Imagens vitalícias de Luminescence de O₂ com um sistema de câmera baseado em domínio de frequência

Como o melhor aceitador de elétrons, o oxigênio desempenha um papel crucial nos sistemas biológicos. Com este protocolo, você pode imaginar a distribuição de oxigênio em 2D usando um optode. Além de sua alta resolução espacial e temporal, este método não requer um corante de referência adicional, é extremamente robusto e permite a aquisição de imagem estrutural.

Este método pode ser aplicado a várias áreas de pesquisa nas quais o oxigênio desempenha um papel fundamental, incluindo ecologia, pesquisa médica, bioimpressão e impressão sensível à pressão. A fabricação de optode pode ser desafiadora, pois a quantidade de coquetel adicionada à folha de suporte e a velocidade de arrasto do dispositivo de revestimento da faca podem exigir otimização e prática. Com essa contribuição em vídeo, queremos tornar essa técnica poderosa acessível a pesquisadores de outras áreas de estudo.

Para preparar um optode de oxigênio planar, primeiro use um filme de água ou 70% de etanol para fixar uma folha PET limpa sem poeira em uma placa de vidro limpa. Coloque um dispositivo de revestimento de faca de 120 micrômetros limpo na folha e use uma pipeta de vidro para aplicar uma linha de coquetel de sensor na frente do dispositivo. Em seguida, arraste o dispositivo de revestimento da faca lentamente e uniformemente sobre a folha PET para espalhar o coquetel uniformemente.

Em seguida, seque o optode sensível ao oxigênio planar acabado no ar ambiente por uma hora antes de secar durante a noite em um armário aquecido a 50 a 60 graus Celsius. Na manhã seguinte, uma camada de aproximadamente 12 micrômetros de espessura terá sido obtida. Armazene o optode protegido da luz até que seja usado.

Para preparar uma câmara de sanduíche de rizo, use adesivo instantâneo à base de acrílico leve para colar slides de microscópio ao longo das bordas de uma placa de vidro deixando uma longa borda aberta. Corte o optode planar na forma e tamanho necessários para caber no espaço entre os slides do microscópio colado e coloque o optode no interior da placa de vidro frontal com o lado revestido para cima. Tape uma borda da folha optode na placa de vidro e adicione água da torneira entre a placa de vidro e a folha de optode.

Abaixe lentamente a folha sobre as gotículas de água permitindo que o optode se endireitar na superfície do vidro e use um tecido mole para remover cuidadosamente uma bolha de ar presa entre o optode e a placa. Em seguida, limpe a placa de vidro seca e tape as bordas restantes da folha para a placa. Em seguida, use uma placa de vidro plana para distribuir sedimentos de peneira de 0,5 milímetros uniformemente através da placa até a mesma espessura que os espaçadores de slides do microscópio.

Limpe cuidadosamente a superfície superior do slide do microscópio para garantir que a segunda placa de vidro sele corretamente a câmara e aplique graxa de silicone na superfície do deslizamento do microscópio. Em seguida, cubra o sedimento com uma fina película de água, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Antes de colocar uma amostra no sedimento, lave cuidadosamente uma única tomada de Littorella uniflora e posicione o tiro em um sedimento com as folhas saindo do lado superior aberto.

Quando a amostra estiver no lugar, coloque a placa de vidro com o optode sobre o sedimento e aplique pressão suave para aproximar o optode com as raízes da planta e o sedimento circundante. Use grampos para fixar as placas e secar as bordas externas com papel de tecido. Adicione repetidamente algumas gotas de água às folhas para manter a planta hidratada durante toda a montagem do sanduíche de rizo e use fita elétrica de vinil para apertar a câmara de sanduíche de rizo.

Em seguida, sele as bordas com argila de modelagem e fita elétrica adicional. Para se preparar para a imagem, remova a folha de cobertura da área do optode após a incubação e posicione a câmara de sanduíche de rizo com a parede de vidro com o optode ereto contra a parede do aquário. Use um espaçador para pressionar a câmara de sanduíche de rizo contra a parede.

