Name: Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Aprenda a quantificar 40 metabolitos do metabolismo central de carbono e energia em síntese de proteínas livres de células usando cromatografia líquida de fase reversa e espectrometria de massa com anilina.

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O trabalho descrito foi apoiado pelo Centro de Física do Metabolismo do Câncer através do Prêmio Número 1U54CA210184-01 do Instituto Nacional do Câncer (https://www.cancer.gov/). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto do estudo, na coleta e na análise de dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.

1. Preparação de reagentes para marcação de aniline
<ol><li>Prepare uma solução aniline de 6 M no pH 4.5. Trabalhando em um capô, combinar 550 μL de aniline com 337,5 μL de água grau LCMS e 112,5 μL de 12 M ácido clorídrico (HCl) em um tubo de centrífuga. Vortex bem e armazenar a 4 °C. NOTA: A aniline pode ser armazenada a 4 °C por 2 meses. CUIDADO: Aniline é altamente tóxico e deve ser trabalhado com em um capô de fumaça. O ácido clorídrico é altamente corrosivo</li>
	<li>Prepare uma solução aniline 6 M 13C no pH 4.5. Combine 250 mg de 13C6-aniline com 132 μL de água e 44 μL de 12 M HCl. Vortex bem e armazenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare 200 mg/mL N-(3-dimetilaminopropyl)-N-etilcarbodiimide hidrochloride (EDC) solução. Dissolva 2 mg de EDC em 10 μL de água para cada amostra a ser marcada e vórtice bem. NOTA: A solução EDC deve ser preparada no mesmo dia da reação. Edc atua como um catalisador para a derivatização de compostos com aniline12.</li>
</ol>2. Preparação de normas
<ol><li>Faça soluções de estoque separadas de todos os compostos dissolvidos em água de grau LC/MS(Tabela 1).</li>
	<li>
Preparação da solução de ações padrão interno
	<ol>
<li>Combine todos os compostos com exceção do dinucleotídeo de adenina (NAD), fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADP), flavin adenina dinucleotídeo (FAD), coenzima acetil A (ACA) e glicerol 3-fosfato (Gly3P), com os volumes apropriados para criar uma solução de estoque de 2 mM de todos os compostos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Combine NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P com os volumes apropriados para criar uma solução de estoque de 2 mM.</li>
</ol>3. Preparação daamostra (Figura 1)
<ol><li>Saciar e precipitar as proteínas em uma reação de síntese de proteínas livre de células, adicionando um volume igual de etanol gelado 100% à reação. Centrífuga a amostra a 12.000 x g por 15 min a 4 °C. Transfira o supernatant para um novo tubo de centrífuga. NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C neste momento e analisadas em um momento posterior</li>
</ol>4. Reação de rotulagem
<ol><li>
Amostra de rotulagem com solução 12C-animenais
	<ol>
<li>Transfira 6 μL de amostra em um novo tubo de centrífuga e elevará o volume para 50 μL comágua. NOTA: O tamanho da amostra de volume pode depender da reação específica do CFPS.</li>
		<li>Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.</li>
		<li>Adicione 5 μL de 12solução c-aninilina. NOTA: A solução de aniline separa em duas fases. Misture bem antes de adicionar à reação.</li>
		<li>Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de trietimamina (TEA) à reação em um capô de fumaça. NOTA: Trietimamina levanta o pH da solução que pára a reação de marcação de aniline e estabiliza os compostos. CUIDADO: A trietimamina é tóxica e causa irritação dos olhos e do trato respiratório.</li>
		<li>Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rotulagem de padrões internos com 13solução c-animenaline
	<ol>
<li>Diluir a solução de estoque interno para 80 μM com um volume final de 50 μL. NOTA: A concentração de padrões internos pode ser ajustada a níveis próximos à amostra experimental.</li>
		<li>Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.</li>
		<li>Adicione 5 μL de 13solução c-aninilina.</li>
		<li>Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de CHÁ à reação em um capô de fumaça.</li>
		<li>Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Combinando padrão interno marcado e amostra marcada
	<ol>
<li>Misture 25 μL de 12amostra rotulada de aninilidade C com 25 μL de 13padrão de metais C.</li>
		<li>Transfira para um frasco de amostra automática e analise pelo procedimento LC/MS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Criando uma curva padrão para metabólitos não marcados
	<ol>
<li>Solução de estoque diluído de metabólitos não escalonados (NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P) para concentrações finais de 320 μM, 80 μM, 20 μM e 5 μM com um volume de 50 μL.</li>
		<li>Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.</li>
