Name: Direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a direcionar drogas a macrófagos de zebrafish larval usando lipossomas carregados e microinjeção. Este método permite manipular e avaliar funções imunes em modelos de inflamação.

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Este trabalho foi apoiado por subsídios concedidos à C.J.H. (Conselho de Pesquisa em Saúde da Nova Zelândia e Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) e Z.W. (Fundo de Desenvolvimento de Pesquisa da Faculdade da Universidade de Auckland). Os autores agradecem a Alhad Mahagaonkar pela gestão especializada da instalação de zebrafish, a Unidade de Pesquisa em Imagens Biomédicas, a Escola de Ciências Médicas da Universidade de Auckland por assistência com imagens confocais e Graham Lieschke por presentear a linha de repórteres Tg(mpeg1:EGFP).

1. Preparação de Liposomes marina azul carregado de drogas
NOTA: Liposomes carregando o corante fluorescente azul, Marina Blue e droga são preparados usando um método de hidratação de filme fino com pós-inserção de poloxamer 188. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente, a menos que seja especificado de outra forma. Os liposós de controle só carregam Marina azul e PBS. O exemplo aqui descreve carregar liposomos com uma droga antioxidante25 que é usada nos resultados representativos como prova de conceito.
<ol><li>Para preparar liposós, dissolva 16,4 mg (22,2 μmol) dos fosfolipidas 1,2-dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosphocolina (ver Tabela de Materiais), 4.3 mg (11,1 μmol) colesterol (ver Tabela de Materiais) e 2,8 mg (3,7 μmol) 1,2-diseteroyl-sn-glicero-3-fosfatcolina (ver Tabela de Materiais, em 3 mL de clorofórmio:metanol (3:1 v/v) em um frasco de fundo redondo de 25 mL.</li>
	<li>À mistura acima, adicione 31 nmol de Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-phosphoetanolamina (ver Tabela de Materiais) e 300 nmol de uma droga inibidora de mROS (ver Tabela de Materiais) e sônico brevemente para dissolver totalmente. Para liposós de controle, adicione apenas Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-phosphoetanolamina. NOTA: Para evitar o fotobranqueamento do corante fluorescente Marina Blue sensível à luz, proteja todos os procedimentos da luz, sempre que possível. Isso também é importante se a droga a ser carregada for sensível à luz.</li>
	<li>Remova o solvente lentamente em um evaporador rotativo (ver Tabela de Materiais) sobre um banho de água controlado pela temperatura definido para 45 °C girando a 75 rpm pressão de vácuo (200 mbar por 15 min e 0 mbar por 20 min). Isso forma uma película lipídica fina seca dentro das paredes de vidro do frasco que é ainda mais seca por 45 minutos abaixo de N2 para facilitar a remoção completa do solvente orgânico.</li>
	<li>Após a formação do filme fino, fixe a pressão do vácuo para 40 mbar por 15 min, depois expurgar com gás nitrogênio por 30 min para garantir a remoção do resíduo solvente.</li>
	<li>Hidrate a película fina usando 1 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS, pH 7.4) e vedacom o parafilme antes de agitar o frasco usando um evaporador rotativo sobre um banho de água de 60 °C por 20 min para formar vesículas.</li>
	<li>Submeter a suspensão hidratada a 7 ciclos de congelamento e degelo congelando em líquido N2 por 3 min seguido de imersão em um banho de água de 45 °C por 7 min.</li>
	<li>Extruda liposós através de uma membrana usando um mini-extrusor (ver Tabela de Materiais) e 1,0 μm de membranas policarbonatos gravados (ver Tabela de Materiais) para 2-6 ciclos, a fim de obter grandes vesículas unilamellar. NOTA: Para atingir um direcionamento mais favorável para macrófagos, manipule ciclos de extrusão até que o diâmetro dos liposós seja de aproximadamente 1 μm26,27,28.</li>
	<li>Condensar os liposós frescos em uma pelota por ultracentrifugação a 186.000 x g e incubar com 1 mL de 1% poloxamer 188 (ver Tabela de Materiais) solução (10 mg/mL em PBS) a 45 °C e 750 rpm por 30 min usando um termomixer com um acessório de tubo de microcentrífuga de 2 mL (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Ultracentrífuga a mistura a 186.000 x g por 1 h a 4 °C e remova o supernatant a fim de remover qualquer polímero ou droga desvinculado. Guarde as pelotas liposós a 4 °C, protegidas da luz.</li>
