Name: Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a isolar vesículas extracelulares enriquecidas em exossomos carregando GM-CSF de células-tronco embrionárias. Este protocolo detalhado permite produzir vesículas imunoestimuladoras de alta qualidade para pesquisa.

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Somos gratos ao Sr. Arkadiusz Slusarczyk e à Kentucky Biomedical Research Infrastructure Network (KBRIN, P20GM103436) por adquirir imagens de microscópio eletrônico de transmissão. Este trabalho foi apoiado em parte por subvenções do NIH AA018016-01 (J.W.E.), Commonwealth of Kentucky Research Challenge Trust Fund (J.W.E.), NIH CA106599 e CA175003 (C.L.), NIH CA198249 (K.Y.) e Free to Breathe Research Grant (K.Y.).

1. Culturing células ES-D3
<ol><li>Para gerar soro bovino fetal livre de exosome (FBS), carregue FBS em uma ultracentrifuagem e centrífuga a 100.000 x g por 16 h a 4 °C. Após a centrifugação, colete o supernante soro como FBS sem exosome para a cultura da linha celular ES-D3 e a aquisição de EVs enriquecidos com exosomos.</li>
	<li>Antes de emplacamento das células ES-D3, cubra pratos de cultura tecidual de 15 cm usando gelatina (0,1%) à temperatura ambiente por 30 minutos.</li>
	<li>Seguindo um protocolo descrito anteriormente16,cultura as células ES-D3 sem células de camada alimentador nos pratos de cultura tecidual revestidos de gelatina de 15 cm. O meio de cultura celular ES-D3 é composto por DMEM, FBS livre de exosome (15%), aminoácidos não essenciais (0,1 mM), L-glutamina (2 mM), β-mercaptoetanol (0,1 mM), penicilina (50 unidades/mL), estreptomicina (50 μg/mL) e fator inibidor de leucemia (LIF; 100 unidades/mL). Cultura Células ES-D3 a 37 °C em uma incubadora umidificada de 5% de CO2.</li>
	<li>Uma vez que as células ES-D3 atinjam cerca de 90% de confluência em pratos de cultura tecidual de 15 cm, remova o meio por aspiração. Lave as células usando trippsina (5 mL; 0,05%). Adicione trippsina (5 mL) aos pratos e incubar a 37 °C por 5 min. Pegue as células dos pratos.</li>
	<li>Adicione meio de cultura fresco (5 mL) às células coletadas para inativar a trippsina. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspenda as células em meio fresco e determine o número de células usando um hemócito.</li>
	<li>Para células passantes, emplaque as células ES-D3 (5 x 106) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) de 15 cm com meio fresco (15 mL) e cultura por 3 dias antes de subculturar as células.</li>
	<li>Para coletar a cultura celular supernante para isolamento de EVs enriquecidos com exosome, emplaque as células ES-D3 (1 x 107) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) de 15 cm com meio fresco (15 mL) por 3 dias antes de coletar a cultura celular supernadente.</li>
</ol>2. Geração de plasmídeo de expressão GM-CSF
NOTA: Gere a transfecção plasmid pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpressar GM-CSF em células ES-D3. Neste plasmídeo, a expressão de murine GM-CSF cDNA juntamente com a proteína marcador humanizada Renilla reniformis GFP (hrGFP) é impulsionada pelo fator de alongamento da cadeia de polipeptídeo humano 1α (EF1α) promotor17,18.
<ol><li>Gere a espinha dorsal do vetor.<ol>
<li>Digerir o pEF1α-FD3ER-IRES-hrGFP (20 μg de DNA) utilizando a enzima de restrição EcoRI (100 unidades) a 37 °C por 2 h para gerar dois fragmentos de DNA: a espinha dorsal vetorial (6,0 kb) e a inserção FD3ER (2,5 kb).</li>
		<li>Transfira 50% do DNA plasmídeo digerido (10 μg) em um tubo de microcentrifuso de 1,5 mL e trate com fosfattase alcalina (20 unidades) a 37 °C por 1 h. Resolva o DNA não tratado e desfosforilado usando eletroforese de gel agarose (2%).</li>
		<li>Purificar os fragmentos de DNA da coluna vertebral vetorial (6,0 kb) usando um kit de extração de gel de DNA . Enquanto a espinha dorsal vetorial não tratada servirá como vetor vazio (pEF1α-IRES-hrGFP), a espinha dorsal vetorial desfosforilada será usada para gerar plasmídeos expressos gm-CSF (pEF1α-mGM-CSF-IRES-HRGFP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerar a inserção cDNA GM-CSF.<ol>
<li>Digerir a enzima plasmid pMSCV-mGM-CSF-IRES-EGFP19 (20 μg) utilizando a enzima de restrição EcoRI (100 unidades) a 37 °C para produzir dois fragmentos de DNA: a espinha dorsal vetorial (6,5 kb) e a inserção cDNA murina GM-CSF (474 bp).</li>
		<li>Resolva o DNA digerido através da eletroforese de gel agarose (2%). Purifique o fragmento de cDNA murine GM-CSF (474 bp) usando um kit de extração de gel de DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerar a expressão plasmídeos.<ol>
<li>Configure 2 reações de ligadura (volume total de 10 μL) usando um kit de ligadura de DNA.<ol>
<li>Para gerar o bitor vazio pEF1α-IRES-hrGFP, ligar a espinha dorsal vetorial não tratada da etapa 2.1.3 (6,0 kb; 500 ng).</li>
			<li>Para gerar pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP, ligadurar os seguintes fragmentos de DNA: (1) a espinha dorsal vetorial defosfosfolada da etapa 2.1.3 (6.0 kb; 500 ng) e (2) o fragmento de cDNA mGM-CSF gerado na etapa 2.2.2 (474 bp; 200 ng).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ligate a 25 °C por 5 min. Transforme DNA ligado em células E. coli competentes DH5α. Emplaque as células E. coli transformadas em placas lb-ágar contendo carbenicilina (50 μg/mL).</li>
