Name: Vitrificação de gotículas em massa para preservação primária de hepatócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprenda a vitrificar grandes quantidades de hepatócitos de rato usando concentrações baixas de agentes crioprotetores. Este método melhora a viabilidade celular e a atividade metabólica para transplantes.

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Financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01DK096075, R01DK107875 e R01DK114506) e do Departamento de Defesa dos EUA (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) é muito reconhecido.

Os principais isolamentos hepatocitos para este protocolo foram realizados pelo Cell Resource Core (CRC) no Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, EUA. O protocolo animal (#2011N000111) foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Massachusetts General Hospital.
1. Vitrificação de gotículas em massa
<ol><li>Prepare as soluções de vitrificação.
	<ol>
<li>Adicione 40 mg de albumina de soro bovina (BSA) a 17,0 mL da solução da Universidade de Wisconsin (UW) para fazer a solução de vitrificação 1 (V1). Estéril filtra risto a solução V1 usando um filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C. NOTA: UW é uma solução de preservação de órgãos comumente usado. Contém 50 g/l amido hidroxyethyl, 35,83 g/l ácido lactobiônico, 3.4 g/L potassium phosphate monobasic, 1.23 g/L magnésio sulfato heptahydrate, 17.83 g/L raffinose pentahydrate, 1.34 g/L adenosine, 0.136 g/L allopurinol, 0.992 g/L glutatiatotal, 5.61 g /L hidróxido de potássio e hidróxido de sódio para ajustar o pH a 7,4.</li>
		<li>Combine 7,0 mL de UW, 6,5 mL de DMSO, 6,5 mL de etilenoglicol (EG), 40 mg de BSA e 5,48 g de sacarose para fazer a solução de vitrificação 2 (V2). Estéril filtra risto a solução V2 usando um filtro de 0,22 μm. Carregue 3,5 mL de solução V2 filtrada estéril em uma seringa de 3 mL e guarde a 4 °C. NOTA: Para facilitar a dissolução dos CPAs, as soluções são preparadas em quantidades maiores do que o necessário.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o aparato de vitrificação de gotículas em massa.
	<ol>
<li>Para preparar a agulha de mistura, primeiro corte ao longo de um lado da luva cinza exterior da agulha de mistura, e, em seguida, dobre a manga aberta para removê-lo da agulha de mistura.</li>
		<li>Deslize duas seções de tubos de silicone de 25 mm sobre as enseadas da agulha de mistura e proteja sua posição com cola (Figura 1A).</li>
		<li>Corte a agulha a um comprimento de 20 milímetros (isto é, o comprimento da hélice de mistura interna) como mostrado na figura 1A. NOTA: O comprimento da agulha de mistura é proporcional ao volume dentro da agulha e, portanto, pode ser alterado para controlar o tempo de exposição dos hepatócitos para a solução de concentração de CPA alta.</li>
		<li>Insira a tomada de corte da agulha de mistura em uma agulha de injeção de 20 G(Figura 1B). NOTA: O tamanho da agulha de injeção influencia o tamanho da gota.</li>
		<li>Esterilizar a montagem da agulha de mistura por autoclismo.</li>