		<li>Adicione 5 μL de 12solução c-aninilina.</li>
		<li>Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de CHÁ à reação em um capô de fumaça.</li>
		<li>Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.</li>
		<li>Transfira o supernatant a um frasco do auto-sampler e analise pelo procedimento do LC/MS. NOTA: Os metabólitos não marcados seguem o mesmo procedimento que a amostra para replicar a matriz da amostra, a fim de manter a eficiência de ionização semelhante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Configuração do procedimento LC/MS
<ol><li>
Preparação de solventes
	<ol>
<li>Prepare 5 m tri-butilamina (TBA) solução aquosa ajustada ao pH 4.75 com ácido acético. NOTA: TBA na fase móvel ajuda os analitistas alcançar boa resolução e separação14.</li>
		<li>Prepare 5 mM TBA em acetônio (ACN).</li>
		<li>Prepare o solvente da lavagem com água de 5% e 95% ACN.</li>
		<li>Prepare o solvente da remoção com água de 95% e 5% ACN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criação das condições da EM<ol>
<li>Defina o espectrômetro de massa para o modo de íon negativo com uma temperatura de sonda de 520 °C, tensão capilar negativa de -0,8 kV, tensão capilar positiva de 0,8 kV e defina o software para adquirir dados em 5 pontos/s.</li>
		<li>Defina gravações de íons selecionados (SIR) para cada metabólito com tensões de cone especificadas e valores de massa acima da carga (m/z). Veja a Tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inicialização da LC/MS de acordo com as instruções do fabricante
	<ol>
<li>Primeiras linhas solventes no gerente de solvente por 3 min.</li>
		<li>Solvente de lavagem prime (5% de água, 95% ACN) e solvente de purga (95% de água, 5% ACN) para 15 s por 5 ciclos.</li>
		<li>Defina o gerente da amostra a 10 °C.</li>
		<li>Instale uma coluna C18 (1,7μm, 2,1mm x 150mm) e ininicialize a coluna com 100% ACN a 0,3 mL/min por 10 min.</li>
		<li>Condicionar a coluna em 95% de água e 5% ACN em 0,3 mL/min por 10 minutos antes da introdução de solventes com buffers.</li>
		<li>Condicionar a coluna a 95% solvente A (5mM TBA aquoso, pH 4.75) e 5% solvente B (5 mM TBA em ACN) em 0.3 mL/min por 10 min.</li>
		<li>Configure um protocolo de gradiente com a elução a partir de 95% solvente A e 5% solvente B, aumentado para 70% solvente B em 10 min, aumentado para 100% solvente B em 2 min e mantido em 100% solvente B por 3 min. Retorno às condições iniciais (95% solvente A , 5% solvente B) mais de 1 min e segurar por 9 min para reequilibrar a coluna.</li>
		<li>Condicionar a coluna com o protocolo de gradiente 3 vezes antes de quaisquer injeções na coluna.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Injetar amostra e padrões
	<ol>
<li>Injete 5 μL da amostra na coluna e adquira as intensidades apropriadas do íon do m/z para a amostra marcada 12C-aniline.</li>
		<li>Injete 5 μL da mesma amostra novamente, mas desta vez adquirir as intensidades de íons m/z para os 13padrões marcados c-aniline. NOTA: Nosso sistema LC/MS é incapaz de adquirir intensidades de 12C e 13C m/z nas janelas de tempo SIR especificadas, uma vez que são dados demais para adquirir na janela de tempo especificada. Portanto, injetamos a mesma amostra duas vezes.</li>
		<li>Injete padrões de metabolizados não marcados da menor concentração para a mais alta e registre as intensidades adequadas de íons m/z.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Quantificação
<ol><li>Criação do método de exportação
	<ol>
<li>No software de aquisição de dados, selecione Arquivo &gt; Novo Método &gt; Métodode Exportação .</li>
		<li>Especifique um nome de arquivo, como AnilineTagging_Date.</li>
		<li>Verifique o Arquivo Export ASCII e escolha um diretório para exportar o arquivo de texto para.</li>
		<li>No tipo de relatório,selecione resumo por todos.</li>
		<li>Em Delimiters,para coluna selecione a,. Para Row,selecione [cr][se].</li>
		<li>Na tabela,selecione exportação e, em seguida, eitie tabela para incluir SampleName, Área, Altura, Quantidade e Unidades.</li>
		<li>Salvar o método de exportação.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificar metabólitos com padrões internos usando software de aquisição de dados
	<ol>
<li>De acordo com a guia Sample Sets, clique na execução LC/MS correspondente e selecione View as &gt; Canais.</li>
		<li>Selecione todos os canais SIR para os 13padrões internos c-aniline de uma injeção, clique certo e revisãoselecionada.</li>
		<li>Se a janela de layout do método de processamento LC não aparecer automaticamente, acesse o Layout do Método de Processamento View &amp;gt.</li>
		<li>No layout do método de processamento,acesse a guia integração e defina o ApexTrack como algoritmo.</li>
