia cosmética, proctologia e também ginecologia. Este método permite um estudo mais aprofundado do impacto da gordura na regeneração tecidual.

O procedimento será demonstrado por Bianca Vezzani, bolsista de pós-doutorado e por Mario Gomez-Salazar, que é doutorando. Trabalhando em condições assépticas dentro de 16 horas após a colheita, coloque a amostra de abdominoplastia em cima de um pano cirúrgico com a pele voltada para cima. Use uma cânula de infiltração de tecido descartável para injetar de 50 a 100 mililitros de 37 graus Celsius 0,9% de solução de cloreto de sódio no tecido adiposo subcutâneo.

Conecte uma seringa de bloqueio Luer de 10 mililitros a uma cânula de lipoaspiração descartável e agarrando a amostra na região cutânea perto de uma borda da amostra, introduza cuidadosamente a cânula no tecido adiposo. Uma vez que a cânula esteja dentro do tecido, extraia o êmbolo e mova a cânula radialmente dentro da amostra de tecido adiposo. É importante manusear o tecido adiposo firmemente durante a lipo-aspiração.

Se não for coletada gordura suficiente, considere realizar uma injeção salina adicional. Quando a seringa estiver cheia de lipo-aspirado, remova cuidadosamente a cânula do tecido e substitua toda a seringa por uma nova seringa vazia até que um total de 60 mililitros de aspiração tenha sido colhida. Para microfracro da lipo-aspirada, remova o dispositivo da embalagem e verifique se a unidade principal está conectada ao saco de resíduos.

Coloque o saco de coleta de lixo no chão e certifique-se de que as válvulas estejam presas às tampas da unidade de processo. Fure a porta de conexão do saco para conectar o pico terminal da linha de entrada ao saco salino e posicione o saco salino mais alto que a unidade de processamento. Verifique se todos os cinco grampos conectados aos tubos dos circuitos estão abertos, coloque a unidade de processamento em posição vertical, permita que a solução salina preencha a unidade de processamento e confirme que o fluxo atinge o saco de resíduos.

Agite a unidade de processamento para remover quaisquer bolhas de ar e coloque a unidade em uma posição vertical com a tampa azul voltada para cima. Feche o grampo ao lado da linha de entrada e conecte uma seringa de lipo-aspirado à válvula de auto-ocluante da tampa de entrada azul para começar a injetar o lipo-aspirado. Mantendo a unidade de processamento vertical, empurre lentamente para baixo o êmbolo da seringa até que todo o lipo-aspirado tenha sido transferido para a unidade.

Quando toda a lipo-aspirada tiver sido injetada, abra o grampo de entrada para restaurar o fluxo salino e agite vigorosamente a unidade de processamento por pelo menos dois minutos, verificando regularmente o fluxo da solução salina no saco de resíduos. Quando a solução salina na unidade de processamento ficar transparente, coloque a unidade com a tampa cinza para cima e feche os grampos localizados no ralo perto das tampas azul e cinza. O tecido processado flutuará no topo.

Em seguida, encha uma seringa de bloqueio Luer de 10 mililitros com solução salina e conecte a seringa à válvula de carregamento da tampa azul. Conecte uma seringa de bloqueio Luer vazia de 10 mililitros com o êmbolo completamente inserido na válvula da tampa cinza. Injete firmemente o soro fisiológico na unidade de processamento a partir da tampa azul, verificando se a seringa conectada à válvula cinza está, consequentemente, sendo preenchida com o tecido processado.

Quando toda a solução salina tiver sido injetada, remova cuidadosamente ambas as seringas e repita a infusão salina até que todo o tecido processado tenha sido coletado. No final do processamento, remova todas as seringas, feche todos os grampos, retire o saco salino e descarte o dispositivo de acordo com os protocolos locais. Quando todo o tecido processado tiver sido coletado, transfira o tecido adiposo micro-fragmentado para um recipiente estéril e adicione um volume igual de meio de digestão ao recipiente.

Coloque o recipiente selado em um banho de água tremendo de 37 graus Celsius, definido para 120 rotações por minuto durante 45 minutos, parando a digestão com um volume igual de solução de bloqueio no final da incubação. Filtrar sequencialmente a amostra, primeiro através de um filtro de célula de 100 micrômetros seguido de filtração através de um coador de células de 70 micrômetros e centrífugas da suspensão filtrada por cinco minutos a 200 vezes g. Suspendemos a pelota em aproximadamente 5 mililitros de tampão de eritrócito por 15 minutos em temperatura ambiente.

Pare a lise com um volume igual de solução de bloqueio e filtre a solução através de um filtro de célula de 40 micrômetros. Em seguida, colete as células teciduais de adiposos micro-fragmentadas por centrifugação e suspendemos a pelota em solução de bloqueio fresco com mistura de farinha para contar. Após a dissociação e a coloração de anticorpos, células de gordura micro-fragmentadas podem ser levadas ao citômetro de fluxo para análise celular e/ou triagem.

A dissociação mecânica de lipo-aspirados manuais resulta na produção de tecido adiposo micro-fragmentado que consiste em um agregado de adipócitos envolvendo uma rede microvascular. A análise da imunofluorescência da gelatina embutida no tecido adiposo micro-fragmentado criofixado destaca a estrutura, mostrando a rede vascular marcada pelo marcador celular endotelial Ulex Europaeus Agglutinin 1 receptor e consistindo principalmente de pequenos vasos capilares. Notavelmente, pericítes expressando antígeno neuron-glial 2 ou receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas beta são normalmente distribuídos, ensheathing células endoteliais.

Excluindo células endoteliais positivas CD31 e CD45 positivas, a presença de células cancerígenas negativas CD146 e CD146 negativos e CD34 podem ser identificadas dentro do MAT. A lipo-aspiração manual é uma parte crítica do procedimento e deve ser realizada em condições estéreis não mais do que 16 horas após a abdominoplastia. O tecido adiposo micro-fragmentado pode ser processado por coloração imunohistoquímica, cultura in vitro ou análise secretame para obter uma visão mais profunda sobre a biologia do tecido adiposo.

Esta técnica permite o estudo de diversos tecidos em seu arranjo natural, nativo, tridimensional como uma espécie de organoides pequenos, que são pequenos o suficiente para serem transplantados em camundongos ou para serem mantidos em cultura de longo prazo. E usamos esse sistema principalmente para abordar experimentalmente os diferentes microambientes específicos de órgãos. Nossos doadores de tecido adiposo não são conhecidos como portadores de infecções transmissíveis.

No entanto, na ausência de qualquer triagem adicional, todos os tecidos humanos devem ser considerados como potencialmente contaminados e manuseados em conformidade.