		<li>Purificar plasmídeos de colônias E. coli usando um kit de isolamento de DNA. Validar as identidades dos plasmídeos por sequenciamento de DNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Geração de células ES-D3 superexpressando GM-CSF
NOTA: Transfeito as células ES-D3 com o pEF1α-mGM-MGM-CSF-IRES-hrGFP para sobreexpressar GM-CS. Cotransfecte o pBabe-Neo plasmídeo em células ES-D3 para facilitar a seleção de células transfectadas18,20.
<ol><li>Transfeito os plasmídeos para as células ES-D3.<ol>
<li>Emplaque as células ES-D3 (1,4 x 106) em um prato de cultura de tecido revestido de gelatina (0,1%) 10 cm com meio cultura (10 mL) para transfecção. Células ES-D3 banhadas à cultura a 37 °C por 24 h.</li>
		<li>Prepare duas misturas de plasmídeos em tubos de microcentrifuus de 1,5 mL: (1) pEF1α-IRES-hrGFP (28 μg, controle vetorial) com pBabe-Neo (4 μg) e (2) pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP (28 μg, expressando GM-CSF) com pBabe-Neo (4 μg). Realizar a transfecção usando um kit de transfecção seguindo o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Adicione o meio de transfecção (1 mL) e o reagente de transfecção (64 μL) a cada tubo contendo as misturas plasmidas e incubar à temperatura ambiente por 5 minutos.</li>
		<li>Adicione as misturas de transfecção aos respectivos pratos de 10 cm de células ES-D3. Incubar a 37 °C por 5 h.</li>
		<li>Substitua o meio em pratos de 10 cm por meio de cultura fresca (10 mL). Incubar a 37 °C por 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerar populações em massa de células ES-D3 transfectadas.<ol>
<li>Remova o meio das células ES-D3 transfeinadas. Lave as células com trippsina (2 mL; 0,05%). Adicione trippsina (2 mL) e incubar a 37 °C por 5 min. Transfira as células para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 2 mL de meio de cultura fresco para neutralizar a trippsina. Centrifugar a 390 x g por 5 min.</li>
		<li>Resuspend as células transfectadas em meio de cultura fresca (10 mL). Avalie a intensidade de fluorescência do GFP em células ES-D3 transfecidas usando a classificação celular ativada por fluorescência (FACS), seguindo o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Transfira as células transfeinadas em dois pratos de 10 cm contendo meio de cultura fresca (10 mL). Adicione neomicina (0,5 mg/mL) para eliminar células não traduzindo.</li>
		<li>Continue a cultivar as células transfeinadas em meio de cultura contendo neomicina (0,5 mg/mL). Quando o ES-D3 transfeinado atingir 90% de confluência, transfira as células para pratos de cultura tecidual de 15 cm novamente. Repita o procedimento por 2 semanas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gerar clones de células ES-D3 transfectadas.<ol>
<li>Uma vez geradas populações em massa de células ES-D3 transfectadas, colecione as células como antes. Determine os números de células usando um hemócito. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspend as células (1 x 107 células/mL) em meio de cultura fresca.</li>
		<li>Filtre as células através de um coador celular estéril de 40 μm. Purifique as células ES-D3 soropositivos usando FACS, seguindo o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Emplaque uma única célula ES-D3 classificada em um poço de uma placa de cultura de tecido revestida de gelatina (0,1%) de 96 poços contendo células ES-D3 parentais (1 x 103) em meio livre de neomicina (200 μL). Co-culminar células ES-D3 transfectadas com suas contrapartes parentais não traduzindo garante que as células ES-D3 únicas transfectadas transfetam e se proliferam como um único clone.</li>
		<li>Cultue as células por 48 h e, em seguida, adicione neomicina (0,5 mg/mL) a placas de 96 poços para eliminar células ES-D3 não transtravas.</li>
		<li>Continue a cultivar as células ES-D3 GFP positivos em placas de cultura tecidual de 96 poços com neomicina média (0,5 mg/mL) durante 1 semana. Transfira linhas de células clonais ES-D3 para antenas de cultura de tecido de 6 cm com meio de cultura (5 mL) contendo neomicina (0,5 mg/mL) durante 1 semana.</li>
		<li>Determine a intensidade da fluorescência GFP em cada um dos clones de células ES-D3 transfectados usando FACS, seguindo o protocolo do fabricante. Selecione os clones ES-D3 expressando GM-CSF ou o vetor vazio com altos níveis de fluorescência verde.</li>
		<li>Determine as quantidades de GM-CSF secretados por células ES-D3 usando um kit MURine GM-CSF ELISA, seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Isolamento de vesículas extracelulares enriquecidas por exosome
<ol><li>Cultura as células ES-D3 (1 x 107) em pratos de cultura tecidual de 15 cm por 72 h a 37 °C. Recolher a cultura celular supernante. Loja coletada supernante a 4 °C até 1 semana para manter a integridade exosmal.</li>
	<li>Centrifugar a cultura celular supernacida a 5.000 x g por 60 min a 4 °C usando uma centrífuga para sedimentar grandes fragmentos celulares.</li>
	<li>Colete o supernatante e a centrífuga a 100.000 x g por 90 min a 4 °C usando uma ultracentrifuagem.</li>