		<li>Encha um Dewar estéril com nitrogênio líquido. Esterilizar o lado de fora do Dewar com isopropanol antes de colocar o Dewar em um capuz estéril cultura de células de fluxo laminar. NOTA: A contaminação é uma consideração importante durante a exposição direta das gotículas ao nitrogênio líquido. Embora não tenha havido contaminação por nitrogênio líquido não esterilizado no protocolo atual, o nitrogênio líquido pode ser filtrado ou irradiado para garantir a esterilidade, senecessário, 16.</li>
		<li>Insira um funil com o mesmo diâmetro externo que o diâmetro interno do nitrogênio líquido Dewar em um tubo cônico de 50 mL para criar o dispositivo de coleta de gotículas(Figura 1C−E).</li>
		<li>Submergir o dispositivo de coleta de gotículas no nitrogênio líquido, pressionando-o lentamente para baixo em sua posição vertical final usando fórceps grandes. Certifique-se de que o tubo cônico repousa em uma posição vertical na parte inferior do Dewar (Figura 1D−E). NOTA: O funil deve permanecer inserido e descansando no tubo cônico. O nível de nitrogênio líquido deve ser de 1 cm abaixo da altura da inseto do funil, como mostrado na Figura 1D.</li>
		<li>Monte uma bomba de seringa em uma posição vertical na parede da capa da cultura celular, amarrando uma corda dos pés da bomba de seringa para parafusos salientes da parede da capa da cultura celular.</li>
		<li>Coloque o nitrogênio líquido Dewar com o dispositivo de coleta de gotículas a bomba de seringa montada verticalmente(Figura 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>Pré-incubação com CPAs.
	<ol>
<li>Depois de obter hepatócitos de ratos recém-isolados, conte a concentração de estoque pela exclusão azul Trypan e pegue 40 milhões de hepatócitos viáveis. NOTA: O manuseio suave de hepatócitos em suspensão é fundamental para prevenir a morte celular.</li>
		<li>Centrífuga a 50 x g por 5 min sem freio.</li>
		<li>Assao o supernatant e resuspende os hepatócitos em 3.4 mL da solução V1.</li>
		<li>Incubar no gelo por 3 min.</li>
		<li>Adicione 150 μL de DMSO e 150 μL de EG aos hepatócitos e misture suavemente.</li>
		<li>Incubar no gelo por 3 min.</li>
		<li>Mais uma vez, adicione 150 μL de DMSO e 150 μL de EG aos hepatócitos e misture suavemente.</li>
		<li>Carregue 3,5 mL em uma seringa de 3 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar vitrificação.
	<ol>
<li>Insira a seringa com hepatócitos pré-incubados e as seringas da solução V2 no adaptador da bomba de seringa.</li>
		<li>Anexar dois adaptadores fêmeas Luer bloqueio mangueira barb para as seringas e deslize a tubulação de silicone da montagem agulha misturando sobre os acessórios barb(Figura 1F).</li>
		<li>Coloque toda a montagem na bomba de seringa(Figura 1E).</li>
		<li>Três min após a última adição de DMSO e EG aos hepatócitos, iniciar a bomba em 2 mL /min.</li>
		<li>Pare a bomba depois que todos os hepatócitos foram adicionados ao nitrogênio líquido.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Armazenamento criogênico
<ol><li>Fura 10 furos pequenos na tampa de um tubo cónico de 50 mL usando uma agulha de 20 G e envolva a parte externa da tampa com uma película flexível, como mostrado na figura 1B. Isso cria uma válvula que permite a fuga de evaporação de sobras de nitrogênio líquido.</li>
