Estabelecimento e caracterização de spheroids do tumor neuroendócrino das entranhas pequenas
14 de outubro de 2019
Os tumores neuroendócrinos (NETs) são originários de células neuroendócrinas da crista neural. Eles são lentos crescimento e desafiador para a cultura. Nós apresentamos uma estratégia alternativa para crescer redes das entranhas pequenas cultivando as como spheroids. Estes esferoides têm marcadores líquidos das entranhas pequenas e podem ser usados para o teste de droga.
Células SBNET bem diferenciadas são de crescimento lento e difíceis de propagar. As poucas linhas celulares estabelecidas não estão prontamente disponíveis para os pesquisadores. Para superar essas limitações, desenvolvemos esse protocolo de cultura 3D.
A vantagem dessa técnica sobre o método tradicional de estabelecer uma linha celular SBNET é que culturas 3D podem ser obtidas e testes de drogas podem ser feitos dentro de três semanas. Este método pode ser aplicado a outros tumores neuroendócrinos, como tumores neuroendócrinos do pâncreas. Depois de obter uma amostra SBNET do paciente resseced, corte-a em cubos de cinco milímetros e armazene-a em 25 mililitros de meio DMEM F12 em um tubo cônico para transporte.
Incubar os tumores em meio de lavagem preparados de acordo com as instruções do manuscrito por 15 minutos. Em seguida, transfira-os para um novo prato e pique-os para pedaços de menos de um milímetro usando tesouras curvas estéreis. Transfira os tecidos picados para um novo tubo de 50 mililitros contendo 25 mililitros de meio de lavagem, depois centrifugar a amostra a 500 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o supernante e resuspenja as pelotas em 10 mililitros de meio de lavagem com colagemnase e DNase. Deixe os tumores picados digerirem a 37 graus Celsius com agitação lenta por 90 minutos. É importante não digerir demais as amostras do tumor.
Muita enzima ou tempo de incubação mais longo matará células SBNET. Depois que a digestão estiver completa, centrifufique o tubo a 500 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 15 mililitros de meio de lavagem.
Coloque um coador de células de 70 micrômetros em cima de um novo tubo de 50 mililitros e transfira 10 mililitros do tampão de lavagem através do coador. Gire o tampão de lavagem dentro do tubo para evitar que as células grudem nas laterais. Em seguida, filtre a suspensão da célula através do coador.
Centrifugar as células a 500 vezes g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 200 microliters de meio de lavagem. Coloque o tubo no gelo e use cinco microliters das células para contagem de células com um hemócito.
Calcule o número de células, em seguida, repita a centrifugação para remover o supernaspe e resuspense as células em ECM líquido a uma concentração de um milhão de células por mililitro. Em seguida, transfira de cinco a 20 microlitadores de esferoides SBNET em ECM para uma placa de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius para permitir que o ECM líquido se solidifique. Adicione 200 microliters de cultura SBNET ao meio de cada poço contendo esferoides ou cultura dos organoides em mídia de células-tronco como descrito anteriormente.
Use uma pipeta P1000 para transferir os organoides para um tubo de 1,5 mililitro e centrífugue o tubo a 1.500 vezes g durante um minuto para remover o supernante. Lave a cultura com um mililitro de PBS e centrífuga novamente para remover o supernaspe. Em seguida, fixar os organoides adicionando 500 microliters de paraformaldeído e incubando-os por 15 minutos.
Após a incubação, lave a cultura duas vezes com um mililitro de PBS. Adicione 500 microliters de PBS com 3%BSA e 0,1% Triton X-100 para permeabiliizar a cultura. Incubar o tubo por cinco minutos, depois lave os organoides três vezes com um mililitro de PBS e 3%BSA.
Em seguida, incubar a cultura com anticorpos primários por uma hora e depois repetir as lavagens com PBS e BSA. Incubar com os anticorpos secundários e repetir as lavagens certificando-se de aspirar e descartar todos os supernascidas. Para imaginar os esferoides, adicione cinco microliters de meio de montagem contendo DAPI e use uma pipeta P20 para transferir cinco microliters dos esferoides para um slide de vidro.
Sele o slide com um deslizamento e imagem com um microscópio de fluorescência usando os objetivos 10, 20 e 40X. Quebrar mecanicamente o ECM com uma pipeta P1000 e transferi-lo para um tubo estéril de 1,5 mililitro. Centrifugar o tubo a 1.000 vezes g a quatro graus Celsius.