	<li>Remova o supernatante. Enxágue suavemente cada pelota duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS; 1 mL) para remover a cultura residual sobrenatante.</li>
	<li>Resuspend cada pelota na PBS. Quantifique os EVs enriquecidos com exosome por seu teor deproteínas 5.<ol>
<li>Meça a concentração proteica de EVs exossome enriquecidos com um ensaio de ácido bicinchonínico (BCA). O rendimento esperado de EVs exossome enriquecidos de células ES-D3 é de aproximadamente 4 μg de proteína/mL de supernanato da cultura celular. Resuspend os EVs enriquecidos com exosomos em PBS (concentração de proteínas: ~6 μg/μL). Armazene os EVs enriquecidos com exososome a -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caracterização de vesículas extracelulares enriquecidas exóssomeas por microscopia eletrônica de transmissão
NOTA: Investigue a composição e a estrutura dos EVs enriquecidos com exosome isolados dos ESCs usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM)5.
<ol><li>Fixar os EVs enriquecidos com exossome (3-5 μg/μL) com uma concentração final de paraformaldeído de grau EM de 2% à temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Carregar amostras fixas (10 μL) em redes de cobre com filme de suporte a carbono. Incubar as amostras com grades de cobre por 1 min e, em seguida, drenar as grades com papel filtro.</li>
	<li>Manche as grades com uma solução de coloração seguindo o protocolo do fabricante.</li>
	<li>Transfira as grades para um pedaço de papel filtro usando pinças. Deixe as grades secarem durante a noite à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adquira imagens de microscopia eletrônica usando um microscópio eletrônico de transmissão (ampliação de 50.000x), seguindo o protocolo do fabricante.</li>
</ol>6. Avaliação de vesículas extracelulares exosome enriquecidas pela análise de manchas ocidentais
<ol><li>Prepare extratos celulares inteiros.<ol>
<li>Remova o meio das células ES-D3 cultivadas em pratos de 15 cm. Lave as células com trippsina (5 mL; 0,05%). Adicione trippsina (5 mL) às células. Incubar a 37 °C por 5 min. Colete as células e adicione meio de cultura fresco (5 mL) para neutralizar a trippsina. Centrifugar as células a 390 x g por 5 min. Resuspende as células na PBS.</li>
		<li>Determine números de células usando um hemócito. Centrifugar as células novamente a 390 x g por 5 min. Resuspengem as células no buffer de carregamento SDS-PAGE contendo 0,5% de SDS (5.000 células/μL).</li>
		<li>Sonicate as amostras para 10 s usando um sonicator com 10% de amplitude (wattage: 500 W; frequência ultrassônica: 20 kHz). Aqueça as amostras a 100 °C por 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare os lysates de EVs enriquecidos com exosomos.<ol>
<li>Resuspend os EVs enriquecidos com exosomos no buffer de carregamento SDS-PAGE contendo SDS de 0,5% a uma concentração de 1,2 μg/μL.</li>
		<li>Sonicate as amostras para 10 s usando um sonicator com 10% de amplitude (wattage: 500 W; frequência ultrassônica: 20 kHz). Aqueça as amostras a 100 °C por 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detecte proteínas por mancha ocidental.<ol>
<li>Carregar extratos celulares inteiros (10 μL; 5.000 células/μL) e lises EV enriquecidos com exosome (10 μL; 1,2 μg/μL) em cada poço de um gel de PÁGINA Bis-Tris (4-20%). Transfira proteínas para membranas de flúor de polivinilideno (PVDF).</li>
		<li>Incubar membranas com anticorpos primários e secundários apropriados. Anticorpos diluídos (nas concentrações indicadas abaixo) no tampão de manchas contendo PBS, Tween-20 (0,2%) e leite seco sem gordura (10% c/v).<ol>
<li>Use os seguintes anticorpos primários: anti-anexo V (200 ng/mL), anti-CD81 (50 ng/mL), anti-Flotillin-1 (200 ng/mL), anti-citocromome c (100 ng/mL), isomerase anti-proteína dissulfeto (200 ng/mL), anti-GAPDH (33 ng/mL) e anti-Oxphos COX IV-subunit IV (600 ng/mL).</li>
			<li>Use os seguintes anticorpos secundários: anti-coelho de cabra conjugado peroxidase (20 ng/mL) e anti-rato conjugado por peroxidase (20 ng/mL).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Detecte proteínas usando um kit de detecção de quimiominascência aprimorado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Determinando concentrações GM-CSF em vesículas extracelulares exosome enriquecidas pela ELISA
NOTA: Avalie as quantidades de GM-CSF em EVs exosome enriquecidos pela ELISA usando um kit para murine GM-CSF, seguindo o protocolo do fabricante com algumas modificações.
<ol><li>Cubra a placa ELISA com anticorpo de captura. Trate EVs enriquecidos com exosome (0,6 μg) apenas em PBS ou PBS + 0,05% Tween-20 (100 μL) em temperatura ambiente por 30 min. Adicione amostras tratadas à placa ELISA revestida e incubar à temperatura ambiente por 1h. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Adicione anticorpo de detecção às amostras. Incubar em temperatura ambiente por 1h. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20. Adicione Avidin-HRP às amostras. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Lave a placa apenas com PBS ou PBS + 0,05% Tween-20.</li>
	<li>Determine as concentrações de GM-CSF em EVs enriquecidos com exosomos medindo a absorvância a 450 nm em um leitor de microplacas.</li>
</ol>

