Quantificação absoluta do metabolismo da síntese de proteínas livres de células por cromatografia líquida de fase reversa-espectrometria
25 de outubro de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.
A síntese de proteínas sem células é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. Os sistemas de síntese de proteínas livres de células não têm parede celular, portanto temos acesso direto a metabólitos. Neste protocolo, quantificamos as medidas absolutas de 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia, o que nos permite caracterizar o metabolismo livre de células.
O protocolo conta com a metástase dos compostos com anilina, o que permite uma melhor separação e maior resolução de espectrometria de massa. Além disso, usamos padrões internos com uma isotópica que rotulamos anilina, para quantificação absoluta dos metabólitos. Os metabólitos marcados coelute, que elimina os efeitos da supressão de ferro.
Permitindo a quantificação precisa dos compostos. Trabalhando em um capô, combine 550 microliters da anilina, com 337,5 microliters de água de grau LC-MS. E 112,5 microliters de 12 ácidos clorídricos molares em um tubo de centrífuga.
Vortex bem, e armazene a solução de seis molar aniline em pH 4,5 e quatro graus Celsius. Para preparar uma solução de anilina de carbono molar de seis molares 13, em pH 4.5, combine 250 miligramas de anilina de carbono-13 com 132 microliters de água, e 44 microlitres de 12 ácidos clorídricos molares. Vórtice bem, e armazenar a quatro graus Celsius.
Para preparar 200 miligramas por solução EDC mililitro, dissolva dois miligramas de EDC em 10 microliters de água para cada amostra a ser marcada. E vórtice bem. Para preparar amostras, sacie e precipitar as proteínas em uma reação de síntese proteica livre de células, adicionando um volume igual de 100% etanol gelado à reação de síntese livre de células.
Centrifugar a amostra a 12.000 vezes g, por 15 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o supernatante da amostra para um novo tubo de centrífuga. Para rotular a amostra com solução de anilina de carbono-12, transfira seis microlitadores da amostra para um novo tubo de centrífuga e leve o volume para 50 microliters com água.
Adicione 5 microliters de 200 miligramas por solução EDC mililitro, misture bem a solução de anilina de carbono-12 e transfira 5 microliters para o tubo. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. Depois de duas horas, remova os tubos do agitador e transfira-os para um capô de fumaça.
Adicione 1,5 microlitadores de trietilamina a cada reação para parar a reação de marcação de anilina e estabilizar os compostos. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos. E salve o supernatante.
Para rotular as normas internas com solução anilina de carbono-13, diluir a solução de estoque interno para 80 micromolar com um volume final de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililitros por mililitro, e cinco microliters da solução de anilina de carbono-13 bem misturada. Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente.
Após duas horas, remova os tubos do agitador e adicione 1,5 microlitadores de trietilamina à reação em um capô de fumaça. Centrifugar a 13.500 vezes g por três minutos e salvar o supernatante. Para adivinhar o padrão interno marcado, e a amostra marcada, misture 25 microliters de cada um em um frasco de autosampler.
E analisar pelo procedimento LC-MS. Em seguida, para criar uma curva padrão para metabólitos não grampeados, primeiro, diluir a solução de estoque de metabólitos não grampeados para diferentes concentrações, com volume de 50 microliters. Adicione cinco microliters da solução EDC de 200 mililiteres e cinco microliters de solução de anilina de carbono-12 para cada concentração.
Vórtice a reação com agitação suave por duas horas em temperatura ambiente. E prossiga com o tratamento de trietilamina. E centrifugação antes de analisar pela LC-MS como anteriormente.
Após inicializar o LC-MS, de acordo com as instruções do fabricante, injete cinco microliters da amostra na coluna. E adquira as intensidades de íons m mais apropriadas para a amostra anilina de carbono-12. Então, injete cinco microliters da mesma amostra novamente.
E adquirir o m sobre z intensidades de íons para os padrões de anilina de carbono-13 marcados. Neste protocolo, foram quantificados metabólitos que expressavam proteína fluorescente verde em uma síntese proteica sem células baseada em E.coli. 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia foram detectados e quantificados por meio de padrões internos.
Enquanto uma curva padrão para cinco dos metabólitos que não foram marcados com anilina também foi desenvolvida. Os diversos metabólitos envolvidos nessas vias foram uma classe de açúcares fosfoilados, ácidos fosfo-carboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleotídeos e cofatores. Além disso, o método possibilitou a separação de pares de isômeros estruturais, como fosfato de glicose-seis e fosfato de frutose-seis em uma única corrida LC-MS.
O passo mais importante é rotular a amostra desem proteína com anilina. Uma vez que a solução anilina se separa, é importante trabalhar de forma rápida e eficaz, mantendo boas práticas de segurança. Este método ajuda a caracterizar o metabolismo livre de células com a quantificação de 40 metabólitos.
Mas, compostos adicionais estão na mistura livre de células, como aminoácidos que podem ser quantificados. Isso ajudaria a fornecer um olhar mais abrangente sobre o metabolismo livre de células. Este método revelou que sistemas livres de células têm metabolismos complexos, ainda operando que podem ser potencialmente explorados para melhor eficiência energética e rendimento de carbono.