	<li>Para recolher as gotículas de hepatócitovio, primeiro retire o funil do nitrogênio líquido Dewar. Em seguida, use fórceps longos para tomar o tubo cônico que contém as gotículas do nitrogênio líquido e lentamente derramar o excesso de nitrogênio líquido do tubo cônico.</li>
	<li>Feche o tubo cônico com a tampa perfurada e coloque diretamente o tubo cônico fechado com gotículas de hepatócito vitrificadas de volta no nitrogênio líquido Dewar.</li>
	<li>Transfira o tubo cônico do nitrogênio líquido para um criotanque de vapor de nitrogênio líquido.</li>
</ol>3. Reaquecimento das gotículas de hepatócitovi
<ol><li>
Prepare a solução de reaquecimento.
	<ol>
<li>Dissolva 17,13 g de sacarose em 100 mL de mídia de cultura hepatócito DMEM para fazer a solução de reaquecimento. Estéril filtra risto a solução de reaquecimento usando um filtro de 0,22 μm e quente para 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reaqueça os hepatócitos.
	<ol>
<li>Pegue o tubo cônico com hepatócitos vitrificados do criotanque e transportá-lo em um nitrogênio líquido Dewar para o capô da cultura celular.</li>
		<li>Solte levemente a tampa e coloque o tubo cônico de volta no nitrogênio líquido.</li>
		<li>Adicione as gotículas de hepatócitovio a um copo vazio, adicione instantaneamente a solução de reaquecimento quente (37 °C) e mexa imediatamente por 10 s. NOTA: É fundamental trabalhar rapidamente para evitar o congelamento durante o reaquecimento. Dependendo dos requisitos do estudo, algumas gotículas vitrificadas podem ser reaquecidas de uma só vez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Descarregar a solução de reaquecimento.
	<ol>
<li>Divida a solução de reaquecimento com hepatócitos sobre dois tubos cônicos de 50 mL.</li>
		<li>Centrífuga os dois tubos cônicos para 2 min a 100 x g a 4 °C sem freio.</li>
		<li>Ascute o supernatant para deixar um volume total de 12.5 mL usando a marca da graduação do tubo cónico como uma referência e adicione 12.5 mL do dmem frio do gelo por o tubo cónico para diluir a solução rewarming a 50%.</li>
		<li>Resuspenda os hepatócitos e incuba no gelo por 3 min.</li>
		<li>Adicione 25 mL de Gelo frio DMEM por tubo cônico para diluir a solução de reaquecimento para 25%.</li>
		<li>Centrífuga por 5 min a 50 x g a 4 °C sem freio.</li>
		<li>Aspirar o supernatant e resuspender os hepatócitos em 2 mL do meio de cultura desejado para uso. NOTA: Centrifugação gradiente densidade pode ser usado para remover hepatócitos mortos da suspensão celular, se desejar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Droplet+Vitrification%3A+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li>
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<li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectant+Toxicity%3A+Facts%2C+Issues%2C+and+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram interesses financeiros concorrentes. Drs. de Vries, Weng, Toner, Tessier e Uygun têm pedidos de patente provisória relevantes para este estudo. O Dr. Uygun tem um interesse financeiro na Organ Solutions, uma empresa focada no desenvolvimento de tecnologia de preservação de órgãos. Todos os interesses do pesquisador são gerenciados pelo MGH e Partners HealthCare de acordo com suas políticas de conflito de interesses.

