Name: Cloreto de vinil e dieta rica em gordura como modelo de interação ambiental e obesidade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprenda a criar um modelo murino de inalação crônica de cloreto de vinil combinado com dieta rica em gordura para estudar danos hepáticos induzidos por toxicantes ambientais em níveis abaixo dos limites de segurança atuais.

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Este estudo foi financiado por prêmios dos Institutos Nacionais de Saúde (K01 DK096042 e R03 DK107912) para Juliane Beier. A pesquisa também contou com o apoio de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde o número de subvenção P20GM113226 e o Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo do Institutos Nacionais de Saúde o prêmio Número P50AA024337. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os experimentos animal/VC foram aprovados pelo Departamento de Saúde Ambiental, a Associação de Segurança para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório e os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Atendimento e Uso de Animais.
1. Configuração experimental e aclimatação a dietas experimentais purificadas
<ol><li>Determine o número total de camundongos C56Bl/6J (minimamente 6 a 8 camundongos por grupo). NOTA: Os animais de cada grupo de dieta serão ainda sub-divididos em grupos de exposição. Certifique-se de explicar o número total de animais necessários no planejamento do estudo.</li>
	<li>Identificar e pesar os animais. Registre esses dados.</li>
	<li>Mude dietas de ração regular para dieta purificada com baixo teor de gordura (LFD) ou dieta rica em gordura (HFD) uma semana antes do início dos experimentos de inalação para aclimatar os ratos às novas dietas (ver Figura 1 para cronograma).</li>
	<li>Fornecer comida e água ad libitum. Monitorar o consumo de alimentos, pesando e registrando o alimento a ser dado por gaiola, e pesando e registrando o restante dos alimentos em cada dia de alimentação. Se a habitação 4 ratos por gaiola, fornecer ~ 50 g de alimentos duas vezes por semana. Se a habitação 5 ratos por gaiola, fornecer ~ 60 g de alimentos duas vezes por semana. NOTA: Durante a alimentação das dietas purificadas, a quantidade de alimento deve ser verificada todos os dias para garantir que os ratos tenham pelotas suficientes. Se houver pelotas insuficientes, os ratos tendem a "acumular" alimentos e aumentar a ingestão. Além disso, especialmente o HFD tende a desmoronar muito mais do que o LFD, causando um efeito semelhante.</li>
	<li>Monitorar os animais durante todo o experimento para garantir a saúde animal é mantida. NOTA: Ganho de peso semanal e consumo de alimentos, juntamente com o monitoramento metabólico pode ser feito para fornecer um índice de saúde animal em geral.</li>
</ol>2. Sistema de exposição à inalação de cloreto de vinil
NOTA: Existem vários sistemas de exposição de inalação disponíveis comercialmente, variando de "nariz-somente" exposição e manual para sistemas automatizados. Os dados publicados anteriormente por esse grupo foram derivados de um sistema manual de corpo inteiro12,23,24. Um diagrama que descreve o sistema automatizado de exposição à inalação é mostrado na Figura 2.