Em seguida, remova todos os supernaspentes e coloque o tubo no gelo. Adicione duas a quatro vezes o volume do novo ECM à pelota e misture o conteúdo do tubo por tubos para cima e para baixo 10 vezes, certificando-se de evitar a introdução de bolhas de ar. Transfira de cinco a 20 microlitadores da mistura ECM e SBNET para uma nova placa de poço 96 e permita que o ECM se solidifique.
Em seguida, cubra o ECM solidificado com o novo meio SBNET e coloque a placa na incubadora. Se enviar spheroids SBNET para outro laboratório, transfira os esferoides com o novo ECM para um frasco T25 e permita que o ECM se solidifique. Encha o frasco com o meio esferoide SBNET, enrosque a tampa firmemente e prepare o pacote de envio.
Ao receber a cultura esferoide, remova o meio de cultura e repita os passos anteriores para colocar os esferoides de volta à cultura. A taxa de crescimento esferoide da SBNET foi monitorada com imagens microscópicas. Leva aproximadamente 14 dias para que os spheroids da SBNET dobrem de tamanho quando a mídia cultural é alterada uma vez por semana.
Após 14 dias na cultura, os spheroids sbnet não aumentam de tamanho. Os esferoides foram manchados com anticorpos específicos contra sinápticos, cromogranin A e SSTR2 e imagedos usando microscopia de imunofluorescência. Os dados mostraram que esses marcadores estão localizados no citoplasma e na membrana das células SBNET.
Para garantir a especificidade dos anticorpos, os mesmos procedimentos de coloração foram realizados em uma linha organoide a partir de um tumor de pâncreas que não expressa sinaptofisina, cromogranin A e SSTR2 e nenhum sinal verde foi detectado. A principal vantagem da imagem de imunofluorescência é que ela pode ser realizada dentro de quatro horas e dar informações de coloração semelhantes à imunohistoquímica. A culturação do SBNET como esferoides é uma técnica valiosa para identificar drogas que podem inibir o crescimento da SBNET.
Os esferoides foram tratados com rapamicina e inibidor de mTOR. Após cinco dias, o esferoide tratado com rapamicina formou uma estrutura semelhante à uva e tornou-se apoptótico ou necrosado. Ao tentar este procedimento, é importante pré-molhar o coador celular e o tubo de coleta com meio de lavagem.
Isso evitará que as células SBNET grudem no coador celular e no tubo plástico. Com este protocolo, cientistas e médicos podem estabelecer culturas eferóides da SBNET a partir de tumores ressecados, compartilhá-los com outros laboratórios e usá-los para testar medicamentos aprovados pela FDA.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo protocolo de cultura 3D para o crescimento de tumores neuroendócrinos do intestino delgado (SBNETs) bem diferenciados a partir de amostras de pacientes. Este método permite a realização de testes com fármacos em até três semanas, superando as limitações do estabelecimento tradicional de linhagens celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Tumores neuroendócrinos
- Técnicas de cultura celular
- Metodologias de testagem de fármacos
Contexto
- Os tumores neuroendócrinos (TNEs) surgem a partir de células neuroendócrinas.
- Os TNEs intestinais são de crescimento lento e difíceis de cultivar.
- Linhas celulares estabelecidas são escassas e não amplamente disponíveis.
- Técnicas de cultivo tridimensional podem melhorar a propagação e os testes.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o cultivo de SBNETs.
- Facilitar a realização de testes de fármacos em NETs cultivadas.
- Fornecer um protocolo aplicável a outros tipos de tumores neuroendócrinos.
Métodos Utilizados
- As amostras de SBNET ressecadas de pacientes foram cortadas em cubos de cinco milímetros.
- As amostras foram armazenadas em meio DMEM F12 para transporte.
- O protocolo de cultivo 3D foi implementado para o crescimento celular.
- Os testes com fármacos foram realizados dentro de três semanas após o cultivo.
Resultados Principais
- Os cultivos 3D exibiram marcadores de NET do intestino delgado.
- Testes de fármacos foram realizados com sucesso em esferoides cultivados.
- O método mostrou potencial para aplicação em NETs pancreáticos.
- Os resultados indicam uma alternativa mais rápida para o estabelecimento tradicional de linhagens celulares.
Conclusões
- O método de cultivo 3D é eficaz para a propagação de SBNET.
- Essa abordagem pode acelerar os prazos de testes de fármacos.