Coloque a câmera de vida de luminescência baseada em domínio de frequência equipada com um objetivo em frente ao aquário e à área de interesse. Conecte um filtro de emissão adequado para a imagem do corante indicador ao objetivo da câmera e fixe o guia de luz na fonte de excitação do LED. Em seguida, posicione o guia para que ele ilumine uniformemente a folha de optode planar cobrindo a área de interesse.

No software de imagem, selecione a câmera e selecione o LED no software de controle LED. Defina a intensidade do LED conforme necessário e marque analógico e sincronize para confirmar que o LED é acionado pela lógica transistor-transistor externo. Concentre manualmente a câmera e ajuste a abertura objetiva e ajuste a fonte de modulação interna, onda seno para o formato de onda de saída, amostragem de fase adicional, amostras de oito fases, ordem de fase em frente, leitura A B e frequência de modulação de cinco quilohertz.

Ajuste o tempo de exposição até que a leitura das estatísticas da região de interesse para a imagem de intensidade de luminescência normalizada esteja na faixa de 0,68 a 0,72. Em seguida, clique na referência de captura para iniciar a aquisição de uma série de medição de referência. Para calibrar o optode, use um dispositivo de mistura de gás para lavar a água em um aquário de calibração com uma mistura de gás nitrogênio de ar ambiente com uma concentração de oxigênio conhecida monitorando a concentração de oxigênio com uma sonda externa com um sensor de oxigênio.

Em seguida, adquira uma série de imagens em diferentes concentrações de oxigênio na câmara de calibração para obter uma curva adequada adequada aos dados de calibração adquiridos. Quando o sistema for calibrado, desligue as luzes que aplicam irradiação à planta e a todas as outras fontes de luz e ajuste o tempo de aquisição com base na intensidade da imagem para garantir que o sinal não esteja supersaturado nem muito fraco para uma boa relação sinal-ruído na determinação da vida. Quando todas as imagens de vida útil do oxigênio tiverem sido adquiridas, ligue as luzes para obter uma imagem estrutural e obtenha uma imagem com uma régua no campo de visão para permitir o dimensionamento subsequente das imagens adquiridas.

Antes de imaginar a amostra, o optode deve ser calibrado. Após uma decadência quase exponencial, a vida útil da luminescência medida diminui à medida que a concentração de oxigênio aumenta. Essa relação também pode ser descrita usando o modelo simplificado de dois sites.

Uma vez calibrado o optode, é possível determinar a concentração de oxigênio por meio da imagem da vida de luminescência, como observado nestas imagens, nas quais a distribuição da concentração de oxigênio na rizofera de Littorella uniflora foi imagens após a exposição da luz a 500 fótons de micromole por metro quadrado por segundo durante 12 horas e após 12 horas na escuridão. Além das imagens ao longo da vida, imagens estruturais também podem ser adquiridas sob iluminação externa, mantendo a geometria de imagem fixada para permitir que a imagem de oxigênio seja precisamente correlacionada com a imagem estrutural. Perfis de concentração de oxigênio através de uma única raiz, por exemplo, podem ser extraídos das imagens adquiridas na escuridão e na luz.

É fundamental ter um bom contato entre a matriz amostral e o optode para evitar artefatos desnecessários. Se você está em dúvida, refaça o sanduíche. A aquisição instantânea de uma imagem de forma não destrutiva permite o monitoramento do ambiente de oxigênio.

O método pode muito bem ser combinado com outros optodes para pH ou outros analitos. Certifique-se de realizar a fabricação de optode em um capô de fumaça, pois o coquetel de sensores contém clorofórmio. Optodes planar podem ser usados para identificar comunidades microbianas no sedimento.

E depois da imagem, o sanduíche pode ser aberto para provar esses pontos quentes para análise da comunidade microbiana.