</ol>2. Caracterização do Tamanho Liposome e Potencial Zeta
<ol><li>Diluir a formulação liposome com água ultrapura (1:100) e medir o tamanho da partícula, o índice de polidispersão (PDI) e o potencial zeta dos liposomos usando um analisador dinâmico de dispersão de luz (ver Tabela de Materiais),triplicado a 25 °C. NOTA: O PDI é uma medida da distribuição de tamanho da população de nanopartículas. Valores PDI < 0,05 indica uma distribuição mais uniforme, enquanto valores mais próximos de 1 indicam uma distribuição de tamanho maior. O potencial zeta é a carga geral da superfície.</li>
</ol>3. Cálculo da Eficiência de Armadilha e Carregamento de Drogas em Liposós
NOTA: Para determinar a eficiência da aprisionamento da droga nos liposomos, o teor de drogas contido na supernatante e no liposome pellet são medidos.
<ol><li>Resuspender a pelota liposome em 1 mL da PBS.</li>
	<li>Remova o supernatante, dilua 10 x com água ultrapura e analise por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC).</li>
	<li>Para determinar a concentração de medicamentos dentro dos liposomos, adicione 100 μL de suspensão liposome a 900 μL de 10% de solução triton-X100 (para destruir a membrana lipídica, liberando a droga enlada e prevenindo o acúmulo de lipídio sustruoso dentro da coluna HPLC) e vórtice por 3 min antes da análise.</li>
	<li>Injete 20 μL de amostra em um sistema HPLC composto por uma bomba quaternary, termostato de amostrador automático e uma coluna de 3 μm 250 x 4,6 mm. Defina a fase móvel (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrila e metanol (30:40:30, v/v/v)) taxa de fluxo para 0,9 mL/min e obtenha perfis espectrais usando um detector de matriz de diode fixado a 230 mM.</li>
	<li>Calcule a eficiência de armadilha (EE) e o carregamento de medicamentos (DL) usando as seguintes equações: EE (%) = [Eu / Mt] x 100 DL (%) = [Eu / Mlip] x 100 Onde eu é a massa de droga encapsulada, Mt é a massa total de droga usada durante a formulação e Mlip é a massa total dos lipídios (incluindo colesterol) e droga encapsulada.</li>
</ol>4. Preparação e Injeção de Liposós
<ol><li>Prepare agulhas de microinjeção borosilica inserindo uma parede fina capilarde vidro borosilica (1 mm D.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm de comprimento) em um dispositivo puxador de micropipette (ver Tabela de Materiais) com as seguintes configurações genéricas do puller (calor 680, puxar 75, velocidade 40, tempo 55 e pressão 530) para produzir uma microinjeção de microagulha sacada.</li>
	<li>Coloque as agulhas em uma placa de Petri na argila de modelagem e organize de uma forma que a extremidade puxada não está tocando na parte inferior do prato. Mantenha a tampa da placa petri fechada para evitar contaminação da poeira até que esteja pronta para uso.</li>
	<li>Diluir formulações liposóis recém-preparadas 1:1 em PBS estéreis (pH 7.4) e brevemente vórtice (2-3 s) para misturar. NOTA: Proteja os liposós da luz até que as larvas estejam prontas para microinjeção.</li>
	<li>Configure pares adultos de criação de zebrafish na noite anterior e cole embriões como descrito anteriormente por Rosen et al.29.</li>
	<li>Transfira os embriões para uma placa de Petri (estilo 100 mm x 20 mm com aproximadamente 60 embriões por prato) contendo e3 médio (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) complementado com 0,1% azul metileno para inibir o crescimento fúngico. Remova todos os embriões mortos ou não fertilizados e incuba durante a noite a 28,5 °C.</li>
	<li>Para facilitar a imagem ao vivo, adicione 0,003% n-Phenylthiourea (PTU) à mídia E3 quando os embriões chegam a 24h de desenvolvimento para evitar a formação de pigmentos (melação).</li>
	<li>Dechoriona manualmente os embriões a aproximadamente 30h após a fertilização (hpf) usando fórceps de ponta fina. NOTA: Não use tratamento enzimático para deterínia embriões, pois isso pode causar danos epiteliais e inflamação local, influenciando assim estudos imunológicos</li>
