Name: Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a gerar cardiomiócitos de alta pureza a partir de HiPSC usando dissociação mecânica e seleção metabólica. Este método simples e confiável permite estudos funcionais e modelagem de doenças cardíacas.

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Esta pesquisa foi apoiada pela AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.); Mount Sinai KL2 Scholars Award for Clinical and Translational Research Career Development KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 e AHA 18TPA34170460 (C.K.).

Os experimentos com cardiomiócitos de ratos adultos neste estudo foram realizados com protocolos aprovados do Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Icahn School of Medicine no Monte Sinai. Os cardiomiócitos de rato adultos foram isolados dos corações de rato DeSprague Dawley pelo método baseado em Langendorff, como descrito anteriormente16.
1. Preparação da Mídia
<ol><li>Prepare a mídia hiPSC.<ol>
<li>Equilibre o suplemento e a temperatura média-sala basal (RT). Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 400 mL do meio basal e 100 mL do suplemento e filtre usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare RPMI + B27.<ol>
<li>Equilibre o suplemento B27 e o meio basal (RPMI 1640) a RT. Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 490 mL do meio basal e 10 mL do suplemento 50x e filtro usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare insulina RPMI + B27 (-)<ol>
<li>Equilibre o suplemento de insulina B27 (-) e o meio basal (RPMI 1640) a RT. Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 490 mL do meio basal e 10 mL do suplemento 50x e filtro usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare mídia de seleção (RPMI (-) glicose + B27 + lactato).<ol>
<li>Equilibre o suplemento B27 e o meio basal (RPMI 1640 (-) glicose) para RT. Certifique-se de que o suplemento tenha descongelado completamente. Misture 490 mL do meio basal e 10 mL do suplemento de 50x, adicione 4 mM lactato de sódio constituído em água estéril e filtre usando um filtro a vácuo de 0,22 μm. Guarde a 4 °C e equilibre-se com a RT antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare rpmi 20.<ol>
<li>Equilibre o meio basal (RPMI 1640) a RT. Misture o soro bovino fetal (FBS) (concentração final de 20%) e RPMI. Filtre usando um filtro e loja a vácuo de 0,22 μm a 4°C. Equilibre a RT antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a mídia de passaging adicionando o inibidor de proteína kinase (2 μM) associado à rho.</li>
	<li>Prepare a mídia D0 adicionando inibidor GSK-3, CHIR 99021 a RPMI + B27 (-) mídia de insulina (final de 10 μM).</li>
	<li>Prepare a mídia D3 e D4 misturando mídia de insulina RPMI + B27 (-) com IWR-1 (5 μM final). NOTA: D1 e D5 mídia é constituída de RPMI + B27 (-) insulina. A mídia D7 é constituída pela RPMI + B27.</li>
	<li>Prepare o buffer de bloqueio (2% de albumina de soro bovina [BSA], 2% FBS, 0,05% NP-40 em soro soro amortecida com fosfato [PBS]): Em um tubo cônico de 50 mL, adicione 1 g de BSA, 1 mL da FBS, 49 mL da PBS e 250 μL da NP-40. Misture até dissolver totalmente.</li>
</ol>2. Preparação de células-tronco embrionárias humanas (hESC) placas revestidas matrix qualificadas e coverslips
NOTA: Executar todas as etapas uma capa de cultura de tecido esterilizado.
<ol><li>Descongelar hESC-qualificado solução de estoque matriz durante a noite no gelo em 4 °C. Consulte a folha de especificação do produto para determinar os volumes apropriados de alíquota, pois isso pode variar dependendo do estoque. Guarde esses alíquos a -20 °C em tubos de microcentrírífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>A fim de usar a matriz para placas de revestimento ou cobres de vidro, primeiro descongele um alibamento da matriz hESC qualificado a 4 °C por 30 min.</li>
	<li>Aliquot 24 mL do meio eagle modificado (DMEM) de Dulbecco frio): mistura de nutrientes F-12 (DMEM/F:12) em um tubo cônico de 50 mL.</li>
	<li>Misture a mídia fria DMEM/F:12 com uma pipeta de vidro de 2 mL para resfriar a superfície da pipeta.</li>
	<li>Usando a mesma pipeta, pegue aproximadamente 500-700 μL de DMEM/F:12 frio e misture com o alibquot de matriz hESC qualificado dentro do próprio tubo de microcentrírífuga.</li>
	<li>Uma vez devidamente misturado, transfira a solução para o tubo cônico de 50 mL contendo o Frio DMEM/F:12 e misture novamente.</li>
	<li>Para uma placa padrão de 6 poços, adicione 1 mL desta mistura para cada poço. Certifique-se de que o poço está totalmente coberto. Deixe as placas em RT debaixo da capa da cultura do tecido por pelo menos 30 min. Se desejar, guarde a 4 °C imediatamente após o revestimento por até 1 semana e equilibre-se para RT por 30 minutos antes do uso.</li>
	<li>Para usar as placas, aspirar a matriz e substituir por meios apropriados. Use imediatamente.</li>
	<li>Guarde os lábios de vidro em um ambiente estéril (por exemplo, dentro de um capuz de cultura de tecido estéril).</li>
	<li>Antes do revestimento, limpe cada coverslip individual com 70% de etanol. Uma vez que o coverslip está seco, coloque-o dentro de um poço de um prato estéril 6 bem.</li>
	<li>Tome 250-300 μL da solução de matriz hESC qualificado e cuidadosamente dispensá-lo diretamente para o centro do coverslip de vidro. Deixe os coverslips em RT debaixo da capa da cultura do tecido por pelo menos 30 min antes do uso.</li>
</ol>3. Preparação de pequenas moléculas
NOTA: Reconstituir todas as pequenas moléculas e moduladores Wnt em DMSO, salvo indicação em contrário.
<ol><li>Prepare 10 mM alíquotas de 25 μL cada um de IWR-1 e CHIR 99021 e armazenar a -20 °C.</li>
	<li>Reconstitua 10 mM aliquots de 50 μL cada um de Thiazovivin (inibidor de ROCHA) e armazenar a -20 °C.</li>
</ol>4. Manutenção e Passaging de iPSCs
NOTA: Executar todos os seguintes passos um capuz de cultura de tecido estéril.
<ol><li>Mantenha os iPSCs em placas de poço padrão 6 e realize todas as etapas condições estéreis. Mantenha as células com 2 mL de mídia hiPSC por poço. Mude a mídia a cada dois dias. Mantenha as células a 37 °C, 6% O2,5% CO2. Passar as células quando elas estiverem entre 70 e 80% de confluentes.</li>