Criopreservação de hepatócitos por congelamento lento resulta em redução da viabilidade e função metabólica. Vitrificação oferece uma alternativa promissora para a criopreservação clássica, como lesão de congelamento é completamente evitado9. No entanto, a pré-incubação com CPAs é necessária para reduzir a taxa de resfriamento crítico8. Consequentemente, a vitrificação é dificultada pela toxicidadecpa 17 e limitada a pequenos volumes de amostra. Nos ...

Perda de viabilidade celular e função metabólica após criopreservação de hepatócitos ainda é uma questão importante que limita as aplicações clínicas1,2,3. O método de referência da criopreservação de hepatocitos é o congelamento lento, que é realizado por pré-incubação dos hepatócitos com CPA (dimetil sulfoxida [DMSO], glicose e albumina) e subsequente congelamento da taxa controlada (em aproximadamente 1 °C/min) para temperaturas criogênicas4,5. Apesar de muitas otimizações relatadas, a toxicidade do CPA, juntamente com desequilíbrios osmóticos injuriosos durante o congelamento e o estresse mecânico da formação de gelo, continuam a ser inconvenientes fundamentais de congelamento lento6,7.
Vitrificação oferece uma vantagem sobre o congelamento lento em que a lesão devido à formação de gelo é completamente evitado por uma transição de fase direta da água para o estado de vidro6. No entanto, para atingir a temperatura de transição de vidro da água pura (-137 °C), a água deve ser resfriada a taxas na ordem de um milhão de graus Celsius por segundo (ou seja, a taxa crítica de resfriamento) para evitar a formação de gelo acima da temperatura de transição de vidro8 . A adição de CPAs pode abaixar a taxa refrigerando crítica e aumentar a temperatura de transição de vidro de soluções aquosas9. No entanto, mesmo com altas concentrações de CPA (por exemplo, 40% v/v DMSO ou maiores) taxas de resfriamento rápido são necessárias para vitrificação bem-sucedida8,9.
As taxas de resfriamento necessárias e altas concentrações de CPA resultam em duas grandes desvantagens da vitrificação. Primeiro, para permitir o resfriamento rápido, as amostras devem ter uma baixa massa térmica. Em segundo lugar, para atingir altas concentrações de CPA, evitando lesões osmóticas, os CPAs devem ser lentamente introduzidos e totalmente equilibrados entre os compartimentos intra e extracelular6. Isso aumenta o tempo de exposição das células para CPAs tóxicos. Juntos, isso torna a vitrificação um processo complicado que se limita a algumas amostras de pequeno porte (microlitros) de cada vez. A vitrificação de gotículas foi proposta como uma solução potencial para essas restrições. Ao expor gotículas minúsculas carregadas de células (nanolitros) a nitrogênio líquido, a taxa de resfriamento é significativamente aumentada, o que, consequentemente, permite uma redução considerável na concentração de CPA10,11,12 13,14. Embora vários bicos geradores de gotículas de alta frequência possam ser usados simultaneamente, o tamanho das gotículas extremamente pequenalimita a taxa de produção a microlitros por minuto10,o que impede a vitrificação eficiente de grandes células volumes com magnitudes maiores taxas de processamento na ordem de mililitros por minuto.
Recentemente, foi demonstrado que essas limitações inerentes à vitrificação podem ser superadas pela vitrificação de gotículas em massa15. Este novo método aproveita a desidratação osmótica rápida para concentrar uma concentração intracelular de CPA de 7,5% v/v etilenoglicol e DMSO imediatamente precedendo a vitrificação, eliminando a necessidade de equilíbrio total das concentrações tóxicas de CPA. A desidratação celular é realizada em um dispositivo fluídico por uma breve exposição dos hepatócitos a uma alta concentração extracelular de CPA. Embora esta exposição cause a desidratação osmótica rápida, é demasiado curta para que a concentração elevada do CPA difunda nas pilhas. Imediatamente após a desidratação, as células são carregadas em gotículas que são diretamente vitrificadas em nitrogênio líquido. Este método elimina a necessidade de captação intracelular completa de altas concentrações de CPA, enquanto a alta concentração de CPA extracelular permite a vitrificação de gotículas de grande porte, resultando em altos volumes de taxa de rendimento com toxicidade mínima de CPA.
A vitrificação de gotículas melhora a viabilidade direta e de longo prazo após a preservação, bem como a morfologia e a função metabólica dos hepatócitos primários de ratos em comparação com a criopreservação clássica por15de congelamento lento. Este manuscrito fornece os detalhes metodológicos para vitrificação de gotículas em massa de hepatócitos primários de ratos.

<table><tbody><tr><td>Seringas Descartáveis BD de 3 mL com Pontas Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Béquer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000-250</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW Solução de Armazenamento a Frio</td><td>Ponte para a Vida</td><td>BUW-001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de Soro Bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Fêmea Luer para 1/16" barb de tubo semi-rígido de baixo perfil, PP</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de stroage criogênico / Cryotank</td><td>Chart Industries</td><td>MVE 800</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, pó, glicose alta, piruvato</td><td>Life Technologies</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-21-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td> <td>extra longaFisher Scientific</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tubos de Centrífuga de Plástico de Leitura Fácil de Alta Velocidade - Fechamento de topo plano</td> Linha de pesca <td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stren</td><td>SOFS4-15</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio líquido</td><td>Airgas</td><td>7727-37-9</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Tubo de Silicone Curado com Platina, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de mistura, para uso com funil de pó de polipropileno Nalgene 3HPW1</td><td>Grainger</td><td>3WRL7</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agulha ThermoFisher</td><td>4252-0100</td><td></td></tr><tr><td>20 ga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M - Filme flexível</td><td>Lâmina de barbear Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Espátula</td><td></td> Fisher Scientific 12-640 <td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06369-18</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Steriflip filtro estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose (Cristalino/Certificado ACS)</td>Bomba de Seringa <td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>New</td><td>Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de nitrogênio líquido de bancada Thermo-Flask</td><td>ThermoFisher</td><td>2122</td><td></td></tr></tbody></table>