	<li>Deixe os embriões se desenvolverem a 28,5 °C até 2 dias após a fertilização (DPF).</li>
	<li>Prepare uma placa de injeção derramando 3% de celulose metila suficiente (na mídia E3) na tampa de um pequeno prato de cultura de 35 mm para formar uma película fina cobrindo toda a superfície. NOTA: Ao preparar 3% de celulose metila na mídia E3, leva vários dias para a celulose de metila dissolver-se com agitação suave em um agitador orbital.</li>
	<li>Anestesiar as larvas incubando na mídia E3 complementada com 200 μg/mL de Tricaine.</li>
	<li>Colete uma piscina de aproximadamente 20-25 larvas usando uma pipeta de transferência de plástico e permita que os embriões se concentrem na ponta da pipeta pela gravidade. Tomando cuidado para transferir as larvas com líquido mínimo, coloque-as no meio da tampa de prato cultural de 35 mm.</li>
	<li>Usando uma pá carregadeira microcapilar, organize as larvas das seguintes maneiras: anterior em direção ao topo da placa de injeção com a superfície dorsal voltada para a agulha de microinjeção, para injetar no ventrículo do cérebro traseiro (Figura 2A-D); ou, anterior em direção à esquerda da placa de injeção (ao injetar da direita) com a superfície ventral voltada para a agulha de microinjeção para injetar no venoso do seio(Figura 2I). NOTA: Quando injetados desta forma, podem ser alvos os macrófagos de ventrículos de ventrículos do ventrículo retrocérebro(Figura 2E)e tecido hematopoieético caudal (CHT) residentes(Figura 2J), respectivamente. A região cht de zebrafish larval é um sítio hematopoieético análogo ao fígado fetal mamífero. Preste atenção extra para não danificar os embriões enquanto organiza, pois isso pode causar inflamação local, influenciando assim estudos imunológicos.</li>
	<li>Tome liposós recém-preparados (a partir do passo 4.3) e encha uma agulha de injeção com aproximadamente 5 μL da mistura de injeção liposome usando um carregador microcapilar (ver Tabela de Materiais). NOTA: Ao avaliar a localização dos liposomos nos compartimentos fagolysosômicos dos macrófagos(Figura2H), complemente esta mistura de injeção com 200 μg/mL de um marcador fluorescente vermelho de phagosome s (ver Tabela de Materiais) e 100 nM de um marcador fluorescente muito vermelho de lisosomos (ver Tabela de Materiais) para marcar phagossomos30,31 e lisosomos32, respectivamente.</li>
	<li>Monte a agulha em um micromanipulador (ver Tabela de Materiais) conectado a um suporte magnético e um injetor de pressão (ver Tabela de Materiais). Posicione um estereótipo e coloque o injetor em uma duração de pulso de aproximadamente 50 ms e uma pressão de injeção de aproximadamente 40 psi.</li>
	<li>Corte a ponta da agulha de microinjeção com fórceps de ponta fina limpa para gerar uma abertura de aproximadamente 5 μm de diâmetro.</li>
	<li>Calibrar o volume a ser injetado injetando um bolus em uma gota de óleo mineral posicionado sobre as linhas de grade de um hemocímetro. Ajuste a duração do pulso e/ou a pressão de injeção até que o diâmetro do bolus cubra 2,5 das menores linhas de grade (isso corresponde a um volume de aproximadamente 1 nL).</li>
	<li>Injete cuidadosamente 1 nL da mistura de injeção liposome na ventrícula do cérebro traseiro de cada larva. NOTA: Ao injetar no ventrículo do cérebro traseiro, tome cuidado para não penetrar muito longe (além do cérebro traseiro) pois isso pode interromper a vasculatura subjacente que leva a hemorragias. Ao injetar no venoso do seio, deve-se tomar cuidado para garantir que a ponta da agulha esteja apenas dentro do pericárdio e não penetrando na gema.</li>
	<li>Após a injeção, transfira imediatamente as larvas injetadas de volta para a mídia E3 adicionando mídia E3 à placa de injeção e agitando suavemente as larvas da celulose de metila usando uma pipeta de transferência de plástico.</li>
	<li>Incubar as larvas a 28,5 °C (protegidas da luz) até a análise por imagens confocais vivas.</li>
</ol>5. Análise de imagem e imagem confocal para confirmar a segmentação de macrófagos de liposomos
<ol><li>Aqueça um banho de água a 50 °C.</li>