	<li>Equilibre PBS sem Ca2+ e Mg2+ para RT.</li>
	<li>Para iniciar o processo de passaging, adicione 1 mL de PBS sem Ca2 + e Mg2 + para o poço que precisa ser passado. Incubate em RT para 7-10 min. Verifique as células debaixo do microscópio para garantir que o tratamento PBS não resultou em dissociação completa do monocamada.</li>
	<li>Remover PBS e substituir por 1 mL de mídia de passagem. Use um levantador de células para raspar suavemente e levantar as células da superfície do poço.</li>
	<li>Mecanicamente dissociar as células usando uma pipeta de vidro estéril 2 mL. Repita até que as células estejam bem dissociadas uniformemente em pequenas colônias quando observadas um microscópio.</li>
	<li>Uma vez que as células tenham sido suficientemente dissociadas, adicione 5 mL de meios de passagem para dividir as células 1:6. Ajuste a quantidade de meios de passagem a ser adicionados para corresponder à relação de divisão preferida.</li>
	<li>Aspirar a matriz hESC qualificado da placa revestida de matriz hESC qualificado e substituir por 1 mL de mídia de passagem por poço. Adicione 1 mL de células dissociadas por poço.</li>
</ol>5. Diferenciação cardiomiócito
<ol><li>Use linhas hiPSC bem estabelecidas (mais de 20 passagens) e exije uma morfologia homogênea antes de iniciar a diferenciação cardíaca.</li>
	<li>Certifique-se de que os iPSCs sejam cerca de 70 a 80% de confluentes.</li>
	<li>Lave as células 1x em PBS sem Ca2 + e Mg2 +.</li>
	<li>Adicione 2 mL de mídia D0 (passo 1,7) por poço e transfira as células de volta para a incubadora.</li>
	<li>Após 24 h, substituir por 3 mL de mídia D1 por poço para 48 h.</li>
	<li>No dia 3, substituir a mídia com 2 mL de mídia D3 por poço. Repita com a mídia D4 no dia 4.</li>
	<li>No dia 5, substituir a mídia com 3 mL de mídia D5 por poço.</li>
	<li>No dia 7, substituir a mídia com 3 mL de mídia D7 por poço e transferir para uma incubadora com 37 °C, 5% CO2, e concentração o2 normal. Substitua a mídia D7 (RPMI + B27) a cada 2 dias.</li>
</ol>6. Procedimento de seleção e dissociação do iPSC-CM
<ol><li>Dez dias antes de realizar as medições transitórias Ca2+ ou qualquer análise funcional, substitua a mídia RPMI + B27 por 3 mL de mídia de seleção por poço por 48 h.</li>
	<li>Substitua a mídia por 3 mL de mídia de seleção por mais 48 h.</li>
	<li>Substitua a mídia por 2 mL de mídia RPMI + B27 por poço por 24 h.</li>
	<li>Casaco padrão 6 placas de poço, conforme descrito na seção 2.</li>
	<li>Adicione 1 mL de trippsina estéreis de 0,25% com EDTA a cada poço. Incubar a placa a 37 °C por 5 min.</li>
	<li>Usando uma pipeta de 1.000 μL, dissociar mecanicamente as células para que as células individuais possam ser vistas quando observadas um microscópio.</li>
	<li>Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mL e adicione 2 mL de mídia RPMI 20 por poço. Centrífuga por 5 min a 800 x g.</li>
	<li>Assaa o supernatant e resuspende as células na mídia RPMI + B27. Aspirar a matriz hESC qualificado das placas e substituir por 1 mL de mídia RPMI + B27.</li>
	<li>Usando uma ponta de pipeta de 1.000 mL, dissociar mecanicamente a pelota celular até que a solução pareça homogênea.</li>
	<li>Transfira cerca de 500.000 células para cada poço. Transferência para incubadora por 24 h.</li>
	<li>Substitua a mídia por 3 mL de mídia de seleção por poço por 48 h.</li>
	<li>Substitua a mídia por 3 mL de RPMI + B27 por poço. Mantenha as células na mídia D7 (RPMI + B2 mudando a mídia a cada 2 dias até que esteja pronta para análise funcional.</li>
</ol>7. Preparação de iPSC-CMs para citometria flow
<ol><li>Uma vez que as células são da idade desejada e foram submetidos a seleção metabólica (seção 6), lave as células com PBS sem Ca2 + e Mg2 +.</li>
	<li>Adicione 1 mL por poço de trippsina 0,25% e incubar por 5-7 min em 37 °C.</li>
	<li>Pipete a mistura 5-10x com uma ponta P1000 para singularizar as células, e transferir para um tubo de 15 mL contendo 2 mL de RPMI 20.</li>
	<li>Gire as células a 600 x g por 5 min.</li>
	<li>Adicione 100 μL de solução de fixação (4% PFA) à pelota celular. Adicione a solução dropwise com vórtice contínuo, suave e, em seguida, definir no gelo por 15 min.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de PBS. Recolher as células por centrífuga e aspirar o supernatant.</li>
	<li>Para cada experimento, inclua um controle não manchado por fixação/condição de permeabilização.</li>
	<li>Resuspenda as células em 500 μL de solução de bloqueio (2% FBS/2% BSA em PBS com 0,1% NP-40) por 30 min na RT.</li>
	<li>Sem remover a solução de bloqueio, adicione o anticorpo primário MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) e incubar 45 min na RT.</li>
	<li>Lave com tampão de bloqueio. Coletar células por centrífuga e solução aspirada.</li>
	<li>Adicione o anticorpo secundário Alexa Fluor 555/488 (1:750) diluído no buffer de bloqueio por 45 min no RT ou durante a noite em 4 °C.</li>
	<li>Adicione 1,5 mL de PBS. Coletar células por centrífuga e solução aspirada.</li>
	<li>Resuspenda as células em 250-300 μL da PBS. Use uma pipeta P1000 para desagregar as células.</li>
	<li>Prepare tubos de fundo redondocom uma tampa de filtro de célula de malha de nylon de 35 μm. Pré-molhe o filtro celular com 50 μL de PBS e colocou o tubo no gelo.</li>
	<li>Transfira a solução com as células desagregadas para os tubos de fundo redondo com as tampas de filtro celular. Permita que a solução celular escorra naturalmente ou toque no fundo do tubo contra uma superfície plana, conforme necessário, para garantir a drenagem completa e coleta das células no tubo. Certifique-se de definir o tubo de volta no gelo o mais rapidamente possível.</li>
	<li>Lave o filtro celular com 250 μL de PBS para recuperar quaisquer células residuais.</li>
	<li>Mantenha os tubos no gelo e cubra com papel alumínio até a análise de citometria de fluxo.</li>
</ol>8. Cardiomiócitos de revestimento em coverslips de vidro
NOTA: Executar todas as etapas em um ambiente estéril.