<ol><li>Certifique-se de que o ar diluente em ambas as câmaras experimentais e de controle é o ar particulado de alta eficiência (HEPA) e o carbono ativado filtrado, seco e a pressão regulada antes de entrar em seus respectivos dispositivos de medição de fluxo (controlador de fluxo de massa [MFC) ]-câmara experimental, câmara de controle de rotacômetro). NOTA: Na câmara de controle, o rotarômetro regula o fluxo de ar para os ratos. O ar entra no topo da câmara, passa pelos ratos, em seguida, é esgotado os ratos e passou por um filtro HEPA antes de entrar na capa química. Temperatura e umidade relativa (RH) são medidos dentro da câmara. Na câmara experimental, o ar diluente é misturado com ar de um tanque vc. Ambos os fluxos são regulados com MFCs. A proporção das duas misturas determina a concentração de VC na câmara experimental. O VC entra no topo da câmara de exposição através de um dispersor com sete jatos que apontam em direções diferentes. O VC passa pelos ratos e é esgotado então através de 12 portos separados que são posicionados debaixo da cremalheira da gaiola. Este projeto de câmara foi mostrado para fornecer concentrações tóxicas homogêneas anteriormente25.</li>
	<li>Certifique-se de que a pressão, a temperatura e o RH sejam monitorados dentro das câmaras experimentais e de controle.</li>
	<li>Confirme que o escape da câmara é passado através de um filtro HEPA, uma sonda CO2 e um filtro de carbono ativado antes de entrar na área de escape do capô químico e que o nível de CO2 é monitorado para garantir que os ratos estejam recebendo ventilação aceitável.</li>
	<li>Use o software personalizado para alterar, monitorar e registrar variáveis ambientais durante exposições de inalação. NOTA: Se um sistema manual for usado, as variáveis descritas nas etapas 2.1-2.4 devem ser monitoradas e calibradas, quando necessário regularmente durante todo o período de exposição.</li>
</ol>3. Configuração de pré-exposição
<ol><li>Desligue todos os fluxos de ar nas câmaras experimentais e de controle para a segurança do técnico.</li>
	<li>Para cada câmara, abra a porta da câmara e coloque material de cama absorvente (lado absorvente para cima) em cima da panela excreta. Molhe o material absorvente para fornecer um nível confortável da umidade (40-60% RH) durante todo o período da exposição.</li>
	<li>Defina o nível de exposição desejado de VC na câmara. Para concentrações de limite sub-OSHA, use 0,85 ppm de VC. Use o controle de feedback gerenciado por software e baseado em detector da entrega de VC na câmara ou use ajustes manuais no sistema. NOTA: Esta última abordagem requer conhecimento do volume da câmara, taxa de atualização da câmara, fluxo de ar e taxa de entrega do gás VC a partir do fornecimento de estoque; Esses cálculos devem ser validados e calibrados por medições de concentrações de VC na câmara em estado estável12,24. A técnica mais comum para medir vc na câmara é através de análise cromatográfica de gás do ar amostra12,24. As vantagens da abordagem orientada por software em relação à precisão e precisão da entrega de VC são claras. No entanto, tem sido demonstrado que a abordagem manual também é precisa e consistente12,24. CUIDADO: VC é um tóxico conhecido e cancerígeno em níveis elevados. Exercite o equipamento protetor pessoal apropriado e a manipulação do gás ao girar sobre e fora das câmaras.</li>
</ol>4. Gaiola da exposição e preparação animal
<ol><li>Retire os ratos de suas câmaras de habitação e colocá-los nas gaiolas individuais do rack gaiola de câmara de inalação (um rack gaiola para os ratos controle, um para os ratos expostos). Randomize a colocação de cada rato dentro da cremalheira da gaiola diariamente para assegurar-se de que cada rato esteja expor homogênea dentro da câmara da exposição. Marque o número de cada animal e a posição de colocação de gaiolas no caderno de laboratório.</li>
	<li>Coloque cada rack gaiola em sua respectiva câmara e feche as portas da câmara.</li>
</ol>5. Realizar uma exposição
<ol><li>Certifique-se de que a válvula para o tanque de gás VC está em posição aberta. Certifique-se de que o fluxo diluente para a câmara experimental é definido como 25 L/min.</li>
	<li>Comece o fluxo diluente na câmara experimental. Certifique-se de que o rotametro na câmara de controle está definido para 25 L/min.</li>