	<li>Larvas anestesas injetadas por liposina transferindo para um novo prato Perti contendo mídia E3 complementada com 0,003% PTU e 200 μg/mL Tricaine.</li>
	<li>Prepare o meio de montagem de imagens ao vivo dissolvendo 1% de baixa agarose de ponto de fusão nos meios de comunicação E3, complementado com 0,003% ptu, em um micro-ondas. Coloque no banho de água e uma vez que a solução tenha esfriado para 50 °C, adicione 200 μg/mL de Tricaine.</li>
	<li>Mantenha o meio de montagem no banho de água de 50 °C para evitar a polimerização prematura da agarose.</li>
	<li>Para visualizar a superfície dorsal do cérebro traseiro em um microscópio confocal equipado com uma lente de imersão de água(Figura 2E),incorpore as larvas da seguinte forma: Encha um prato de cultura de 35 mm com o meio de montagem (a uma profundidade de aproximadamente 5 mm) e deixe-o polimerizar. Escavar uma pequena trincheira na agarose que é de tamanho suficiente para acomodar o saco de gema.</li>
	<li>Encha uma pipeta de transferência plástica com meio de montagem derretida, expulse uma pequena quantidade e use-a para coletar as larvas anestesiadas. Transfira imediatamente as larvas para o prato de cultura e oriente os sacos de gema, lateral ventral para baixo, para os buracos escavados, usando uma pá carregadeira microcapilar. Mantendá-los periodicamente nesta posição até que a agarose polimeriza. Sobreposição com mídia E3 complementada com 200 μg/mL Tricaine. NOTA: Ao transferir e posicionar larvas, tome cuidado para não causar danos epiteliais e inflamação local que podem influenciar estudos imunológicos. Para posicionamento das larvas para imagem ao vivo a região do CHT (Figura 2J), montar como descrito acima, mas posicione as larvas dentro do orifício escavado lateralmente.</li>
	<li>Ao fotografar um microscópio confocal invertido, incorpore as larvas, sem a cama agarose, diretamente no fundo de um prato inferior de vidro. Organize-os com superfície dorsal para baixo (ou lateralmente) e após a polimerização, cubra toda a superfície do prato com uma camada uniforme de meio de montagem. Uma vez polimerizada, adicione uma fina camada de mídia E3 complementada com 200 μg/mL de Tricaine.</li>
	<li>Para visualizar ao vivo o ventrículo de cérebro traseiro em um microscópio confocal, use as seguintes configurações: 512 x 512 pixels; 40 x 3 μm Z-stacks (estendendo-se da superfície dorsal-mais do cérebro traseiro); Objetivo de 20x; Zoom de 2,5x. NOTA: Ao comparar intensidades de sinal entre amostras (por exemplo, ao fotografar a captação de liposomos com rótulo azul marina injetados dentro de linhas de repórter marcando macrófagos [Tg (mpeg1:EGFP)33] ou nêutrons [Tg(lyz:EGFP)34]), é essencial que as configurações a laser sejam mantidas as mesmas (por exemplo, diâmetro pinhole, tensão laser, deslocamento e ganho) para ajudar a garantir que quaisquer diferenças não sejam um artefato de configurações alteradas de aquisição de imagens.</li>
	<li>Use software de análise de imagem 3D para quantificar a captação de macrófago ou neutrófilo de liposós rotulados por Marina Blue. Para quantificar o número de células contendo liposomos(Figura 2F) dentro de uma pilha Z, role através das seções Z individuais e conte o número de células individuais contendo liposós com rótulo sique a Marina Blue. Para quantificar a intensidade de fluorescência dos liposomos dentro das células (Figura 2G), desenhe uma região de interesse em torno de cada célula (nas dimensões X, Y e Z) para quantificar a intensidade total ou média de fluorescência da Marina Azul intracelular.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que não existem interesses financeiros concorrentes.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para formular liposós carregados de drogas para atingir especificamente macrófagos em zebrafish larval. Este método pode ser usado para dissecar o papel dos macrófagos em certos modelos da doença, garantindo a entrega direta direcionada de medicamentos especificamente aos macrófagos. Além disso, pode ser usado quando a toxicidade geral das drogas limita seu uso quando entregue por rotas mais convencionais, como a imersão. O protocolo descrito aqui fornece uma alternativa a outros s...