vitrificação de gotículas em massa para preservação primária de hepatócitos

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

A vitrificação é uma alternativa promissora sem gelo para a criopreservação clássica de congelamento lento (a aproximadamente 1 °C/min) de amostras biológicas. A vitrificação requer taxas de resfriamento extremamente rápidas para alcançar a transição da água para a fase de vidro, evitando a formação de gelo prejudicial. Embora a pré-incubação com agentes crioprotetores (CPA) possa reduzir a taxa crítica de resfriamento de amostras biológicas, altas concentrações são geralmente necessárias para permitir a criopreservação sem gelo por vitrificação. Como resultado, a vitrificação é dificultada pela toxicidade do CPA e restrita a pequenas amostras que podem ser resfriadas rapidamente. Demonstrou-se recentemente que estas limitações inerentes podem ser superadas pela vitrificação da gota maioria. Usando este método novo, as pilhas são pre-incubadas primeiramente com uma baixa concentração intracelular do CPA. Aproveitando a desidratação osmótica rápida, o CPA intracelular está concentrado diretamente à frente da vitrificação, sem a necessidade de equilibrar totalmente as concentrações tóxicas de CPA. A desidratação celular é realizada em um dispositivo fluídico e integrada com a geração contínua de alta taxa de produção de gotículas de grande porte que são vitrificadas em nitrogênio líquido. Este método de criopreservação sem gelo com toxicidade mínima de CPA é adequado para grandes quantidades celulares e resulta em maior viabilidade hepatocito e função metabólica em comparação com a criopreservação clássica de congelamento lento. Este manuscrito descreve os métodos para vitrificação bem-sucedida de gotículas em massa em detalhes.

Hepatócitos primários recém-isolados de cinco fígados de rato diferentes foram usados para uma comparação direta da vitrificação de gotículas em massa com a criopreservação clássica usando os proeminentes protocolos de congelamento lento relatados na literatura4, 5.Em suma, os hepatócitos foram suspensos em UW complementados com BSA (2,2 mg/mL), glicose (333 mM) e DMSO (10% v/v) e congelados por meio de um congelador de taxa controlada. Após o armazenamento em -...

Este manuscrito descreve um método de criopreservação sem gelo para grandes quantidades de hepatócitos de ratos em que as células primárias são pré-incubadas com agentes crioprotetores em baixa concentração e vitrificadas em grandes gotículas.