<ol><li>Prepare os lábios de vidro, conforme descrito nos passos 2.10 e 2.11.</li>
	<li>Uma vez que os iPSC-CMs foram selecionados e são da idade desejada, siga os passos 6,5-6,7 para dissociar os iPSC-CMs.</li>
	<li>Ascutu o supernatant e resuspende as pilhas em uma quantidade suficiente de meios RPMI 20 para ter aproximadamente 300.000 pilhas por 250 μL.</li>
	<li>Usando uma pipeta de vidro de 2 mL, dissociar mecanicamente a pelota da pilha até que a solução pareça homogênea.</li>
	<li>Aspirar a matriz hESC qualificado s os coverslips.</li>
	<li>Usando uma pipeta 1000 μL, misture e puxe 250 μL da solução do tubo cônico de 15 mL.</li>
	<li>Dispense lentamente os 250 μL da solução para os lábios de vidro, tendo cuidado extra para apenas adicionar à área onde o revestimento de matriz qualificado ao hESC está presente.</li>
	<li>Transfira cuidadosamente para a incubadora e deixe durante a noite, tomando cuidado para não agitar ou espalhar as células nos lábios. Na manhã seguinte, adicione suavemente 2 mL de D7 (RPMI + B27) mídia para cada bem com o coverslip. Mude a mídia depois das 24 h e a cada 2 dias depois disso.</li>
</ol>9. Células fixações
<ol><li>Certifique-se de que uma quantidade adequada de PBS com Ca2 + e Mg2 + é equilibrada para 4 °C.</li>
	<li>Prepare uma solução de paraformaldeído de 4% (PFA) diluída em PBS com Ca2+ e Mg2+ e equilibre-se a 4 °C.</li>
	<li>Uma vez que o iPSC-CMs são de idade adequada, foram submetidos a seleção metabólica (seção 6), e foram banhados em coverslips (seção 8), lave as células 3x com 1 mL de PBS frio com Ca2 + e Mg2 + por poço.</li>
	<li>Adicione 1 mL de FPA frio de 4% e deixe as células em RT debaixo do capô por 15 min.</li>
	<li>Lave as células com PBS frio para remover o excesso de PFA.</li>
	<li>Adicione 2 mL de PBS com Ca2 + e Mg2 + e armazenar a 4 °C.</li>
</ol>10. Manchas de imunofluorescência
<ol><li>Retire pbs das células fixas e adicionar 1 mL de bloqueio buffer. Incubar por 1 h em RT.</li>
	<li>Retire o buffer de bloqueio e adicione o anticorpo primário (5 mg/mL) diluído no buffer de bloqueio. Incubar durante a noite em 4 °C.</li>
	<li>Lave 3x em PBS com Ca2 + e Mg2 + para 5 min cada.</li>
	<li>Adicione o anticorpo secundário diluído no bloqueio do buffer 1:1,000.</li>
	<li>Cubra a placa com papel alumínio para protegê-lo da luz e incubar por 45 min em RT. Mantenha a folha de alumínio para as seguintes etapas.</li>
	<li>Lave 3x em PBS com Ca2 + e Mg2 +, 5 min cada.</li>
	<li>Adicione uma quantidade suficiente de solução de trabalho DAPI para cobrir completamente as células e incubar em RT por 10 min.</li>
	<li>Lave a amostra completamente com PBS com Ca2 + e Mg2 + para remover o excesso de DAPI.</li>
	<li>Pegue novos slides de vidro e adicione uma gota de montagem de mídia no meio. Use o conta-gotas para espalhar uniformemente os meios de montagem. Coloque os lábios com as células de bruços sobre os slides. NOTA: As células podem ser armazenadas por 30 dias se protegidas da luz.</li>
</ol>11. Avaliação dos Transientes Intracelulares Ca2+
<ol><li>Uma vez que os iPSC-CMs têm pelo menos 3 meses de idade, foram submetidos a seleção metabólica (seção 6), e foram banhados em coverslips, tratá-los com 2 μL de Fura-2, AM (concentração final: 1 μM) e incubado em 37 °C para 10 min. NOTA: Fura-2 é sensível à luz. Realize todos os procedimentos de carregamento e experimentos no escuro.</li>
	<li>Prepare o sistema de aquisição e análise de cálcio e contratividade.<ol>
<li>Alimentar o sistema garantindo que a lâmpada de arco seja iniciada(Figura 1B).</li>
		<li>Coloque a câmara no sistema e conecte os tubos da bomba à enseada e saídas apropriadas e ao fio elétrico do estimulador à câmara, como mostrado na Figura 1C.</li>
		<li>Encha o tubo de perfusão que atravessa o aquecedor inline fluido com a solução do Tyrode preaquecido de 37 °C.</li>
		<li>Ajuste a câmera e emoldurar as dimensões da abertura para minimizar a área de fundo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte um coverslip de vidro com iPSC-CMs na câmara e prender.</li>
	<li>Adicione 500 μL da solução do Tirode diretamente em cima do deslizamento de vidro preso suavemente e comece a perfundir a câmara (1,5 mL/min) com a solução do Tirode.</li>
	<li>Pace iPSC-CMs com estimulação de campo de 1 Hz usando o estimulador elétrico (10 V, 4 ms).</li>
	<li>Incubar iPSC-CMs na câmara com estimulação de pelo menos 3-5 min para as células lavarem o corante Fura-2 e se adaptarem ao meio ambiente e lavarem o corante fluorescente.</li>
	<li>Ajuste a janela de visualização para a área superior esquerda do deslizamento de vidro.</li>
	<li>Comece a gravar.</li>
	<li>Depois de coletar um fluxo consistente de 5 a 10 picos, clique em Pausa para parar temporariamente de gravar.</li>
	<li>Garantindo que nem o foco nem as dimensões da janela de visualização sejam alterados, mova o palco do microscópio para a área adjacente, movendo-se em direção ao extremo oposto e retome a gravação.</li>
	<li>Repita os passos 11,9 e 11,10 para digitalizar todo o coverslip, inicialmente se movendo para a esquerda, em seguida, para baixo de uma forma zig-zag para cobrir toda a área coverslip. Isso consiste em 80 a 100 medições por coverslip. NOTA: Restringir o tempo total de medição para 10 min como fatores secundários causar uma diminuição no Ca2 + transitória.</li>
	<li>Uma vez que os transientes Ca+ são adquiridos, analisar os dados com a fluorescência traça software de análise de acordo com as instruções do fabricante.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Passos críticos para o uso de iPSC-CMs humanos como modelos experimentais são: 1) gerando cardiomiócitos de alta qualidade (CMs) que podem garantir o desempenho consistente e resultados reprodutíveis; 2) permitir que as células amadureçam na cultura por pelo menos 90 dias para avaliar adequadamente seu fenótipo; 3) realização de estudos eletrofisiológicos, por exemplo, medidas transitórias de cálcio (Ca2+),para fornecer uma caracterização funcional fisiologicamente relevante de iPSC-CMs humanos. Desenvolvemos ...