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Kavitha Yaddanapudi, Chi Li e John W. Eaton apresentaram um pedido de patente dos EUA "Composições que compreendem exosóis embrionários projetados derivados de células-tronco e métodos de uso dela".

Este estudo mostra um método altamente eficiente de produção de EVs enriquecidos com exosomos carregando a proteína imuno-estimulante GM-CSF, que pode ser empregada para estudar os efeitos imuno-modulatórios de EVs enriquecidos com exosomos. Vários estudos sugerem que os exosóis exibem funções imuno-regulatórias e anti-tumores22. Assim, exosóis de ESCs expressando GM-CSF também podem possuir atividades biológicas que regulam a resposta imune. Neste protocolo, o exógeno murine GM-CSF foi expressado...

Os ESCs são derivados do estágio blastocisto de um embrião de pré-implantação1. Como células-tronco pluripotentes, os ESCs têm a capacidade de se auto-renovar e diferenciar-se em qualquer tipo de célula embrionária. Devido ao seu notável potencial de desenvolvimento e capacidade proliferativa a longo prazo, os CES são extremamente valiosos para a pesquisa biomédica1. Os esforços atuais de pesquisa têm se concentrado em grande parte no potencial terapêutico das ESCs para uma variedade de doenças patológicas graves, incluindo diabetes, doenças cardíacas e doenças neurodegenerativas2,3,4.
As células mamíferas, incluindo os ESCs, são conhecidas por liberar vesículas com tamanhos variáveis para o ambiente extracelular, e esses EVs possuem muitas funções fisiológicas e patológicas devido ao seu papel na comunicação intercelular5. Entre diferentes subtipos de EVs, exósmos são pequenas vesículas de membrana liberadas de vários tipos de células para o espaço extracelular após a fusão de compartimentos endocíticos intermediários, corpos multivesiculares (MVBs), com a membrana plasmática6. Exosomos têm sido relatados para mediar a comunicação intercelular e estão criticamente envolvidos em muitos processos (patho)fisiológicos7,8. Exosomos herdam algumas funções biológicas de suas próprias células parentais, porque exosomos contêm materiais biológicos adquiridos a partir do citosol, incluindo proteínas e ácidos nucleicos. Assim, os antígenos ou fatores associados que estimulam a resposta imune específica para uma determinada doença são encapsulados nos exossomos de determinados tipos de células9. Isso abriu caminho para testes clínicos explorando exosóis derivados de tumores como uma vacina anticâncativa10.
GM-CSF é uma citocina secretada por diferentes tipos de células imunes11. Evidências emergentes demonstram que o GM-CSF ativa e regula o sistema imunológico e desempenha um papel essencial no processo de apresentação de antígenos12. Por exemplo, um relatório clínico sugere que o GM-CSF estimula a resposta imune aos tumores como adjuvante da vacina13. Várias estratégias de imunoterapia contra o câncer baseadas em GM-CSF para explorar a potente atividade imuno-estimulante do GM-CSF têm sido investigadas em ensaios clínicos14. Entre elas, uma vacina contra o câncer composta por células tumorais irradiadas de GM-CSF tem mostrado alguma promessa em pacientes com melanoma avançado, induzindo respostas de antitumorais celulares e humorais e necrose subsequente em tumores metástases15.
Como os exosóis derivados de ESCs possuem atividades biológicas semelhantes às ESCs originais, talvez exosósmos portadores de GM-CSF de ESCs possam funcionar como vesículas livres de células para regular a resposta imune. Neste artigo, é descrito um método detalhado para produzir EVs exossome enriquecidos de alta qualidade de ESCs expressando GM-CSF. Esses EVs exosome enriquecidos têm o potencial de servir como vesículas imuno-regulatórias para modular a resposta imune.