Vitrificação de gotículas em massa para preservação primária de hepatócitos

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

A vitrificação é tipicamente tratada pela toxicidade dos agentes crioprotetores. E reinserido em pequenas amostras que podem ser resfriadas rapidamente. Este protocolo permite a vitrificação de grandes quantidades celulares enquanto usa uma baixa concentração de CPA durante a pré-incubação.Usando desidratação osmótica rápida, o CPA inter-adega baixo está concentrado no dispositivo fluido diretamente antes da vitrificação. Isso elimina a necessidade de equilibrar totalmente as concentrações tóxicas de CPA. A vitrificação de gotículas em massa pode fornecer hepatócitos viáveis e metabolicamente ativos para o uso de transplante de hepatócitos e dispositivos hepáticos bio-artificiais que atualmente dificultam por desfechos inadequados após a criopreservação.Este método pode potencialmente ser adaptado para vitrificação de outros tipos de células que precisam ser preservados em grandes quantidades; como produtos sanguíneos ou células-tronco, entre outros. Para começar, faça a solução de vitrificação 1 adicionando 40 miligramas de BSA a 17,0 mililitros da University of Wisconsin Solution. Use um filtro de 0,22 micrômetro para filtrar a solução e armazenar a quatro graus Celsius.Faça a solução de vitrificação 2 conforme descrito no protocolo. E filtrar estéril através de um filtro de 0,22 micrômetros. Carregue 3,5 mililitros de solução V2 filtrada estéril em uma seringa de três mililitros e armazene a quatro graus Celsius.Para preparar o aparelho de vitrificação de gota a granel, primeiro, corte ao longo de um lado da manga cinza exterior das agulhas de mistura. Dobre a manga aberta para removê-la da agulha de mistura. Em seguida, corte a agulha de mistura para um comprimento de 20 milímetros e insira sua saída de corte em uma agulha de injeção de calibre 20.Deslize duas seções de tubos de silício de 25 milímetros sobre as entradas da agulha de mistura. E garantir sua posição com cola. Esterilize este conjunto autoclaving.Encha um frasco estéril de Dewar com nitrogênio líquido. E esterilize o exterior com isopropanol antes de colocá-lo em uma estéril capa de cultura laminer. Certifique-se de usar equipamentos de proteção individual adequados, pois o nitrogênio líquido pode causar queimaduras graves.Para criar o dispositivo de coleta de gotículas, insira um funil com o mesmo diâmetro externo do diâmetro interno do Dewar, em um tubo cônico de 50 mililitros. Usando grandes fórceps, pressione lentamente o dispositivo de coleta de gotículas para baixo no nitrogênio líquido em sua posição vertical final. Certifique-se de que o tubo cônico repousa na posição vertical na parte inferior do Dewar.E o nível de nitrogênio líquido é um centímetro mais baixo que a borda do funil. Para montar uma bomba de seringa em uma posição vertical na parede do capô de cultura celular, amarre uma corda dos pés da bomba de seringa aos parafusos salientes da parede do capô da cultura celular. Em seguida, coloque o nitrogênio líquido Dewar com o dispositivo de coleta de gotículas sob a bomba de seringa verticalmente montada.Após a obtenção de hepatócitos de rato recém-isolados, conte a concentração de estoque por exclusão azul tri-pan. E transferir 40 milhões de hepatócitos viáveis para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar os hepatócitos a 50 vezes G por cinco minutos sem pausa.Aspire o supernatante. Suspenda os hepatócitos em 3,4 mililitros da Solução V1. E incubar no gelo por três minutos.Em seguida, adicione 150 microliters de DMSO e 150 microliters de EG;misture suavemente e incubar no gelo novamente por três minutos. Adicione 150 microliters de DMSO e 150 microliters de EG aos hepatócitos novamente e misture suavemente. Carregue 3,5 mililitros desta mistura em uma seringa de três mililitros.Insira a seringa com hepatócitos pré-incubados e a seringa com solução V2 no adaptador da bomba de seringa. Conecte dois adaptadores femininos de mangueira-barb Luer Lock às seringas. E deslize a tubulação de silicone do conjunto de agulhas de mistura sobre os encaixes de barb.Coloque toda essa montagem na bomba de seringa. Três minutos após a última edição de DMSO e EG para os hepatócitos, inicie a bomba a dois mililitros por minuto. Depois de todos os hepatócitos foram adicionados ao nitrogênio líquido parar a bomba.Usando uma agulha calibre 20, puna 10 pequenos