	<li>Certifique-se de que todos os sensores (fluxos, temperatura, umidade, pressão da câmara, nível DE CO2) estejam funcionando corretamente e exibindo os resultados esperados nas câmaras experimentais e de controle. NOTA: O fluxo de VC é calculado e definido com base no fluxo diluente e concentração de VC desejada.</li>
	<li>Certifique-se de que ao longo da exposição, na câmara experimental, o tempo de exposição, fluxo diluente, fluxo de VC, temperatura, umidade, pressão da câmara, nível de CO2 e concentração teórica de VC sejam exibidos, grafizados e registrados. Confirme que a temperatura e umidade da câmara de controle também são exibidas, grafadas e registradas. NOTA: Se um sistema manual for usado, o fluxo de VC deve ser verificado e ajustado, quando necessário, durante todo o período de exposição.</li>
	<li>Se algum problema ocorrer durante a exposição, defina o fluxo de VC para zero e aumente o fluxo diluente ao seu valor máximo para purgar rapidamente a câmara.</li>
	<li>Uma vez que a duração da exposição (ou seja, 6 h/day) foi atingida, o software desliga automaticamente o fluxo de VC. O tempora de segurança de 15 min começa então para o tempo após a duração para que a câmara experimental cancele o VC. Uma vez que é seguro remover os animais, clique no botão OK na caixa de diálogo. O sistema vai parar de gravar medições para o arquivo e a exposição acabou. NOTA: Se um sistema manual for usado, o usuário deve desligar manualmente o fluxo de VC no final da duração da exposição e o tempo para liberação de VC no final da exposição deve ser calculado.</li>
</ol>6. Pós-exposição
<ol><li>Vire o palito na válvula para o tanque de gás VC para a posição fechada e desligue todos os fluxos de ar na câmara de exposição. Vire o rotarômetro até que nenhum fluxo de ar esteja fluindo através da câmara de controle.</li>
	<li>Retire as portas de cada câmara para fornecer ventilação para os ratos. Retire os racks da gaiola das câmaras. uma capa, remova os ratos de suas gaiolas da exposição e coloc os de volta em suas gaiolas da carcaça. Transporte todos os ratos de volta para sua sala de habitação para habitação durante a noite em gaiolas regulares.</li>
	<li>Descarte qualquer resíduo da panela de excrementos para um recipiente de risco biorisco aprovado pelo Departamento de Saúde Ambiental e Segurança (DEHS), pois estes podem ser considerados um perigo químico pelos serviços institucionais de saúde ambiental. Limpe as portas da câmara, a panela excreta, o rack de gaiola de exposição e a câmara de exposição para os sistemas experimentais e de controle.</li>
</ol>7. Validação da concentração de VC dentro das câmaras durante a exposição
<ol><li>Realizar uma medida da concentração vc dentro da câmara experimental no meio de cada exposição (3 h).</li>
	<li>Quebre as pontas de vidro em um tubo de detector de VC e um tubo de pré-tratamento. Anexar a extremidade do fluxo para fora do tubo de detector de VC para a bomba de tubo de detector. Anexe o fluxo na extremidade do tubo de detector de VC para a extremidade de saída do tubo de pré-tratamento com um pequeno pedaço de tubulação. Anexar um pequeno pedaço de tubulação para o fluxo na extremidade do tubo de pré-tratamento.</li>
	<li>Retire um plugue de uma das portas de amostragem que está perto da zona de respiração dos ratos. Anexar a tubulação do fluxo na extremidade do tubo de pré-tratamento para a porta de amostragem.</li>
	<li>Da posição completa, estender a alça sobre o pistão da bomba de tubo detector para a posição completa para fora. Isto puxará 100 mL do gás amostrado da câmara no tubo do detetor do VC durante um período de 90 s. Depois de esperar os anos 90, empurre a alça de volta.</li>
	<li>Repita o passo 7,4 mais vezes para que um total de 400 mL é puxado para o tubo de detector de VC.</li>
	<li>Retire o tubo do porto de amostragem da câmara e reinserir a ficha na porta. Inspecione a mudança de cor do tubo do detetor vc para verificar a concentração vc dentro da câmara.</li>
	<li>Registre a leitura do tubo do detetor vc no caderno de laboratório e compare com o valor teórico. Descarte o tubo de detector de VC e pré-trate o tubo em um recipiente adequado.</li>
</ol>8. Término do experimento de exposição à inalação
NOTA: Após o tempo desejado de exposição, por exemplo, 6, 8 e/ou 12 semanas após o início da exposição à inalação, os experimentos estão sendo encerrados e os animais serão sacrificados (ver Figura 1 para cronograma).