Cardiomiócitos pluripotentes induzidos pelo homem (iPSC-CMs) são uma atraente plataforma de base humana para modelar uma grande variedade de doenças cardíacas in vitro1,2,3,5,5,6,7. Além disso, o iPSC-CMs pode ser usado para a previsão de respostas do paciente a medicamentos novos ou existentes, para rastrear compostos de acerto e desenvolver novos medicamentos personalizados9,10. No entanto, apesar dos progressos significativos, várias limitações e desafios precisam ser considerados ao usar o iPSC-CMs11. Consequentemente, métodos para melhorar os protocolos de diferenciação cardíaca, para melhorar a eficiência e maturação do iPSC-CMs e gerar subtipos específicos de cardiomiócitos (ventricular, atrial e nodal) têm sido intensamente estudados e já levaram a inúmeras estratégias culturais para superar esses obstáculos12,13,14,15.
Não obstante a robustez desses protocolos, uma grande preocupação com o uso de iPSC-CMs é a reprodutibilidade de procedimentos longos e complexos para obter cardiomiócitos de alta qualidade que possam garantir o mesmo desempenho e resultados reprodutíveis. A reprodutibilidade é crítica não só quando se compara as linhas celulares com diferentes origens genéticas, mas também ao repetir comparações celulares e moleculares da mesma linha celular. A variabilidade celular, como diferenças bem-a-bem na densidade de iPSCs, pode afetar a diferenciação cardíaca, gerando um baixo rendimento e cardiomiócitos de baixa qualidade. Essas células ainda podem ser usadas para realizar experimentos que não exigem uma população pura de CMs (por exemplo, ao realizar medições transitórias Ca2+). De fato, ao realizar análise eletrofisiológica, os não-CMs não baterão, nem espontaneamente nem estimulação elétrica, por isso será fácil excluí-los da análise. No entanto, devido à má qualidade, os iPSC-CMs podem apresentar características eletrofisiológicas alteradas (por exemplo, modificatórias de Ca2+ transitórias, baixa amplitude Ca2+) que não são devidoà sua composição genética. Portanto, especialmente ao usar iPSC-CMs para modelar doença cardíaca, é importante não confundir os resultados de um CM de má qualidade com o fenótipo da doença. Processos cuidadosos de triagem e exclusão são necessários antes de prosseguir em estudos eletrofisiológicos.
Este método inclui protocolos otimizados para gerar cardiomiócitos de alta pureza e alta qualidade e avaliar sua função realizando medições transitórias Ca2+ usando um sistema de aquisição e análise de cálcio e contraciação. Esta técnica é uma maneira simples, mas poderosa, de distinguir entre preparações de alta eficiência e baixa eficiência do iPSC-CM e fornecer uma caracterização mais fisiologicamente relevante de iPSC-CMs humanos.