<table><tbody><tr><td>Fosfato alcalino, intestino de bezerro</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>Plasmídeo de DNA desfosforilante</td></tr><tr><td>anti-anexina V mAb</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>clone H-3, sc-74438</td><td>Western blot, RRID: AB_1118989</td></tr><tr><td>anti-CD81 mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>Biotecnologia clone B-11, sc-166029</td><td>Western blot, RRID: AB_2275892</td></tr><tr><td>anti-citocromo c mAb</td><td>Santa Cruz Clone de biotecnologia</td><td>A-8, sc-13156</td><td>Western blot, RRID: AB_627385</td></tr><tr><td>anti-Flotillin-1 mAb</td><td>Santa Cruz</td><td>Clone de biotecnologia C-2; sc-74566</td><td>Western blot, RRID: AB_2106563</td></tr><tr><td>anti-GAPDH pAb</td><td>Rockland</td><td>600-401-A33S</td><td>Western blot, RRID: AB_11182910</td></tr><tr><td>IgG anti-camundongo, cabra, conjugado com peroxidase</td><td>Thermo Fisher</td><td>31430</td><td>Western blot, RRID: AB_228307</td></tr><tr><td>anti-Oxphos COX IV-subunidade IV mAb</td><td>Thermo Fisher</td><td>clone 20E8C12 A21348</td><td>Western blot, RRID:AB_221509</td></tr><tr><td>anti-proteína dissulfeto isomerase (PDI) pAb</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-890</td><td>Western blot, RRID:AB_10616242</td></tr><tr><td>anti-coelho IgG, cabra, conjugado com peroxidase</td><td>Thermo Fisher</td><td>31460</td><td>Western blot, RRID:AB_228341</td></tr><tr><td>Ensaio BCA (ácido bicinconínico)</td><td>Thermo Fisher</td><td>23223</td><td>Determinando as concentrações de proteínas</td></tr><tr><td>Bis-Tris PAGE Gel, ExpressPlus, 4-20%</td> <td>Genscript</td><td>M42015</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Carbenicilina, Sal Dissódico Thermo</td><td>Fisher</td><td>10177012</td><td>Selecionando colônias de E. coli</td></tr><tr><td>Centrífuga, Avanti J-26 XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Centrifugação de baixa velocidade</td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga, JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U1597</td><td>Centrifugação de baixa velocidade</td></tr><tr><td>Garrafa de centrífuga, Nalgene PPCO</td><td>Thermo Fisher</td><td>3120-0500PK</td><td>Centrifugação de baixa velocidade</td></tr><tr><td>Grades de com filme de suporte de carbono</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>FF200-</td><td>Aquisição de imagens de microscopia eletrônica</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td>Digestão de plasmídeo de DNA</td></tr><tr><td>Quimioluminescência aprimorada sistema de detecção</td><td>Thermo Fisher</td><td>32106</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>FACScalibur citômetro de fluxo</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Examinando os níveis de GFP de células ES-D3</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>ATCC</td><td>SCRR-30-2020</td><td>Meio para células ES-D3</td></tr><tr><td>Filtros de células estéreis Fisherbrand; Tamanho da malha: 40&mu; m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-547</td><td>Filtragem de células ES-D3 para classificação FACS Gelatina</td></tr><tr><td>(0,1%)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ES006B</td><td>Cultura de células ES-D3</td></tr><tr><td>Kit GM-CSF ELISA Thermo</td><td>Fisher</td><td>88733422</td><td>Determinação das concentrações de GM-CSF</td></tr><tr><td>KnockOut Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>10-829-018</td><td>Medium para células ES-D3</td></tr><tr><td>Fator inibidor de leucemia</td><td>Thermo Fisher</td><td>ESG1106</td><td>Medium para células ES-D3</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>VWR</td><td>VWRL0131-0100</td><td>Medium para células ES-D3</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td>Transfecting ES-D3 cells</td></tr><tr><td>Leitor de microplacas, PowerWave XS</td><td>BioTek</td><td></td><td>Determinação das concentrações de GM-CSF</td></tr><tr><td>MoFlo XDP classificador de células de alta velocidade</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Isolando clones de células ES-D3 individuais</td></tr><tr><td>NEB 5-alfa E. coli competente</td><td>New England Biolabs</td><td>C2988J</td><td>Gerando plasmídeo de expressão GM-CSF</td></tr><tr><td>Neomicina Thermo</td><td>Fisher</td><td>10-131-035</td><td>Seleção de clones ES-D3</td></tr><tr><td>Aminoácidos</td> <td>não essenciaisMeio Thermo Fisher</td><td>SH3023801</td><td>para células ES-D3</td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9022655</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Meio sérico reduzido</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td>Transfecção de células ES-D3</td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica Ciências</td><td>15710</td><td>Aquisição de imagens de microscopia eletrônica</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>VWR</td><td>sc45000-652</td><td>Meio para células ES-D3</td></tr><tr><td>Plasmídeo pEF1a-FD3ER-IRES-hrGFP</td><td>Addgene</td><td>37270</td><td>Gerando membranas de PVDF de plasmídeo de expressão GM-CSF</td></tr><tr><td></td><td>Millipore EMD</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>Gerando plasmídeo de expressão GM-CSF</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel QIAquick (50)</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>Geração de plasmídeo de expressão GM-CSF</td></tr><tr><td>Kit de ligação rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Geração de plasmídeo de expressão GM-CSF</td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>Hitachi</td><td>HT7700</td><td>Aquisição de imagens de microscopia eletrônica</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>VWR</td><td>45000-660</td><td>Cultura de células ES-D3</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga, OptimaTM L-100 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>High centrifugação de velocidade</td></tr><tr><td>Rotor de ultracentrífuga, 45Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>09U4454</td><td>Centrifugação de alta velocidade</td></tr><tr><td>Garrafa de policarbonato de ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>355622</td><td></td></tr><tr><td>Solução de coloração de alta velocidade UranyLess</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>22409</td><td>Aquisição de imagens de microscopia eletrônica</td></tr></tbody></table>

isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias

Isolation of Exosome-Enriched Extracellular Vesicles Carrying Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor from Embryonic Stem Cells

As células-tronco embrionárias (ESCs) são células-tronco pluripotentes capazes de auto-renovação e diferenciação em todos os tipos de células embrionárias. Como muitos outros tipos de células, os ESCs liberam pequenas vesículas de membrana, como exosomos, para o ambiente extracelular. Os exosóis servem como mediadores essenciais da comunicação intercelular e desempenham um papel básico em muitos processos (patho)fisiológicos. O fator estimulante da colônia granulocito-macrófago (GM-CSF) funciona como uma citocina para modular a resposta imune. A presença de GM-CSF em exosóis tem o potencial de aumentar sua função imuno-regulatória. Aqui, GM-CSF foi expressado na linha de células ESC murina ES-D3. Um protocolo foi desenvolvido para isolar vesículas extracelulares supercelulares (EVs) de células ES-D3 superexpressas GM-CSF. EVs isolados enriquecidos com exosome foram caracterizados por uma variedade de abordagens experimentais. É importante ressaltar que quantidades significativas de GM-CSF foram encontradas presentes em EVs exosome enriquecidos. No geral, os EVs exosóicos enriquecidos por GM-CSF dos ESCs podem funcionar como vesículas livres de células para exercer suas atividades imuno-reguladoras.

O GM-CSF é superexpresso em ESCs murine. Para expressar de forma estável GM-CSF em células ES-D3, o cDNA murine GM-CSF foi clonado em um vetor de transfecção para gerar a expressão vetor pEF1α-mGM-CSF-IRES-hrGFP(Figura 1A). O GM-CSF foi superexpresso em células ES-D3 por transfecção, e cerca de 20% das células ES-D3 transitóriamente transfectadas foram GFP-positivos. Clones de células que expressam demais o GM-CSF ou o con...

Este estudo descreve um método para isolar vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fatores estimulantes da colônia de granulocitos imunes de células-tronco embrionárias.

Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent stem cells capable of self-renewal and differentiation into all types of embryonic cells. Like many other cell ...