<ol><li>Jejue os ratos 4 h antes da época da eutanásia. NOTA: Este procedimento permite a determinação da glicose no sangue em jejum e os níveis de insulina para análise metabólica.</li>
	<li>Use uma abordagem de eutanásia consistente com as diretrizes da Associação Médica Veterinária Americana (AVMA), como anestesia seguida de exsanguination.</li>
	<li>Administrar cetamina/xilazine (100/15 mg/kg) por injeção intraperitoneal a cada rato para induzir anestesia. NOTA: Evite o pentobarbital de sódio como um anestésico pré-eutanásia, pois a exposição ao cloreto de vinil pode impedir sua eficácia.</li>
	<li>Coletar sangue da veia cava inferior na solução de citrato de sódio (final, 0,38%), para prevenir a coagulação do sangue e para preservação da amostra.</li>
	<li>Retire o fígado e/ou qualquer outro órgão desejado. Dissecar o fígado e as porções do pressão-gelo no nitrogênio líquido, embed no meio congelado do espécime, e reparar no formalin protegido de 10% para histology.</li>
	<li>Separe o plasma do sangue através da centrífuga e transfira o plasma citrado para um tubo adequado e guarde a -80 °C até que seja necessário para análise.</li>
	<li>Para avaliar índices histológicos de lesão hepática, realize hematoxilina e eosina (H&E) manchando com 5 μM formalin a parafina fixa embutida seções hepáticas e obter imagens com um microscópio de campo brilhante.</li>
	<li>Para obter os níveis de transaminase de plasma, realize tanto alanina aminotransferase (ALT) quanto assínia de aminotransferase (AST) no plasma citrado usando kits comercialmente disponíveis. NOTA: Para controle de qualidade, transaminases de plasma para camundongos C57Bl/6J devem estar na faixa normal (35-45 IU/L) para o grupo LFD+VC, enquanto os valores devem ser elevados (~150 IU/L) para o grupo HFD+VC (Figura 3C).</li>
</ol>

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<li>Spruss, A., Bergheim, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fructose+and+intestinal+barrier%3A+potential+risk+factor+in+the+pathogenesis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutritional+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Dietary fructose and intestinal barrier: potential risk factor in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Journal of Nutritional Biochemistry. 20 (9), 657-662 (2009).</li>
</ol>

WT Goldsmith tem interesse financeiro em IEStechno, que é o modelo para o sistema descrito. Os autores restantes não têm nada a divulgar.

Este modelo de NAFLD aprimorado por VC é um novo método para avaliar o efeito da exposição ao VC de sub-OSHA em um paradigma de inalação de corpo inteiro. Este modelo permite que os investigadores estudem os efeitos sub-hepatotóxicos e sensibilizantes apenas por baixos níveis de VC. Na verdade, este modelo de co-exposição atinge lesão hepática reforçada, elevação do plasma ALT e AST e inflamação moderada, enquanto em grande parte não afeta outros sistemas de órgãos, como o coração, nesta concentração23. Este modelo crônico requer câmaras de inalação de corpo inteiro, mas minimiza as concentrações de estresse e exposição. Embora o protocolo apresentado aqui seja uma abordagem orientada por software, nossa experiência mostrou que a abordagem manual também é um método preciso e consistente de exposição12,24. Além disso, é facilmente aplicável a várias áreas de pesquisa, incluindo outros danos nos órgãos23 causados pela exposição volátil composto orgânico22. Notavelmente, este modelo pode assemelhar-se mais à patogênese das co-exposições humanas a produtos químicos ambientais e à doença subjacente5.