		<li>Vá para a guia de suavização e definir o tipo de média e o nível de suavização para 13. NOTA: Qualquer nível de suavização pode ser selecionado, desde que seja consistente em todas as amostras.</li>
		<li>Na aba MS Channel, desabilitar MS 3D Processing.</li>
		<li>Na janela do canal SIR, integrar cada pico, um canal de cada vez. Uma vez que um pico é integrado, vá para opções &gt; Preencha a partir do resultado e os detalhes do pico serão preenchidos na guia Componentes. Alterar o nome de pico para o nome composto correspondente.</li>
		<li>Uma vez que todos os canais SIR foram avaliados, salvar o método de processamento e fechar janela.</li>
		<li>Selecione todos os canais SIR da amostra 13C-aniline e 12com marcação C-aniline, clique direito e processoseleto.</li>
		<li>Verifique a caixa de processo, selecione use o método de processamento especificadoe escolha o método de processamento que é apenas salvo. Verifique também a caixa de exportação, selecione método de exportação especificado use e escolha o método de exportação salvo criado anteriormente. Clique ok.
</li>
		<li>Abra o arquivo de texto exportado com o Excel e calcule a concentração do composto desconhecido usando: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60329/60329eq1.jpg"> onde Cx, i é a concentração da amostra desconhecida para metabólito i, Ax,i é a área integrada do metabolito desconhecido i, Astd,i é a área integrada do padrão interno de metabolito i, Cstd, i é o concentração do padrão interno de metabólito i, e D é o fator de diluição.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantificar metabólitos não marcados com curva padrão
	<ol>
<li>De acordo com a guia Sample Sets, clique na execução LC/MS correspondente e selecione View as &gt; Canais.</li>
		<li>Selecione todos os canais SIR para os padrões não marcados de uma injeção, clique certo e selecione Revisão.</li>
		<li>Se a janela de layout do método de processamento LC não aparecer automaticamente, acesse o Layout do Método de Processamento View &amp;gt.</li>
		<li>No layout do método de processamento, acesse a guia integração e defina o ApexTrack como algoritmo.</li>
		<li>Vá para a guia de suavização e definir o tipo de média e o nível de suavização para 13. NOTA: Qualquer nível de suavização pode ser selecionado, desde que seja consistente em todas as amostras.</li>
		<li>Na aba MS Channel, desabilitar MS 3D Processing.</li>
		<li>Na janela do canal SIR, integrar cada pico, um canal de cada vez. Uma vez que um pico é integrado, vá para opções &gt; Preencha a partir do resultado e os detalhes do pico serão preenchidos na guia Componentes. Alterar o nome de pico para o nome composto correspondente.</li>
		<li>Uma vez que todos os canais SIR foram avaliados, salvar o método de processamento e fechar janela.</li>
		<li>De acordo com a guia Sample Sets, clique no conjunto de amostras e selecione Alter Sample.</li>
		<li>Selecione valor na nova janela.</li>
		<li>Selecione a cópia do método Process e escolha o método de processo que acabou de ser salvo.</li>
		<li>Digite a concentração de cada metabólito para cada frasco e entre na unidade como &lt;μM para cada componente (ou a unidade correspondente) e selecione OK.</li>
		<li>Selecione a amostra definida novamente, clique direito, Ver como &gt; Canais.</li>
		<li>Selecione todos os canais SIR dos metabólitos não marcados para os padrões, clique direito e processoseleto.</li>
		<li>Verifique a caixa do processo e escolha o método de processamento especificadouse. Selecione o método de processamento apropriado e clique em OK.</li>
		<li>Selecione os canais SIR para todos os metabólitos não marcados para as amostras, clique direito e processoselecionado.</li>
		<li>Verifique a caixa do processo, selecione use o método de processamento especificado e escolha o método de processamento que acabou de ser salvo. Verifique também a caixa de exportação, selecione método de exportação especificado use e escolha o método de exportação salvo criado anteriormente. Clique OK.</li>
		<li>Quantifique os metabólitos não escalonados com a curva padrão e exporte os resultados para um arquivo de texto para o diretório especificado.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os sistemas livres de células não têm parede celular, portanto, há acesso direto a metabólitos e as máquinas biossintéticas sem a necessidade de preparação complexa da amostra. No entanto, muito pouco trabalho tem sido feito para desenvolver protocolos completos e robustos para interrogar quantitativamente sistemas de reação livres de células. Neste estudo, desenvolvemos um método rápido e robusto para quantificar metabólitos em misturas de reação livre de células e potencialmente em extratos de células inteiras. Quantif...