- Pesquisas futuras podem expandir sua aplicação a outras NETs.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de modelos pré-clínicos confiáveis para cânceres raros, como tumores neuroendócrinos do intestino delgado (SBNETs), continua sendo um gargalo significativo no desenvolvimento de medicamentos oncológicos, devido à disponibilidade limitada de linhagens celulares derivadas de pacientes e às taxas lentas de proliferação. Este método de cultura de esferoides tridimensionais permite a geração rápida de modelos de SBNET fisiologicamente relevantes a partir de tumores ressecados, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos dentro de um período de três semanas. Ao preservar a expressão de marcadores neuroendócrinos e as características de resposta a medicamentos, a abordagem aumenta a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta e apoia a priorização de portfólios para terapias direcionadas a NETs.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas utilizando esferoides de SBNET derivados de pacientes que mantêm a expressão de marcadores neuroendócrinos (sinaptofisina, cromogranina A, SSTR2).
- Valor Operacional: Oferece um sistema de cultura 3D reproduzível para validação funcional de alvos, sem os longos prazos necessários para o estabelecimento de linhagens celulares tradicionais.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos biológicos ao manter condições semelhantes ao microambiente tumoral por meio do encapsulamento em matriz extracelular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaio: Gera esferoides SBNET padronizados adequados para triagem de compostos, com a possibilidade de testes farmacológicos dentro de três semanas após o início do cultivo.
- Resultados quantitativos: Permite a medição de respostas citotóxicas por meio de alterações estruturais (por exemplo, morfologia semelhante a uvas) e marcadores de apoptose/necrose após tratamento com agentes como a rapamicina.
- Escalabilidade e reutilização: Os esferoides podem ser criopreservados, enviados em matriz extracelular (ECM) e reestabelecidos em laboratórios receptores, permitindo a padronização de ensaios entre diferentes laboratórios.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Mantém os principais biomarcadores do SBNET em cultura de esferoides, apoiando a continuidade translacional da descoberta à validação pré-clínica.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação de inibidores da via mTOR em um modelo 3D de NET clinicamente relevante antes de estudos in vivo.
- Avanço com Base em Risco: Facilita decisões precoces de prosseguir ou interromper com base nos perfis de resposta medicamentosa em esferoides, reduzindo o risco de falha em estágios avançados.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao fluxo de trabalho de descoberta ao fornecer um modelo pré-clínico rápido para validação de alvos e identificação de compostos promissores, conectando a biologia inicial com triagem mecanicista antes da validação in vivo.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias utilizando esferoides de SBNET derivados de pacientes que refletem a biologia tumoral nativa.
- Triagem: Permite a produção de esferoides prontos para ensaios, para avaliação de bibliotecas de compostos com leituras quantificáveis de citotoxicidade.
- Análises: Gera dados de imunofluorescência e morfológicos para avaliar o engajamento do alvo e as respostas fenotípicas.
- Pesquisa Translacional: Preserva o fenótipo neuroendócrino, permitindo estudos alinhados a biomarcadores, desde esferoides até modelos pré-clínicos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma de esferoides de SBNET compartilhável e reprodutível, aplicável entre equipes de descoberta e colaboradores externos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos ao preservar a identidade neuroendócrina e a resposta a fármacos em um modelo tridimensional derivado de pacientes.
- Valor Operacional: Fornece culturas padronizadas e escalonáveis de esferoides com cinética de crescimento definida (duplicação em aproximadamente 14 dias) e compatibilidade com fluxos de trabalho de imunofluorescência.
- Valor Estratégico: Acelera os prazos pré-clínicos, permitindo uma desmistificação mecanicista mais rápida e maior eficiência de capital na descoberta de fármacos para cânceres raros.
- Impacto no Portfólio: Orienta a priorização ajustada ao risco de candidatos direcionados a NETs por meio de triagem fenotípica precoce em um modelo clinicamente relevante.
Considerações sobre a Implementação
- Exige expertise no processamento estéril de tecidos, digestão enzimática e manipulação de matriz extracelular tridimensional.
- Depende do acesso à centrifugação, filtração celular, microscopia de fluorescência e incubadoras-padrão de cultura celular.
- Necessita de preparação padronizada do meio de lavagem e da matriz extracelular em diferentes locais para garantir a integridade dos esferoides e a retenção de marcadores.
- Requer otimização de painéis de anticorpos e condições de permeabilização para detecção consistente por imunofluorescência de marcadores de NETs intestinais.
- Limitado pela disponibilidade de tecido de NET intestinal ressecado fresco e pela necessidade de evitar superdigestão durante o tratamento com colagenase/DNase.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
0:44
Small Bowel Neuroendocrine Tumor (SBNET) Collection and Cell Dissociation
2:10
Culture of SBNET as Tumor Spheroids in ECM
4:02
Characterization of SBNET Spheroids by Immunofluorescence
5:50
Splitting SBNET Spheroids
7:23
Results: Immunofluorescence Imaging and Drug Testing of SBNET Spheroids
9:02
Conclusion