<table><tbody><tr><td>Anti-Actina, anticorpo de músculo liso, camundongo monoclonal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti camundongo</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 cabra anti coelho</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>B27 (-) insulina</td><td>Suplemento Gibco</td><td>A18956-01</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>DAPI mancha nuclear</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutamina + 15mM Hepes</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Levantador de células de extremidade dupla, lâmina plana e gancho J</td><td>Celltreat</td><td>229306</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos multipoços Falcon, 6 poços</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor em linha fluídico</td><td>Instrumento de célula viva</td><td>IL-H-10</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2, AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>matriz qualificada por hESC</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Matriz Matrigel</td></tr><tr><td>hPSC mídia</td><td>Gibco</td><td>A33493-01</td><td>StemFlex Basal Medium</td></tr><tr><td>IWR-1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I0161</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de imagem de células vivas</td><td>Instrumento de célula viva</td><td>EC-B25</td><td></td></tr><tr>MLC-2A, <td>sistemas sinápticos</td><td>de anticorpos monoclonais de camundongo</td><td>311011</td><td></td></tr><tr><td>sistema de cálcio e contratilidade de miócitos</td><td>Ionoptix</td><td>ISW-400</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo de cadeia leve de miosina 2, policlonal de coelho (MLC2V)</td><td>Proteintech</td><td>10906-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro descartáveis estéreis de fluxo rápido Nalgene com membrana</td> <td>PESThermoFisher</td><td>124-0045</td><td></td></tr><tr><td>PBS com Cálcio e Magnésio</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS sem Cálcio e Magensium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Lamelas de Cobertura de Vidro Premium</td><td>Lab Scientific</td><td>7807</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>L-lactato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento StemFlex</td><td>Gibco</td><td>A33492-01</td><td></td></tr><tr><td>Tiazovivina</td><td>Tocris</td><td>3845</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>solução de Tyrode</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BSS-355w</td><td>Ajuste o pH em 7,2. Adicione cloreto de cálcio 1,2 mM</td></tr></tbody></table>