furos na tampa de um tubo cônico de 50 mililitros. E enrole o lado de fora da tampa com um filme flexível, criando uma válvula que permitirá a fuga da evaporação do nitrogênio líquido restante. Para coletar as gotículas de hepatócito vitrificadas, primeiro remova o funil do Dewar com nitrogênio líquido.Em seguida, com fórceps longos, retire o tubo cônico que contém as gotículas do nitrogênio líquido, e despeje lentamente o excesso de nitrogênio líquido do tubo cônico. Feche o tubo cônico com a tampa perfurada e, em seguida, coloque diretamente o tubo cônico fechado com gotículas de hepatócitas vitrificadas de volta no Dewar com nitrogênio líquido. Finalmente, transfira o tubo cônico do nitrogênio líquido para um criotank de nitrogênio líquido.Depois de fazer a solução de reaquecimento com sacarose e mídia de cultura hepatócida DMEM, use um filtro de 0,22 micrômetro para filtrar estéril. Em seguida, aqueça-o a 37 graus Celsius. Para reaquecir os hepatócitos remova o tubo cônico com hepatócitos vitrificados do criotank e transporte-o em um nitrogênio líquido Dewar para a subcultura.Solte levemente a tampa e coloque o tubo cônico de volta no nitrogênio líquido. Trabalhando rapidamente, adicione todas as gotículas de hepatócito vitrificadas a um béquer vazio, em seguida, adicione rapidamente 100 mililitros de solução de reaquecimento quente de 37 graus Celsius enquanto mexe por 10 segundos. Quando as gotículas são removidas do congelamento intra-est de nitrogênio líquido ocorre em segundos se as gotículas não forem rapidamente recasadas.Portanto, é fundamental adicionar diretamente a mídia de reaquecimento às gotículas enquanto mexe. Divida a solução de reaquecimento com hepatócitos em dois tubos cônicos de 50 mililitros. Centrifugar os tubos por dois minutos a 100 vezes G a quatro graus Celsius sem quebrar.Aspire os supernantes para deixar um volume total de 12,5 mililitros usando a marca de graduação do tubo como referência. Para diluir a solução de reaquecimento a 50% adicione 12,5 mililitros de DMEM gelado por tubo cônico. Suspenda e incuba no gelo por três minutos.Para diluir a solução de reaquecimento a 25% adicione 25 mililitros de DMEM gelado por tubo cônico. Depois de centrifugar por cinco minutos a 50 vezes G a quatro graus Celsius sem pausa, aspirar o supernatário e suspender os hepatócitos em dois mililitros do meio de cultura desejado. Quando medido por testes de exclusão azul tri-pan, que determina a integridade da membrana, a vitrificação de gotículas em massa resultou em uma viabilidade hepatócida pós-preservação direta de 79%Esta foi significativamente maior do que a viabilidade de 68% após a criopreservação clássica otimizada.O rendimento da vitrificação de gotículas a granel foi de 56%, 10% maior e mais consistente que a criopreservação clássica. Usando o ensaio de metabolização de pré-cola em culturas universitárias e sanduíches de longo prazo, a atividade metabólica nos hepatócitos foi medida para ser significativamente maior após a vitrificação de gotículas em massa, em seguida, após a criopreservação clássica. A síntese de albumina, como o parâmetro mais utilizado da função sintética dos hepatocitos, foi maior em quase duas vezes após a vitrificação de gotículas a granel, depois da criopreservação clássica.A produção de ureia foi usada para medir a função de desintoxicação de hepatócitos em uma cultura de uma semana. Em hepatocitos vitrificados a granel, a produção de ureia foi significativamente maior do que a dos hepatócitos criopreservados clássicos. Para resultados consistentes após a vitrificação de gotículas em massa, é importante acompanhar exatamente o tempo durante a pré-incubação de CPAs e reaquecimento conforme detalhado neste protocolo.Depois de reaquecimento das gotículas de hepatócitas vitrificadas, você acabará com uma suspensão de tamanho melhor que, portanto, pode ser usada da mesma forma como se estivessem recém-isoladas. Como um método de preservação melhorado, a vitrificação de gotículas em massa pode aumentar a disponibilidade pri-ma para pesquisas e aplicações clínicas.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Uma técnica para isolar hepatócitos humanos e células hepáticas não parenquimatosas do mesmo doador é descrita. Os diferentes tipos de células hepáticas constroem a base para modelos funcionais de fígado e engenharia de tecidos. Este novo método visa isolar células hepáticas com alto rendimento e viabilidade.

Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

O objetivo do presente protocolo é obter alta viabilidade e alto rendimento de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais do fígado. Isso é realizado pela perfusing o fígado com uma solução de colagenase tipo IV através da veia portal, seguida por centrifugação diferencial para obter hepatócitos e células endoteliais sinusoidais.

Purificação de hepatócitos e células endoteliais sinusoidais de fígado de rato perfusão

Aqui, apresentamos um protocolo para a isolação dos hepatócitos saudável e funcional principal do rato. Instruções para a detecção de síntese hepática da proteína nascente por substrato de rotulagem não-radioativo foram fornecidas para ajudar a compreender os mecanismos subjacentes a síntese de proteínas no contexto da homeostase do metabolismo energético no fígado.

Isolamento dos hepatócitos primários de rato para análise de síntese de proteína nascente pelo método de rotulagem não-radioativo L-azidohomoalanine

O objetivo do presente protocolo é fornecer um guia passo a passo para realizar experiências em 3-d "fígado-on-a-chip" infecção com o vírus da hepatite B.

"Fígado-on-a-Chip" culturas de hepatócitos primários e células de Kupffer para infecção pelo vírus da hepatite B

Apresentado aqui é um protocolo para o isolamento de hepatócitos de camundongos de fígados de camundongos adultos usando uma técnica de perfusão de colagem modificada. Também é descrita a cultura de longo prazo dos hepatócitos em um ambiente de sanduíche de colágeno 3D, bem como imunorotulagem dos componentes citoesqueléticos para estudar a formação canalicular biliar e sua resposta ao tratamento.

Isolamento e cultura sanduíche de colágeno 3D de hepatócitos de camundongos primários para estudar o papel do citoesqueleto na formação bile canalicular in vitro

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

O ácido graxo β-oxidação é uma via metabólica essencial responsável pela geração de energia em muitos tipos diferentes de células, incluindo hepatócitos. Aqui, descrevemos um método para medir o ácido graxo β-oxidação em hepatócitos primários recém-isolados usando ácido palmítico de 14C.

Medição do ácido graxo β-oxidação em uma suspensão de hepatócitos de rato recém-isolados

Este protocolo descreve técnicas para isolar hepatócitos primários do fígado e eletroporar CRISPR-Cas9 como ribonucleoproteínas e mRNA para interromper um gene alvo terapêutico associado a uma doença metabólica herdada do fígado. Os métodos descritos resultam em alta viabilidade e altos níveis de modificação genética após a eletroporação.

Entrega mediada por eletroporação de cas9 ribonucleoproteínas e mRNA em hepatócitos de rato primário recém-isolados

Hepatócitos carregados de lipídios são inerentes à regeneração hepática, mas geralmente são perdidos após a centrifugação do gradiente de densidade. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento celular otimizado que retém hepatócitos esteatóticos, produzindo populações representativas de hepatócitos regeneradores após hepatectomia parcial em camundongos.

Isolamento de Hepatócitos Regeneradores após Hepatectomia Parcial em Camundongos

Este protocolo apresenta uma técnica otimizada de perfusão hepática de colagenase em duas etapas em um modelo de rato e mostra o uso de hepatócitos isolados para cultura in vitro de longo prazo de organoides 3D.

Perfusão hepática de ratos e isolamento primário de hepatócitos: um procedimento antigo crucial para a cultura de organoides 3D de ponta

Aprenda a vitrificar grandes quantidades de hepatócitos de rato usando concentrações baixas de agentes crioprotetores. Este método melhora a viabilidade celular e a atividade metabólica para transplantes.

Vitrificação de gotículas em massa para preservação primária de hepatócitos

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