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma plataforma promissora para a fabricação de proteínas e produtos químicos, uma aplicação que tradicionalmente tem sido reservada para células vivas. Sistemas livres de células são derivados de extratos de células brutas e eliminar as complicações associadas com o crescimento celular1. Além disso, o CFPS permite o acesso direto aos metabólitos e às máquinas biossintéticas sem a interferência de uma parede celular. No entanto, tem faltado uma compreensão fundamental dos limites de desempenho dos processos livres de células. Métodos de alta taxa de produção para quantificação de metabólitos são valiosos para a caracterização do metabolismo e são fundamentais para a construção de modelos computacionais metabólicos2,3,4. Os métodos comuns usados para determinar concentrações de metabolizados incluem ressonância magnética nuclear (RM), espectroscopia transformo-infravermelha de Fourier (FT-IR), ensaios baseados em enzimas e espectrometria de massa (MS)5,6,7 8. No entanto, estes métodos são muitas vezes limitados pela sua incapacidade de medir eficientemente vários compostos de uma só vez e muitas vezes exigem um tamanho amostral maior do que as reações típicas livres de células. Por exemplo, ensaios baseados em enzimas muitas vezes só podem ser usados para quantificar um único composto em uma corrida, e são limitados quando o tamanho da amostra é pequeno, como em reações de síntese de proteínas livres de células (normalmente executado em uma escala de 10-15 μL). Enquanto isso, nmr requer uma alta abundância de metabólitos para detecção e quantificação5.  Para essas deficiências, os métodos de cromatografia em conjunto com a espectrometria de massa (LC/MS) fornecem várias vantagens, incluindo alta sensibilidade e a capacidade de medir várias espécies simultaneamente9; no entanto, a complexidade analítica aumenta consideravelmente com o número e a diversidade de espécies sendo medidos. É importante, portanto, desenvolver métodos que realizem plenamente o potencial de alta taxa de veiviação dos sistemas LC/MS. Os compostos em uma amostra são separados pela cromatografia líquida e identificados através da espectrometria de massa. O sinal do composto depende de sua eficiência de concentração e ionização, onde a ionização pode variar entre compostos e também pode depender da matriz da amostra.
Alcançar a mesma eficiência de ionização entre a amostra e os padrões é um desafio ao usar LC/MS para quantificar os analitos. Além disso, a quantificação torna-se mais desafiadora com a diversidade de metabólitos devido à divisão de sinais e heterogeneidade na afinidade e polaridade de prótons10. Por fim, a matriz de co-eluting da amostra também pode afetar a eficiência de ionização dos compostos. Para resolver esses problemas, os metabólitos podem ser quimicamente derivatizados, aumentando a resolução e sensibilidade de separação por sistemas LC/MS, ao mesmo tempo em que diminuem a divisão de sinais em alguns casos10,11. A derivatização química funciona marcando grupos funcionais específicos de metabólitos para ajustar suas propriedades físicas, como carga ou hidrofóbica, para aumentar a eficiência de ionização11. Vários agentes de marcação podem ser usados para atingir diferentes grupos funcionais (por exemplo, aminas, hidroxils, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, um tal agente de derivatização, tem como alvo vários grupos funcionais ao mesmo tempo, e adiciona um componente hidrofóbico em moléculas hidrofílicas, aumentando assim a sua resolução de separação e sinal12. Para abordar o efeito de supressão de íons de matriz cooperativa, Yang e colegas de trabalho desenvolveram uma técnica baseada na rotulagem da Tecnologia De Padrão Interno Específico do Grupo (GSIST), onde os padrões são marcados com isótopos aniline 13C e misturados com a amostra 12,13. O metabolito e o padrão interno correspondente têm a mesma eficiência de ionização desde que co-elute, e sua razão de intensidade pode ser usada para quantificar a concentração na amostra experimental.
Neste estudo, desenvolvemos um protocolo para detectar e quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, metabolismo energético e regeneração de cofator em reações de CFPS. O método é baseado na abordagem GSIST, onde usamos 12C-aniline e 13C-aniline para marcar, detectar e quantificar metabólitos usando LC/MS de fase invertida. A escala linear de todos os compostos mediu 2-3 ordens do valor com um coeficiente médio da correlação de 0.988. Assim, o método é uma abordagem robusta e precisa para interrogar o metabolismo livre de células e, possivelmente, extratos de células inteiras.