geração de cardiomiócitos derivados de hipsc semelhantes ao ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Cardiomiócitos pluripotentes induzidos por células-tronco induzidas pelo homem (iPSC-CMs) fornecem umavaliosa fonte humana para estudar a ciência básica das vias de manuseio e sinalização de células-tronco de alta taxa de consumo, bem como rastreamento de drogas de alta taxa de rendimento e ensaios de toxicidade. Aqui, fornecemos uma descrição detalhada das metodologias usadas para gerar iPSC-CMs de alta qualidade que podem reproduzir consistentemente características moleculares e funcionais em diferentes linhas celulares. Além disso, um método é descrito para avaliar de forma confiável sua caracterização funcional através da avaliação das propriedades de manuseio Ca2+. As condições de baixo oxigênio (O2),a seleção de lactato e o tempo prolongado na cultura produzem cardiomiócitos ventriculares de alta pureza e alta qualidade. Semelhante aos cardiomiócitos de ratos adultos isolados (ARCMs), os iPSC-CMs de 3 meses de idade apresentam maior amplitude Ca2+, taxa mais rápida de recaptação Ca2+ (decay-tau) e uma resposta lusitropical positiva à estimulação β-adrenergizic em comparação com o dia 30 iPSC-CMs. A estratégia é tecnicamente simples, rentável e reproduzível. Ele fornece uma plataforma robusta para modelar a doença cardíaca e para o rastreamento de drogas em grande escala para atingir proteínas de manuseio Ca2+.