O protocolo se baseia em marcar os compostos com anilina com o uso de EDC como catalisador. Ambos os reagentes são perigosos e devem ser usados com cautela.
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Visão Geral
Este protocolo detalha um método para quantificar 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central do carbono e da energia durante a síntese proteica livre de células. Ao utilizar anilina para a derivatização, o protocolo melhora a separação na cromatografia líquida de fase reversa e emprega espectrometria de massas para quantificação precisa.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Síntese proteica livre de células
- Metabolômica
- Espectrometria de massas
Antecedentes
- A síntese proteica livre de células permite acesso direto aos metabólitos.
- O entendimento do metabolismo central de carbono e energia é crucial para a caracterização de sistemas livres de células.
- A derivatização com anilina melhora a separação e a resolução na análise.
- Padrões internos com marcação isotópica facilitam a quantificação absoluta.
Objetivo do Estudo
- Quantificar metabólitos envolvidos no metabolismo central do carbono e na produção de energia.
- Aprimorar a compreensão dos processos metabólicos livres de células.
- Fornecer um protocolo robusto para pesquisadores em biologia sintética.
Métodos Utilizados
- Derivatização de metabólitos com anilina.
- Cromatografia líquida em fase reversa para separação.
- Espectrometria de massas para quantificação utilizando padrões com marcação isotópica.
- Coeluição de metabólitos marcados para minimizar os efeitos de supressão iônica.
Resultados Principais
- Quantificação bem-sucedida de 40 metabólitos.
- Separação e resolução aprimoradas na espectrometria de massas.
- Eliminação eficaz dos efeitos de supressão iônica por meio da coeluição.
- Estabelecimento de um protocolo confiável para estudos futuros.
Conclusões
- O protocolo fornece um método abrangente para a quantificação de metabólitos.
- Ele aprimora a compreensão das vias metabólicas em sistemas livres de células.
- Aplicações futuras podem estender-se a diversos projetos de biologia sintética.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa de metabólitos centrais de carbono e energia na síntese proteica livre de células permite a avaliação preditiva do desempenho do sistema, do rendimento e da eficiência energética. Essa capacidade auxilia na redução mecanicista de riscos em plataformas livres de células para a fabricação sob demanda de biológicos, identificando gargalos metabólicos e limitações de cofatores. O método fornece leituras metabólicas semelhantes a biomarcadores translacionais que orientam decisões de prosseguir ou interromper no estágio inicial de descoberta e desenvolvimento pré-clínico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao vincular o fluxo de metabólitos à produção de proteínas em sistemas livres de células.
- Valor Operacional: Fornece perfilagem metabólica quantitativa para reduzir riscos na validação de alvos por meio do esclarecimento de vias e avaliação funcional.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece quantificação padronizada e reprodutível de 40 metabólitos para apoiar a preparação de ensaios em plataformas de triagem baseadas em sistema livre de células.
- Valor Operacional: Facilita fluxos de trabalho de LC/MS compatíveis com alto rendimento e corridas de 10 minutos, permitindo triagem escalável de metabólitos em diferentes condições.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças ao caracterizar a continuidade metabólica desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Valor Operacional: Gera confiança preditiva na identificação de compostos ativos ao vincular eficiência metabólica ao rendimento proteico e à produtividade.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta precoce ao fornecer dados de fluxo metabólico que orientam a seleção de alvos e a otimização de vias antes da identificação do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da quantificação absoluta de intermediários da glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e via das pentoses fosfato.
- Triagem: Permite a padronização e reprodutibilidade de ensaios por meio da normalização com padrão interno e eliminação da supressão iônica baseada na coeluição.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de variáveis dependentes (concentrações de metabólitos em 2-3 ordens de magnitude) que permitem comparação entre condições e avaliação estatística.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao estabelecer parâmetros metabólicos para eficiência energética e rendimento de carbono em sistemas livres de células.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável de metabolômica baseada em CL/EM para caracterização repetida de condições livres de células em diversos projetos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no desempenho de sistemas livres de células por meio do mapeamento abrangente do metabolismo e redução da ambiguidade mecanicista.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio da correção com padrão interno e corridas cromatográficas rápidas de 10 minutos.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre continuidade ou interrupção de projetos, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas, mediante identificação precoce de limitações metabólicas.
- Impacto na Carteira de Projetos: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em métricas quantificáveis de metabolismo energético e regeneração de cofatores.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em derivatização de metabólitos, operação de CL/EM e manuseio de reagentes perigosos (anilina, EDC, HCl).
- Depende de infraestrutura de cromatografia líquida com fase reversa acoplada à espectrometria de massas com capacidade de ionização por eletrospray.
- Requer padronização entre equipes quanto ao congelamento das amostras, precipitação de proteínas e cronometragem da derivatização para garantir a coeluição e a precisão da quantificação.
- Considerações para adaptação incluem a extensão do método a aminoácidos e outros metabólitos não centrais de carbono presentes em misturas livres de células.
- Limitações práticas incluem a necessidade de controle cuidadoso do pH durante a derivatização e a interferência potencial de matrizes amostrais complexas, apesar das medidas para mitigar a supressão iônica.