<table><tbody><tr><td>12C Anilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242284</td><td>Anilina 12C</td></tr><tr><td>13C Anilina marcada com 13C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>485797</td><td>Anilina 13C6</td></tr><tr><td>Ácido 3-fosfoglicérico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>3PG</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>FisherScientific</td><td>AC222140010</td><td>ACE</td></tr><tr><td>Acetonitrila, LCMS</td><td>JT BAKER</td><td>9829-03</td><td>ACN</td></tr><tr><td>Acetil-coenzima A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td>ACA</td></tr><tr><td>Acquity UPLC BEH C18 1.7 &mu; M, 2,1 x 150 mm Coluna</td><td>Águas</td><td>186002353</td><td></td></tr><tr><td>Difosfato de adenosina</td><td>da coluna Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>Monofosfato de adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1752</td><td>AMP</td></tr><tr><td>Trifosfato de adenosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>ATP</td></tr><tr><td>Alfa-cetoglutarato</td><td>Citrato</td><td></td><td></td> Sigma-Aldrich K1128 aKG</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td>CIT</td></tr><tr><td>Difosfato de citidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9755</td><td>CDP</td></tr><tr><td>Monofosfato de citidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1006</td><td>CMP</td></tr><tr><td>Trifosfato de citidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9274</td><td>CTP</td></tr><tr><td>D-gliceraldeído 3-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39705</td><td>GAP</td></tr><tr><td>Erythrose 4-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0377</td><td>E4P</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EX0276</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrífuga</td><td>FisherScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flavina adenina dinucleotídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6625</td><td>FAD</td></tr><tr><td>Frutose 1,6-bifosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6803</td><td>F16P</td></tr><tr><td>Frutose 6-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3627</td><td>F6P</td></tr><tr><td>Fumarato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8509</td><td>FUM</td></tr><tr><td>Gluconato 6-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7877</td><td>6PG</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>GLC</td></tr><tr><td>Glicose 6-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7879</td><td>G6P</td></tr><tr><td>Glicerol 3-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Gly3P</td></tr><tr><td>Difosfato de guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7127</td><td>GDP</td></tr><tr><td>Monofosfato de guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8377</td><td>GMP</td></tr><tr><td>Trifosfato de guanosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>GTP</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Isocitrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1252</td><td>ICIT</td></tr><tr><td>Lactato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1750</td><td>LAC</td></tr><tr><td>Malato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02288</td><td>MAL</td></tr><tr><td>myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit</td><td>ArborBiosciences</td><td>507024</td><td>Síntese de proteínas livres de células</td></tr><tr><td>N-(3-dimetilaminopropil)-N&prime;-etilcarbodiimida cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03449</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Nicotinamida adenina dinucleotídeo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43410</td><td>NAD</td></tr><tr><td>Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5755</td><td>NADP</td></tr><tr><td>Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>481973</td><td>NADPH</td></tr><tr><td>Nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8129</td><td>NADH</td></tr><tr><td>Oxalacetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td>OAA</td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td>PYR</td></tr><tr><td>Ribose 5-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7750</td><td>R5P</td></tr><tr><td>Ribulose 5-fosfato</td><td>CarboSynth</td><td>MR45852</td><td>RL5P</td></tr><tr><td>Sedoheptulose 7-fosfato</td><td>CarboSynth</td><td>MS07457</td><td>S7P</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3674</td><td>SUCC</td></tr><tr><td>Tributilamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90780</td><td>TBA</td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>FisherScientific</td><td>O4884</td><td>TEA</td></tr><tr><td>água ultrapura</td><td>FisherScientific</td><td>10977-015</td><td>água</td></tr><tr><td>Difosfato de uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U4125</td><td>UDP</td></tr><tr><td>Monofosfato de uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6375</td><td>UMP</td></tr><tr><td>Trifosfato de uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6625</td><td>UTP</td></tr><tr><td>VWR Vórtice para serviço pesado</td><td>VWR</td><td></td><td>Água de vórtice</td></tr><tr><td>, LCMS</td><td>JT BAKER</td><td>9831-03</td><td>ÁGUA</td></tr><tr><td>Waters Acquity H Gerente de solvente quaternário classe UPLC</td><td>Waters</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Waters Acquity H Gerente de amostra classe UPLC FTN</td><td>Waters</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Detector Waters Acquity Qda</td><td>Waters</td><td></td><td>LCMS</td></tr><tr><td>Waters Empower 3</td><td>Waters</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>Waters LCMS Frasco de Recuperação Total Waters</td><td></td><td>186000384c</td><td>Frasco LCMS</td></tr></tbody></table>

quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Absolute Quantification of Cell-Free Protein Synthesis Metabolism by Reversed-Phase Liquid Chromatography-Mass Spectrometry

A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. No entanto, se cfps vai ir além do laboratório e se tornar um padrão generalizado e apenas no tempo de fabricação de tecnologia, temos de compreender os limites de desempenho desses sistemas. Em relação a essa questão, desenvolvemos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, o metabolismo energético e a regeneração do cofator nas reações da CFPS. O método utiliza padrões internos marcados com 13C-aniline, enquanto os compostos na amostra são derivados com 12C-aniline. Os padrões internos e a amostra foram mistos e analisados por cromatografia líquida de fase invertida-espectrometria de massa (LC/MS). A co-elução de compostos eliminou a supressão de íons, permitindo a quantificação precisa de concentrações de metabolizados em 2-3 ordens de magnitude, onde o coeficiente de correlação média foi de 0,988. Cinco dos quarenta compostos não foram marcados com aniline, entretanto, foram detectados ainda na amostra de CFPS e quantificados com um método padrão da curva. A corrida cromatográfica leva aproximadamente 10 min para ser concluída. Em conjunto, desenvolvemos um método rápido e robusto para separar e quantificar com precisão 40 compostos envolvidos no CFPS em uma única execução lc/ms. O método é uma abordagem abrangente e precisa para caracterizar o metabolismo livre de células, de modo que, em última análise, podemos entender e melhorar o rendimento, produtividade e eficiência energética dos sistemas livres de células.

Como prova de conceito, usamos o protocolo para quantificar metabólitos em um sistema cfps baseado em E. coli expressando proteína fluorescente verde (GFP).  A reação do CFPS (14 μL) foi saciada e desproteinizada com etanol. A amostra cfps foi então marcada com 12C-aniline, enquanto os padrões foram marcados com 13C-aniline. A amostra e os padrões marcados foram então combinados e injetados no LC/MS (Figura 1). O protocolo detectou e quantificou 40 metabólitos ...

Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.

Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an emerging technology in systems and synthetic biology for the in vitro production of proteins. However, if CFPS is ...