O protocolo descrito na Figura 1A gerou cardiomiócitos altamente puros que adquirem um fenótipo ventricular/adulto com o tempo na cultura. Conforme avaliado pela coloração de imunofluorescência para a cadeia de luz reguladora de miosina atrial e ventricular 2 isoformes (MLC2A e MLC2V, respectivamente), a maioria das células geradas por este protocolo foi MLC2A-positivo no dia 30 após a indução de diferenciação cardíaca, enquanto MLC2V foi expressa em quantidades muito mais b...

Aqui descrevemos e validamos um método para gerar consistentemente cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos robustos e caracterizar sua função. Essas técnicas podem ajudar no desenvolvimento de insights mecanicistas sobre as vias de sinalização, fornecer uma plataforma para o rastreamento de medicamentos em larga escala e doenças cardíacas de modelo confiável.

Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

A reprodutibilidade é uma grande preocupação ao induzir cardiomiócitos derivados de células-tronco. Utilizando esses métodos, cardiomiócitos de alta pureza e alta qualidade podem ser gerados a partir de iPS para seu uso em estudos funcionais. A principal vantagem desta técnica é que é um método simples, confiável, econômico e extremamente poderoso para obter preparações purificadas e de alta qualidade de cardiomiócitos derivados do iPSC.Para a passagem celular, enxágue as células com um mililitro de PBS sem cálcio e magnésio por sete a 10 minutos antes de substituir o PBS por um mililitro de meio de passagem. Usando um levantador de células, raspe suavemente as células do fundo dos poços, e use uma pipeta de vidro de dois mililitros para dissociar mecanicamente as células separadas. Quando as células tiverem se levantado em pequenos aglomerados como visíveis sob o microscópio adicione meio de passagem para dividir as células em uma proporção de um a seis.Em seguida, aspire a matriz qualificada de células-tronco embrionárias humanas da placa de seis poços. Em seguida, adicione um mililitro de média de passagem e um mililitro de células dissociadas a cada poço, e deixe as células crescerem até atingirem 70 a 80% de confluência antes de iniciar uma diferenciação cardíaca. Pelo menos 30 minutos antes de dissociar os iPSC-CMs, limpe os deslizamentos individuais de tampa de vidro com 70% de etanol e coloque a tampa em poços individuais de uma placa de seis poços estéril.Quando os deslizamentos de cobertura secarem, adicione uma solução de matriz qualificada de células-tronco embrionárias humanas diretamente no centro de cada deslizamento de cobertura, e coloque a placa de seis poços na capa da cultura tecidual. Para dissociar o iPSC-CM metabolicamente selecionado adicione um mililitro de trippsina estéril de 0,25% com EDTA a cada poço para uma incubação de cinco minutos a 35 graus celsius, e use uma pipeta de 1000 microliter para dissociar mecanicamente as células até que uma única suspensão celular seja alcançada. Puxe as células em tubo cônico estéril de 15 mililitros e lave cada poço com dois mililitros de RPMI 20 médio por poço.Em seguida, adicione as lavagens ao tubo e pelota as células por centrifugação. Resuspend as células em um volume suficiente de meio para alcançar um três vezes 10 para as quintas células por 250 microliters de concentração celular. Use uma ponta de pipeta de 1000 mililitros para dissociar as células até que a solução pareça ser homogênea.Em seguida, aspire 250 microliters de células em uma ponta de pipeta de 1000 microliter, e lentamente distribua todo o volume de solução em um deslizamento de capa codificada de células-tronco embrionárias humanas. Quando todas as células tiverem sido semeadas, coloque cuidadosamente a placa na incubadora de cultura celular durante a noite. Adicione suavemente dois mililitros de média D7 para cada poço na manhã seguinte.Quando os iPSC-CMs selecionados atingem pelo menos três meses de idade, tratam as células com dois microliters de Fura-2 AM por 10 minutos a 37 graus Celsius, e energia no sistema de análise de cálcio. Inicie o ArcLamp e conecte os tubos da bomba à entrada e saídas apropriadas e ao fio eletrônico do estimulador para a câmara. Coloque a câmara no sistema.Encha o tubo ProFusion que atravessa o aquecedor de delineado fluido com 37 graus Celsius aqueceu a solução de Tyrode, e ajuste a câmera e enquadrar as dimensões de abertura para minimizar a área de fundo. Aperte o deslizamento de tampa de vidro semeado com iPSC-CMs na câmara, e adicione suavemente 500 microliters da solução de Tyrode diretamente em cima do deslizamento de tampa. Comece a profusar a câmara com a solução de Tyrode a uma taxa de 1,5 mililitro por minuto, e use um estimulador elétrico para acelerar os iPC-CMs com 1 estimulação de campo Hertz a 10 volts a cada quatro milissegundos por três a cinco minutos.Quando todo o corante tiver sido lavado para fora da câmara, ajuste a janela de visualização para a região superior esquerda do deslizamento da tampa, e comece a gravação. Depois de coletar um fluxo consistente de cinco a 10 picos clique em pausa para parar temporariamente a gravação e mover o estágio do microscópio para uma área adjacente para a extremidade oposta do deslizamento de cobertura antes de retomar a gravação. Depois de digitalizar a transitoriedade de cálcio em toda a cobertura, deslize da mesma forma durante um período de 10 minutos, analise os dados com um software apropriado de análise de vestígios de floresnce de acordo com as instruções do fabricante.Este protocolo gera cardiomiócitos altamente puros que adquirem um fenótipo ventricular, semelhante a um adulto na cultura ao longo do tempo. Conforme avaliado pela coloração imuno fluorescente para as isoformas atrial e ventricular MLC2, a maioria das células geradas por este protocolo são atrial MLC2 isoform positivo no dia 30 após a indução da diferenciação cardíaca. Enquanto isoformes ventriculares MLC2 são expressos em muitos números ao mesmo tempo.À medida que o tempo na cultura aumenta, observa-se uma mudança completa para as isoformas MLC2. Esses dados também foram confirmados pela quantificação citométrica de fluxo da porcentagem de células expressas do marcador MLC2 atrial e ventricular. A amplitude de cálcio é significativamente aumentada nos iPSC-CMs no dia 90, semelhante à observada para CMs de ratos adultos.É importante notar que contaminar células não cardíacas pode influenciar a maturação funcional dos iPSC-CMs humanos durante a diferenciação. Além disso, quando registram transitórios de cálcio em iPSC-CMs é necessário permitir que as células se estabilizem a 37 graus Celsius sob estimulação constante por pelo menos 200 segundos, e restringir as gravações a uma janela de tempo específica para garantir resultados reprodutíveis. Lembre-se de confirmar que os iPSCs apresentam uma morfologia homogênea e para permitir que as células cresçam de 70 a 80% de confluência antes de iniciar uma diferenciação cardíaca.A qualidade pura em cardiomiócitos imaturos derivados do iPS pode apresentar características funcionais alteradas, que não refletem o fenótipo real, mas podem ser mal interpretadas como o fenótipo doente. Portanto, a obtenção de cardiomiócitos puros e de alta qualidade é importante para proporcionar resultados consistentes e reprodutíveis.