O sistema de phagócito mononuclear fornece uma primeira linha de defesa contra patógenos invasores. Este sistema consiste em monócitos, células e macrófagos derivados de monocitos, que ativamente fagocytoze patógenos estrangeiros, limitando assim a propagação de patógenos. Além dessas funções de efeito phagofítico e microbicida, células dendríticas e macrófagos também são capazes de produção de citocinas e apresentação de antígenos para ativar o sistema imunológico adaptativo1. Dessas células, os macrófagos têm recebido atenção especial devido à sua diversa heterogeneidade funcional e envolvimento em múltiplas doenças inflamatórias, desde autoimunidade e doenças infecciosas até câncer2,3,4,5,6,7. A plasticidade dos macrófagos e sua capacidade de se adaptar funcionalmente às necessidades de seu ambiente tecidual exigem abordagens experimentais para observar e interrogar diretamente essas células in vivo.
Zebrafish larval são um organismo modelo ideal pelo qual estudar a função e plasticidade dos macrófagos no vivo8. A transparência óptica do zebrafish larval fornece uma janela para observar diretamente o comportamento dos macrófagos, especialmente quando acoplado com linhas de repórtertransgênicas com marcação de macrófagos. Explorar o potencial de imagem ao vivo e a tratabilidade experimental de zebrafish larval levou a muitas percepções significativas sobre a função macrófaga que têm relevância direta para a doença humana9,10,11,12,13,14,15. Muitos desses estudos também se aproveitaram da alta conservação da atividade medicamentosa em zebrafish (atributo que sustenta seu uso como uma plataforma inteira de descoberta de drogas animais16,17,18), utilizando intervenções químicas para manipular farmacologicamente a função macrófago. Até o momento, esses tratamentos farmacológicos têm sido entregues principalmente através da imersão, o que exige que a droga seja solúvel em água, ou por microinjeção direta de droga gratuita(Figura 1A). Limitações dessas estratégias de entrega passiva incluem efeitos fora do alvo e toxicidade geral que podem impedir a avaliação de qualquer impacto na função do macrófago. Além disso, ao investigar efeitos medicamentosos em macrófagos não se sabe se as drogas estão agindo sobre os próprios macrófagos ou através de mecanismos mais indiretos. Ao realizar estudos semelhantes de intervenção química para investigar a função do macrófago, reconhecemos que havia uma necessidade não atendida de desenvolver um método de entrega barato e direto para direcionar medicamentos especificamente para macrófagos.
Liposomos são corículas microscópicas, biocompatíveis e lipídicas que podem encapsular proteínas, nucleotídeos e carga de drogas19. A estrutura de bicamadas lipídicas unilamelares ou multilémelares de liposomos forma um lúmen interno aquoso onde drogas solúveis em água podem ser incorporadas enquanto drogas hidrofóbicas podem ser integradas às membranas lipídicas. Além disso, as propriedades físicoquímicas dos liposomos, incluindo tamanho, carga e modificações de superfície podem ser manipuladas para adaptar seu direcionamento a células específicas20,21. Essas características dos liposomos tornaram-nos um veículo atraente para entregar medicamentos e melhorar a precisão dos regimes de tratamento atuais20. Como os liposós são naturalmente fagocytozed por macrófagos (um recurso explorado por seu uso rotineiro na entrega de clodronato especificamente para macrófagos para experimentos de ablação22), eles apresentam como uma opção atraente para a entrega de drogas específicas do macrófago(Figura 1B).
Este protocolo descreve a formulação de medicamentos em liposomos fluorescentes azuis revestidos com o poloxamer de polímero hidrofílico 188, que forma uma camada protetora na superfície liposome e tem sido mostrado para melhorar a retenção de drogas e ter biocompatibilidade superior23. Poloxamer foi escolhido para revestimento superficial de liposomos como nossa pesquisa anterior mostrou que, quando comparado com liposós modificados de polietileno glicol, liposomos modificados de poloxamer mostraram melhor biocompatibilidade após injeção subcutânea de patas de rato e farmacocinética semelhante em coelhos após infusão intravenosa23. Protocolos também são descritos para sua microinjeção em zebrafish larval e imagens vivas para avaliar sua capacidade de segmentação de macrófagos e localização para compartimentos intracelulares necessários para degradação liposome e entrega de drogas citoplasmáticas. Como prova de conceito, já usamos essa técnica para direcionar duas drogas aos macrófagos para suprimir sua ativação em um modelo de zebrafish larval de inflamação gouty aguda24. Esta técnica de entrega de drogas expande o "kit de ferramentas" químico disponível para pesquisadores de zebrafish que desejam garantir o direcionamento de macrófagos de suas drogas de interesse.