A síntese de proteínas sem células é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. Os sistemas de síntese de proteínas livres de células não têm parede celular, portanto temos acesso direto a metabólitos. Neste protocolo, quantificamos as medidas absolutas de 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia, o que nos permite caracterizar o metabolismo livre de células.O protocolo conta com a metástase dos compostos com anilina, o que permite uma melhor separação e maior resolução de espectrometria de massa. Além disso, usamos padrões internos com uma isotópica que rotulamos anilina, para quantificação absoluta dos metabólitos. Os metabólitos marcados coelute, que elimina os efeitos da supressão de ferro.Permitindo a quantificação precisa dos compostos. Trabalhando em um capô, combine 550 microliters da anilina, com 337,5 microliters de água de grau LC-MS. E 112,5 microliters de 12 ácidos clorídricos molares em um tubo de centrífuga.Vortex bem, e armazene a solução de seis molar aniline em pH 4,5 e quatro graus Celsius. Para preparar uma solução de anilina de carbono molar de seis molares 13, em pH 4.5, combine 250 miligramas de anilina de carbono-13 com 132 microliters de água, e 44 microlitres de 12 ácidos clorídricos molares. Vórtice bem, e armazenar a quatro graus Celsius.Para preparar 200 miligramas por solução EDC mililitro, dissolva dois miligramas de EDC em 10 microliters de água para cada amostra a ser marcada. E vórtice bem. Para preparar amostras, sacie e precipitar as proteínas em uma reação de síntese proteica livre de células, adicionando um volume igual de 100% etanol gelado à reação de síntese livre de células.Centrifugar a amostra a 12.000 vezes g, por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante da amostra para um novo tubo de centrífuga. Para rotular a amostra com solução de anilina de carbono-12, transfira seis microlitadores da amostra para um novo tubo de centrífuga e leve o volume para 50 microliters com água.Adicione 5 microliters de 200 miligramas por solução EDC mililitro, misture bem a solução de anilina de carbono-12 e transfira 5 microliters para o tubo. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. Depois de duas horas, remova os tubos do agitador e transfira-os para um capô de fumaça.Adicione 1,5 microlitadores de trietilamina a cada reação para parar a reação de marcação de anilina e estabilizar os compostos. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos. E salve o supernatante.Para rotular as normas internas com solução anilina de carbono-13, diluir a solução de estoque interno para 80 micromolar com um volume final de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililitros por mililitro, e cinco microliters da solução de anilina de carbono-13 bem misturada. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente.Após duas horas, remova os tubos do agitador e adicione 1,5 microlitadores de trietilamina à reação em um capô de fumaça. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos e salvar o supernatante. Para adivinhar o padrão interno marcado, e a amostra marcada, misture 25 microliters de cada um em um frasco de autosampler.E analisar pelo procedimento LC-MS. Em seguida, para criar uma curva padrão para metabólitos não grampeados, primeiro, diluir a solução de estoque de metabólitos não grampeados para diferentes concentrações, com volume de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililiteres e cinco microliters de solução de anilina de carbono-12 para cada concentração.Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. E prossiga com o tratamento de trietilamina. E centrifugação antes de analisar pela LC-MS como anteriormente.Após inicializar o LC-MS, de acordo com as instruções do fabricante, injete cinco microliters da amostra na coluna. E adquira as intensidades de íons m mais apropriadas para a amostra anilina de carbono-12. Então, injete cinco microliters da mesma amostra novamente.E adquirir o m sobre z intensidades de íons para os padrões de anilina de carbono-13 marcados. Neste protocolo, foram quantificados metabólitos que expressavam proteína fluorescente verde em uma síntese proteica sem células baseada em E.coli. 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia foram detectados e quantificados por meio de padrões internos.Enquanto uma curva padrão para cinco dos metabólitos que não foram marcados com anilina também foi desenvolvida. Os diversos metabólitos envolvidos nessas vias foram uma classe de açúcares fosfoilados, ácidos fosfo-carboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleotídeos e cofatores. Além disso, o método possibilitou a separação de pares de isômeros estruturais, como fosfato de glicose-seis e fosfato de frutose-seis em uma única corrida LC-MS.O passo mais importante é rotular a amostra desem proteína com anilina. Uma vez que a solução anilina se separa, é importante trabalhar de forma rápida e eficaz, mantendo boas práticas de segurança. Este método ajuda a caracterizar o metabolismo livre de células com a quantificação de 40 metabólitos.Mas, compostos adicionais estão na mistura livre de células, como aminoácidos que podem ser quantificados. Isso ajudaria a fornecer um olhar mais abrangente sobre o metabolismo livre de células. Este método revelou que sistemas livres de células têm metabolismos complexos, ainda operando que podem ser potencialmente explorados para melhor eficiência energética e rendimento de carbono.O protocolo se baseia em marcar os compostos com anilina com o uso de EDC como catalisador. Ambos os reagentes são perigosos e devem ser usados com cautela.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo demonstrará a extração e análise de ácidos graxos bioativos livres e esterificados das células. Os ácidos graxos são quantificados com precisão usando diluição de isótopos estáveis, cromatografia líquida quiral, espectrometria de massa de monitoramento de reações múltiplas de ionização química atmosférica de captura de elétrons (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Extração de lipídeos celulares para Targeted diluição de isótopos estáveis ​​Líquido Análise Espectrometria de Massa-Cromatografia