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Medicine

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Células-tronco pluripotentes, tanto as células-tronco embrionárias ou pluripotentes induzidas (iPS), constituem uma valiosa fonte de células diferenciadas humanos, incluindo os cardiomiócitos. Aqui, vamos nos concentrar na indução cardíaco de células iPS, mostrando como usá-los para obter os cardiomiócitos humanos funcionais através de um protocolo de corpos baseada embryoid.

Geração de cardiomiócitos Humanos: Um Protocolo de Diferenciação de Feeder livres Humanos células-tronco pluripotentes induzidas

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Vários protocolos foram desenvolvidos e descritos para o isolamento de diferentes tipos de células cardíacas a partir de um coração de rato. Aqui, descreve-se um protocolo otimizado que permite o isolamento de tipos de células cardíacas maiores (cardiomiócitos, células endoteliais e fibroblastos) de alta qualidade de uma única preparação, reduzindo os custos experimentais.

Isolamento Simultâneo de Cardiomiócitos de Alta Qualidade, Células Endoteliais e Fibroblastos de um Coração de Rato Adulto

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar e expandir robustamente os cardiomiócitos humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente.

Geração e Expansão de Cardiomiócitos Humanos a partir de células mononucleares de sangue periféricos do paciente

O presente protocolo descreve o controle totalmente óptico e a observação da atividade celular desencadeada em cardiomiócitos derivados de iPSC (iPSC-CMs) para triagem de drogas de alto rendimento e testes de toxicidade. A quantificação multiparamétrica de padrões fenotípicos no tempo e no espaço é mostrada. Efeitos a longo prazo de drogas ao longo de horas, ou medições sequenciais ao longo dos dias, são demonstrados.

Controle óptico de alto rendimento e registro do sinal de cálcio em cardiomiócitos derivados de iPSC para testes de toxicidade e triagem fenotípica de drogas

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) oferecem uma alternativa ao uso de animais para triagem pré-clínica de cardiotoxicidade. Uma limitação à adoção generalizada de hiPSC-CMs na triagem pré-clínica de toxicidade é o fenótipo imaturo e semelhante ao fetal das células. São apresentados protocolos para maturação robusta e rápida de hiPSC-CMs.

Triagem de cardiotoxicidade de alto rendimento usando monocamadas de cardiomiócitos derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos maduros

Apresenta-se aqui um conjunto de protocolos para a geração e criopreservação de esferoides cardíacos (CSs) de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos cultivados em um formato multidimensional de alto rendimento. Esse modelo tridimensional funciona como uma plataforma robusta para modelagem de doenças, rastreios de alto rendimento e mantém sua funcionalidade após a criopreservação.

Geração, Triagem de Alto Rendimento e Biobanco de Esferoides Cardíacos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Humanos.

Aqui, um método estabelecido é descrito para realizar medidas de contratilidade e cálcio em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos usando uma plataforma óptica. Esta plataforma permite aos investigadores estudar o efeito das mutações e a resposta a vários estímulos de forma rápida e reprodutível.

Medidas em Tempo Real de Parâmetros de Cálcio e Contratilidade em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos Humanos

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

Aprenda a gerar cardiomiócitos de alta pureza a partir de HiPSC usando dissociação mecânica e seleção metabólica. Este método simples e confiável permite estudos funcionais e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio (Vídeo) | JoVE Journal

Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio

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