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850355P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diseteroil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPE)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850367P</td><td></td></tr><tr><td>1.0 &micro; m Membranas de policarbonato Nuclepore Track-Etched</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>110610</td><td></td></tr><tr><td>Balão de fundo redondo de 25 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278262</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de 35 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Quaternária Agilent 1260 Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1311B</td><td></td></tr><tr><td>Termostato Agilent 1290 Infinity Series</td> Mini-extrusora <td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>Avanti Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>Avanti Lipídios Polares Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agulhas de microinjeção de borosilicato</td><td>Warner Instruments</td><td>203-776-0664</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901-100G</td><td></td></tr><tr><td>colesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 pinça de ponta fina</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader ponta de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf SmartBlock 1,5 mL, termobloco para 24 vasos de reação</td><td>Eppendorf</td><td>4053-6038</td><td></td></tr><tr><td>manipulador de cílios</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>hemocitômetro</td><td>Hawksley</td><td>BS.748</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BDH Chemicals</td><td>441474J</td><td></td></tr><tr><td>Sistema HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 sistema</td><td></td>HPLC série</tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>baixo ponto de fusão agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Vermelho Escuro</td><td>Invitrogen</td><td>L12492</td><td>solução estoque de 1 mM em DMSO, mantenha em -20 > C e proteger da luz.</td></tr><tr><td>LysoTracker Deep Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>suporte magnético</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td></td></tr><tr><td>Marina Blue 1,2-dihexadecanoil-sn-glicero-fosfoetanolamina (Marina Blue DHPE)</td><td>Invitrogen</td><td>M12652</td><td>Mantenha em -20 &deg; C e proteger da luz.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>metilcelulose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0387-500G</td><td></td></tr><tr><td>azul de metileno</td><td>Alfa Aesar</td><td>42771</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-500G</td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td></td></tr><tr><td>óleo mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3516</td><td></td></tr><tr><td>Antioxidante direcionado a mitocôndrias MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red Indicador de superóxido mitocondrial</td><td>Thermo Scientific</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>MitoTEMPO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0737</td><td>Mantenha em -20 &deg; C e proteger da luz.</td></tr><tr><td>N-feniltioureia (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td>Tome cuidado ao manusear, tóxico.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BDH Chemicals</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (100 mm x 20 mm)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4,6 mm coluna</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4439-E0</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugado</td><td>Thermo Scientific</td><td>P35361</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugado</td><td>Invitrogen</td><td>P35361</td><td>Manter em -20 &deg; C e proteger da luz. Faça 1 mg / mL de solução estoque dissolvendo 2 mg de produto liofilizado em 2 mL de PBS suplementado com 20 mM HEPES, pH 7,4.</td></tr><tr><td>pipeta de transferência de plástico</td><td>Medi'Ray</td><td>RL200C</td><td></td></tr><tr><td>poloxâmero 188</td><td>Injetor de pressão da BASF Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Scientific Instruments</td><td>MPPI-2</td><td></td></tr><tr><td>evaporador rotativo</td><td>B&uuml; chi, Flawil, Suíça</td><td>B&uuml; chi R-215 Microscópio</td> confocal de varredura rotavapor <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>Olympus FV1000 FluoView</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall WX+ Ultracentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75000090</td><td></td></tr><tr><td>estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Faça 4 mg/mL de solução estoque (em H2O deionizado) e mantenha a -20 °C.</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Banho ultrassônico</td><td>Thermo Scientific</td><td>FB-11205</td><td></td></tr><tr><td>Volocity Software de análise de imagem</td><td>PerkinElmer</td><td>versão 6.3</td><td></td></tr><tr><td>banho-maria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>Zetasizer Nano ZS ZEN 3600</td><td></td></tr></tbody></table>

direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas

Targeting Drugs to Larval Zebrafish Macrophages by Injecting Drug-Loaded Liposomes

As larvas de zebrafish (Danio rerio) desenvolveram-se em um modelo popular para investigar interações hospedeiras-patógenas e a contribuição de células imunes inatas para doenças inflamatórias devido ao seu sistema imunológico inato funcionalmente conservado. Eles também são amplamente utilizados para examinar como as células imunes inatas ajudam a orientar os processos de desenvolvimento. Aproveitando a transparência óptica e a tratabilidade genética dos zebrafish larvais, esses estudos muitas vezes se concentram em abordagens de imagem ao vivo para caracterizar funcionalmente macrófagos e neutrófilos fluorescentes dentro de animais intactos. Devido à sua diversa heterogeneidade funcional e papéis em constante expansão na patogênese da doença, os macrófagos receberam atenção significativa. Além das manipulações genéticas, as intervenções químicas são usadas rotineiramente para manipular e examinar o comportamento do macrófago em zebrafish larval. A entrega dessas drogas é tipicamente limitada ao direcionamento passivo de drogas gratuitas através de imersão direta ou microinjeção. Essas abordagens dependem da suposição de que quaisquer alterações no comportamento do macrófago são resultado de um efeito direto da droga nos próprios macrófagos, e não uma consequência a jusante de um efeito direto em outro tipo de célula. Aqui, apresentamos nossos protocolos para direcionar drogas especificamente para macrófagos de zebrafish larval, microinjetando liposós fluorescentes carregados de drogas. Revelamos que liposomos fluorescentes azuis carregados de drogas modificadas por poloxamer 188 são prontamente tomados por macrófagos, e não por neutrófilos. Também fornecemos evidências de que drogas entregues dessa forma podem impactar a atividade do macrófago de forma consistente com o mecanismo de ação da droga. Essa técnica será de valor para os pesquisadores que desejam garantir o direcionamento de medicamentos aos macrófagos e quando as drogas são tóxicas demais para serem entregues por métodos tradicionais como a imersão.

A abordagem de hidratação de filmes finos descrita aqui para a preparação de liposomos fluorescentes que abrigam medicamentos é um método simples e econômico. Com o protocolo utilizado neste estudo, espera-se que os liposósicos sejam unilamellar23,24. O tamanho, o potencial zeta, a eficiência de carga e armadilha dos liposomos produzidos são resumidos na Tabela 1. O tamanho da partícula dos liposomos (antes e depois do carregamento da droga) são ...

Aqui, descrevemos a síntese de liposós carregados de drogas e sua microinjeção em zebrafish larval com o propósito de direcionar o fornecimento de drogas para células de linhagem de macrófagos.

Direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas

Zebrafish (Danio rerio) larvae have developed into a popular model to investigate host-pathogen interactions and the contribution of innate immune cells ...

Este protocolo descreve uma técnica para direcionar drogas de interesse para macrófagos de zebrafish larval para manipular e avaliar a função macrófago. Esta técnica tem vantagens sobre as estratégias tradicionais de entrega de medicamentos, como a imersão, garantindo que os medicamentos sejam especificamente direcionados a macrófagos através do encapsulamento lipossomo. Quando aplicada a modelos de zebrafish da doença com componente inflamatório, essa técnica tem o potencial de resolver como macrófagos contribuem para processos patológicos.Aqui, demonstramos a utilidade desta técnica mirando uma droga inibidora de oxigênio mitocondrial-reativa aos macrófagos para suprimir a ativação. A microinjeção de lipossomos carregados de drogas em larvas pode ser desafiadora, pois deve-se tomar cuidado para não causar danos epiteliais excessivos, influenciando potencialmente estudos imunológicos. A demonstração visual deste protocolo é importante porque envolve metodologias farmacológicas e células vivas animais inteiras que podem não ser realizadas rotineiramente em um único laboratório.Para preparar 10 miligramas de lipossomos em um frasco de fundo redondo de 25 mililitros, adicione 31 nano