Nosso protocolo pode ser usado para produzir vesículas extracelulares exosome enriquecidas de alta qualidade a partir de células-tronco embrionárias que expressam o fator estimulante imunológico, GM-CSF. As vesículas extracelulares enriquecidas exósias que carregam GM-CSF têm o potencial de servir a vesículas regulatórias imunológicas livres de células que podem modular a resposta imune. Pesquisadores com o treinamento básico de biologia molecular e celular, devem ser capazes de facilmente, como poderia este protocolo, mas qualquer pessoa que realize este protocolo pela primeira vez deve seguir as instruções de perto.Como nosso protocolo é complicado, visualizar os detalhes intrincados de cada etapa ajudará outros pesquisadores a gerar FBS livres exosome, ultracentrifuugar o volume desejado de FBS e coletar o supernatante livre exosome. Antes de emplacamento do ESD três células, cubra pratos de cultura tecidual de 15 centímetros com gelatina de 0,1% à temperatura ambiente por 30 minutos. Remova a Gelatina por aspiração e cultura a ESD três células sem células de camada alimentadora em ESD três culturas celulares média a 37 graus Celsius em 5% Dióxido de carbono umaidificado incubadora até que as células atinjam 90% de confluência.Lave as culturas quase confluentes com cinco mililitros de 0,05% de trippsina por prato seguido de uma incubação de cinco minutos a 37 graus Celsius em trippsina fresca. No final da incubação puxe as células separadas em um tubo de centrífuga e inativa a trippsina com cinco mililitros de meio de cultura fresca. Sedimentar as células por centrifugação e suspender as paletes em meio fresco para contar para a passagem, placa cinco vezes 10 a o sexto do ESD três células em 15 mililitros de cultura celular meio em novas placas revestidas de gelatina para três dias de cultura antes de sub-cultivar as células Para coletar a cultura celular supernatante para o isolamento de placa de vesículas extracelular enriquecida um vezes 10 para o sétimo ESD três células em 15 mililitros de cultura celular médio por nova placa revestida de gelatina por três dias antes de coletar os supernacantes da cultura celular Para o isolamento extra de vesícula celular enriquecido, primeiro sedimentar os fragmentos de células grandes dentro dos supernantes coletados de 72 horas cultivadas ESD três células por centrifugação.Depois de coletar o supernascido, ultracentrifuugar as amostras e descartar os supernantes. Enxágue suavemente cada palette duas vezes com um mililitro de PBS por lavagem para remover qualquer supernanato de cultura residual e quantificar o teor exósiado de proteína vesícula extracelular com um ensaio de ácido bicinchonínico, de acordo com a instrução do fabricante. Em seguida, suspenda novamente as vesículas extracelulares enriquecidas em PBS a uma concentração de seis microgramas por micrometro para armazenamento a menos 80 graus Celsius.Para visualizar as vesículas extracelulares enriquecidas exósias por microscopia eletrônica de transmissão fixe três a cinco microgramas por mililitro das vesículas extracelulares com a concentração final de paraformaldeído de rede de microscópio de 2% a temperatura ambiente por duas horas. No final da incubação, carregue 10 microlitadores das amostras fixas em grades de cobre com película de suporte de carbono por um minuto antes de drenar as grades com papel filtro, fique nas grades com uma solução de coloração adequada, de acordo com o protocolo do fabricante e use pinças para transferir as grades para um pedaço de papel filtro, em seguida, use o microscópio eletrônico de transmissão com uma ampliação de 50.000 vezes para adquirir imagens de microscopia eletrônica, de acordo com os protocolos padrão. Para preparar extratos celulares inteiros, colete ESD três células da cultura como demonstrado, e suspenda as células colhidas na PBS para contagem.Após uma segunda centrifugação, suspenda as células de cinco vezes 10 para a terceira células por microliter de buffer de carregamento de página SDS contendo concentração de SDS de 0,5% e Sonicate as amostras por 10 segundos em um Sonicator com uma amplitude de 10%. Em seguida, aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Para preparar lises para as vesículas extracelulares exósias enriquecidas, suspenda novamente as vesículas extracelulares enriquecidas em tampão de carregamento de página SDS contendo 0,5% SDS a 1,2 microgramas por concentração de microliter e Sonicate as amostras por 10 segundos, como demonstrado, então aqueça as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos.Para a Western Blot Analysis, carregue 10 extratos por atacado de microliter e amostras de liseto de vesícula extracelular enriquecido em wells individuais de um gel de página de estresse melhor. No final da corrida, transfira as proteínas para as membranas PVDF e incuba as membranas com os anticorpos primários e secundários apropriados de interesse, em seguida, detecte a expressão proteica usando um kit de detecção de chemiluminescência aprimorada, de acordo com as instruções do fabricante. Para avaliar a quantidade de GM-CSF dentro de vesículas extracelulares exóricas enriquecidas, use um kit Murine GM-CSF para revestir uma placa ELISA com anticorpo anti GM-CSF de captura em seguida, tratar 0,6 microgramas de amostras de vesículas extracelulares enriquecidas exósias com 100 microlitrais de PBS sozinho, ou PBS mais 0,05% interpolação 20 a temperatura ambiente por 30 minutos.Ao final da incubação, adicione as amostras tratadas aos Poços individuais da placa ELISA preparada para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, seguida pela lavagem dos Poços correspondentes apropriados apenas com PBS, ou PBS mais 0,05% interpolação 20. Após a lavagem, adicione o anticorpo de detecção às amostras para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem apenas com PBS ou PBS mais 0,05% entre 20 como demonstrado, em seguida, adicione Avidin Horseradish Peroxidase às amostras para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem e medindo a absorção em cada poço em um Leitor de Microplata a 450 nações. A intensidade de fluorescência GFP de um GM-CSF expressando ESD três linhas celulares ou uma linha de três células ESD expressando um vetor vazio é muito maior do que a de seus colegas parentais.ELISA revela que três células expressas GM-CSF produzem níveis notavelmente mais altos de GMCSF em sua cultura celular supernaduante do que células vazias de controle vetorial. Além disso, a quantidade de GM-CSF gerada pela GM-CSF expressando ESD três células é semelhante à produzida por fibroblastos STO que expressam GM-CSF. A microscopia eletrônica de transmissão de vesículas extracelulares isoladas de culturas celulares transduzidas por vetores e GM-CSF revelam vesículas de diferentes tamanhos que se enquadram na faixa esperada de 30 a 100 nanômetros de diâmetro.A expressão de marcadores exosômicos, incluindo CD81, Anexo V e flotillina-1 é marcadamente aprimorada em vesículas extracelulares, isoladas de ESD três células em comparação com extratos de atacado correspondentes pela análise de manchas ocidentais. É importante ressaltar que não foi detectada a presença de outros marcadores de compartimento subcelular em ESD três vesículas extracelulares derivadas, incluindo o marcador de ânticulo endoplasmático, Isomerase de Dissulfeto proteico, os marcadores mitocondriais, o complexo citocromo C e Oxphos IV-subunit IV e o marcador citosolmático GAPDH. Após a lavagem com 0,05% de interpolação 20, os níveis gm-CSF de fundo detectados no controle Vesículas extracelulares foram significativamente reduzidos.Em contraste, os níveis de GM-CSF nas vesículas extracelulares das células expressas GM-CSF foram significativamente aumentados por interpolação 20. Adquirir vesículas extracelulares supercelulares enriquecidas de alta qualidade carregando GMCSF é o passo mais importante para o sucesso deste protocolo. Os pesquisadores podem realizar experimentos adicionais, como estudos em linhas celulares e animais dependentes de GM-CSF para determinar se vesículas extracelulares enriquecidas que cuidam do GM-CSF podem funcionar como vesículas regulatórias imunológicas livres de células.Essas vesículas extracelulares enriquecidas exósmos podem então ser usadas para explorar como a modulação da resposta imune afeta diferentes condições da doença.