Rotulagem de isótopos estáveis ​​de peptídeos por dimetilação redutora (rotulagem Redi) é uma estratégia rápida e barata para proteômica precisos baseados em espectrometria de massa quantitativos. Aqui demonstramos um método robusto para a preparação e análise de misturas de proteínas, utilizando a abordagem de Redi que pode ser aplicado a quase todos os tipos de amostra.

Proteômica quantitativa utilizando redutora dimetilação para Stable Isotope Labeling

Análises aprofundadas de proteomas de células cancerígenas facilitam a identificação de novos alvos de drogas e biomarcadores diagnósticos. Descrevemos um fluxo de trabalho experimental para análise quantitativa de (fosfo-)proteomas em subpopulações de células cancerígenas derivadas de tumores líquidos e sólidos. Isso é conseguido combinando estratégias de enriquecimento celular com espectrometria de massa quantitativa baseada em Super-SILAC.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

Este protocolo descreve como realizar ensaios de quantificação absoluta de proteínas-alvo em amostras biológicas complexas usando monitoramento de reação selecionado. Foi usado para quantificar com precisão as proteínas da via de sinalização da quimiotaxia de macrófagos de camundongos. A seleção de peptídeos alvo, o desenvolvimento do ensaio e os ensaios qualitativos e quantitativos são descritos em detalhes.

Reação selecionada Monitoramento Espectrometria de Massa para Absolute Quantificação de Proteína

Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

Competência metabólica de sistemas in vitro é um requisito chave para a biotransformação e disposição de drogas e substâncias tóxicas. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de sondas metabólicas referência para avaliar metabolismo de fase I em culturas de células.

Espectrometria de Massa e abordagens baseadas no Luminogenic Caracterizar Fase I Metabolic Competência de<em&gt; In Vitro</em&gt; culturas de células

Apresentamos um protocolo para dosar com precisão as proteínas com rotulagem isobárica, fracionamento extensivo, ferramentas de bioinformática e etapas de controle de qualidade em combinação com cromatografia líquida interfaceada com um espectrômetro de massa de alta resolução.

Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

Os protocolos descrevem métodos de cromatografia líquida de alto desempenho acoplados ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para estudar reações metabólicas em sistemas complexos de isenta de células baseadas em lysato.

Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para rotulagem metabólica de células senescentes e não-divisórias com SILAC pulsado, análise de espectrometria de massa não-alvo, e um cálculo simplificado de meias-vidas proteicas.

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho proteômico para caracterização do proteoma da superfície celular de vários tipos de células. Esse fluxo de trabalho inclui enriquecimento de proteínas de superfície celular, preparação subsequente de amostras, análise usando uma plataforma LC-MS/MS e processamento de dados com software especializado.

Fluxo de trabalho de "captura de superfície celular" para quantificação sem rótulo do proteoma da superfície celular

Aprenda a quantificar 40 metabolitos do metabolismo central de carbono e energia em síntese de proteínas livres de células usando cromatografia líquida de fase reversa e espectrometria de massa com anilina.

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