targeting-drugs-to-larval-zebrafish-macrophages-injecting-drug-loaded

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Embriões do zebrafish transparente provaram anfitriões modelo útil para visualizar e interações de estudo funcional entre as células imunes inatas e patógenos bacterianos intracelulares, tais...

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

O desenvolvimento rápido, tamanho pequeno e transparência de peixes-zebra são enormes vantagens para o estudo do controle imunológico inato de...

Não-invasivos de imagem de candidíase disseminada em larvas do peixe

O artigo descreve a ablação hepática direcionada, um método para induzir a morte de hepatócitos com metronidazol em larvas transgênicas de peixe-zebra. O protocolo de amostra descreve o processo de geração, manipulação e avaliação da ablação hepática direcionada em peixe-zebra.

Ablação hepática direcionada: induzindo a morte de hepatócitos com metronidazol em larvas de peixe-zebra transgênico

O vídeo demonstra uma técnica de dispositivo de ferimento e aprisionamento de peixe-zebra para observar a infecção por patógenos fúngicos marcados com fluorescência em larvas de peixe-zebra. A infecção inicial atrai macrófagos e, à medida que a infecção persiste, o recrutamento de neutrófilos progride no local da injeção.

Uma técnica zWEDGI para visualizar larvas de peixe-zebra infectadas por patógenos fúngicos

O vídeo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeos (LPS) no cérebro de larvas de peixe-zebra para induzir neuroinflamação. As larvas são posicionadas em um prato forrado de agarose, a agulha é inserida nos ventrículos cerebrais e o LPS é injetado. O LPS injetado desencadeia uma resposta imune que leva à neuroinflamação.

Induzindo neuroinflamação em larvas de peixe-zebra com injeção de lipopolissacarídeo

Embriões de peixe-zebra opticamente transparentes são amplamente utilizados para estudar e visualizar em tempo real as interações entre microrganismos patogênicos e as células imunes inatas. A microinjeção de Mycobacterium abscessus, combinada com imagens de fluorescência, é usada para examinar características patogênicas essenciais, como a formação de cordão em embriões de peixe-zebra.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Para testar o efeito de um quimiocina no recrutamento do macrófago in vivo, a hibridação in situ da montagem inteira foi usada para detectar a expressão ectópica do quimiocina, e a imunomarcação foi usada para etiquetar macrófagos. A imagem latente viva foi usada para a observação tempo real da migração do macrófago.

Um modelo de expressão de Quimiocina ectópica para testar o recrutamento de macrófago in vivo

Este protocolo descreve uma técnica para visualizar o comportamento do macrófago e a morte no zebrafish embrionário durante a infecção do marinum de Mycobacterium. Etapas para a preparação de bactérias, infecção dos embriões e microscopia intravital estão incluídas. Esta técnica pode ser aplicada à observação do comportamento celular e da morte em cenários semelhantes envolvendo infecção ou inflamação estéril.

Visualização da morte de células ticas de macrófago durante infecção micobacteriana em embriões de zebrafish via microscopia intravital

Modelos de xenoenxerto de zebrafish permitem a triagem de medicamentos de alto risco e imagens fluorescentes de células cancerígenas humanas em um microambiente in vivo. Desenvolvemos um fluxo de trabalho para a triagem de medicamentos automatizados em larga escala em amostras de leucemia derivada do paciente em zebrafish usando uma unidade de imagem equipada com microscópio de fluorescência automatizada.

Triagem de drogas de xenoenxertos tumorais derivados do paciente primário em zebrafish

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Aprenda a direcionar drogas a macrófagos de zebrafish larval usando lipossomas carregados e microinjeção. Este método permite manipular e avaliar funções imunes em modelos de inflamação.

Direcionando drogas para macrófagos de zebrafish larval injetando liposós carregados de drogas

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