isolation-exosome-enriched-extracellular-vesicles-carrying

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo descreve um método baseado em cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para isolar vesículas extracelulares ou EVs derivadas das células imunológicas do cérebro - a microglia. Os EVs atuam como carga molecular para fornecer mediadores, que regulam uma resposta imune. Portanto, os EVs isolados podem ser usados como um modelo in vitro para estudar a interferência microglia-neurônio durante uma resposta imune neuronal.

Isolamento baseado em SEC de vesículas extracelulares derivadas de microglia: uma técnica para isolar vesículas extracelulares de meios de cultura condicionados por microglia

Este protocolo demonstra como purificar microRNAs extracelular de meios de cultura celular para construção de biblioteca pequena do RNA e a próxima geração de sequenciamento. Vários pontos de verificação de controle de qualidade são descritos para permitir que os leitores a entender o que esperar quando se trabalha com amostras de entrada baixas como exRNAs.

Isolando, sequenciamento e análise MicroRNAs extracelular das células-tronco mesenquimais humanas

Este protocolo ilustra 1) o isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos, bem como 2) purificação e caracterização de exossomos usando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose seguidos por análises de western blot.

Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético

A aplicação de exosomo é uma ferramenta emergente para o desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. Estabelecemos um protocolo de isolamento exossomo com alta pureza para isolar exosóis de células-tronco identificadas chamadas CB-SC para estudos mecanicistas. Também cocultura cb-SC-derivado exosósmos com monócitos humanos, levando à sua diferenciação em macrófagos fenotipicamente distintos.

Diferenciação de monócitos em macrófagos fenotipicamente distintos após o tratamento com células-tronco do sangue do cordão humano (CB-SC)-Exósmos derivados

O protocolo aqui demonstra que as vesículas extracelulares podem ser adequadamente separadas de meios de cultura celular condicionados usando cromatografia de exclusão de tamanho.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada

Este protocolo demonstra como isolar pequenas vesículas extracelulares de células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical humano (hUC-MSC-sEVs) com uma configuração simples de bancada em escala laboratorial. A distribuição de tamanho, concentração de proteínas, marcadores de sEVs e morfologia de hUC-MSC-sEVs isolados são caracterizados por análise de rastreamento de nanopartículas, ensaio de proteína BCA, western blot e microscópio eletrônico de transmissão, respectivamente.

Um Método Simples de Filtração de Bancada para Isolar Pequenas Vesículas Extracelulares de Células-Tronco Mesenquimais Humanas

O presente protocolo descreve a centrifugação diferencial para isolar e caracterizar EVs representativos (exossomos e microvesículas) de CTMs humanas cultivadas. Outras aplicações desses EVs também são explicadas neste artigo.

Isolamento, Caracterização e Aplicação Terapêutica de Vesículas Extracelulares a partir de Células-Tronco Mesenquimais Humanas Cultivadas

Aqui, descrevemos um método de homogeneização de alta velocidade assistido por separação magnética para produção em larga escala de nanovesículas derivadas do endossomo como um novo tipo de imitação de exossomos (MEs) que compartilham a mesma origem biológica e estrutura, morfologia e composição proteica semelhantes de vesículas extracelulares nativas (EVs).

Um Método de Homogeneização de Alta Velocidade Assistida por Separação Magnética para Produção em Larga Escala de Vesículas Derivadas do Endossomo

A presença de células-tronco cancerosas (CSCs) em sarcomas ósseos foi recentemente ligada à sua patogênese. Neste artigo, apresentamos o isolamento de CSCs de culturas de células primárias obtidas a partir de biópsias humanas de osteossarcoma convencional (OS) que utilizam a capacidade dos CSCs a crescer sob condições não aderentes.

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures de Human osteossarcoma convencional

Aqui, descrevemos modelos peixe-zebra xenotransplante usando dois locais de injecção diferentes, ou seja, espaço perivitelínico e duto de Cuvier, para investigar o comportamento invasivo e avaliar a intravasation e extravasamento potencial das células de câncer de mama humanos, respectivamente.

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

Aprenda a isolar vesículas extracelulares enriquecidas em exossomos carregando GM-CSF de células-tronco embrionárias. Este protocolo detalhado permite produzir vesículas imunoestimuladoras de alta qualidade para pesquisa.

Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de vesículas extracelulares exosome enriquecidas carregando fator estimulante da colônia granulocito-macrófago de células-tronco embrionárias

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