Para obter resultados semelhantes, determinadas etapas críticas da otimização do protocolo devem ser alcançadas. Por exemplo, os investigadores devem estabelecer que a concentração de VC ou outro tóxico dentro das câmaras está dentro da faixa de exposição desejada (ou seja, níveis baixos, sub-OSHA ou níveis agudos). Otimizar esta etapa da câmara de inalação é fundamental para um modelo bem-sucedido da exposição humana de interesse. Em segundo lugar, ajustar o tempo de exposição por dia e a duração do experimento também pode ser modificado. De acordo com os interesses desse grupo, foi alcançado um ambiente de exposição ocupacional e também foi estudado um parâmetro adicional de dieta. No entanto, exposições ambientais e agudas também podem ser modeladas com este protocolo.
Este trabalho desafia o paradigma de que os limites atuais de exposição do VC (ocupacional e ambiental) são seguros. Na verdade, embora o limite de exposição Atual OSHA para VC é de 1 ppm, este modelo provou que as concentrações de VC abaixo deste limite são suficientes para melhorar a lesão hepática causada por HFD em camundongos. Este protocolo permite que os investigadores estudem e caracterizem um paradigma novo da exposição do toxicant e modelem O TASH.
Este é o primeiro modelo de crônica, baixa dose de exposição vc. Trabalhos anteriores utilizaram concentrações de bolus muito altas, exposições agudas ou metabólitos ativos como substitutos para exposição ao VC. Todas essas abordagens diminuem a relevância dos achados para a exposição humana. Portanto, este novo modelo de interação TASH-NAFLD fornece a plataforma necessária para os investigadores examinarem interações complexas de exposição a VC de baixo nível.
Este modelo de lesão hepática induzida por tóxicos pode ser usado para outros compostos orgânicos voláteis e também para estudar outras interações que podem afetar o fígado e outros sistemas de órgãos8,22,23. Além disso, este modelo tem sido, e pode ser mais, usado para investigar terapias de intervenção e estudos mecanicistas aprofundados do modo de ação para este tóxico prevalente24. Como vc é um conhecido cancerígeno26,27,28, este paradigma de exposição também pode ser modificado para o estudo do câncer induzido por VC. Outras co-morbidades como a doença hepática alcoólica também podem ser reforçadas pela coexposição vc. Além disso, seria de interesse estudar diferentes tipos de gordura, como a gordura poliinsaturada18,29,30,ou diferentes tipos de carboidratos31 e sua co-exposição com VC neste modelo. Na verdade, todos esses fatores são conhecidos por ter efeitos diferenciais sobre o desenvolvimento de lesões hepáticas e podem desempenhar um papel na doença hepática induzida por VC.
Em conclusão, este é um novo modelo de inalação de lesão hepática induzida por tóxicos ambientais e estabelece um paradigma de exposição para a exposição crônica, de baixo nível vc. A concentração de VC usado neste modelo é sub-hepatotoxic por si só, enquanto aumenta a lesão hepática causada por outro fator (HFD) em camundongos. Este modelo permitirá que os investigadores estudem mecanismos e intervenções para a toxicidade crônica do VC e podem ser úteis para os estudos translacionais que olham assuntos humanos expor e no risco o mais elevado para a exposição.

Numerosos toxicantes estão presentes no ar que respiramos em níveis muito baixos. O cloreto de vinil (VC) é gás mononófico usado pela indústria para criar produtos plásticos de cloreto de polivinil (PVC)1. É um hepatotóxico ambiental predominante, cancerígeno conhecido, e é classificado #4 na Lista de Prioridades de Substâncias Perigosas ATSDR2. Para entender melhor os efeitos tóxicos sobre a saúde humana e as interações com as co-morbidades existentes, estabelecer modelos de exposição que imitam a exposição humana é crucial. O principal interesse deste grupo é estudar os efeitos hepáticos da exposição crônica ao VC em baixas concentrações. Vc exerce seus principais efeitos sobre o fígado, onde tem sido mostrado (em altas concentrações) para causar esteatose, e a esteatohepatite associada a tóxicos (TASH) com necrose, fibrose, cirrose3,4, bem como carcinoma hepatocelular (HCC) e o hemangiosarcoma hepatic de outra forma extremamente raro5. Tash provavelmente existiu na população há décadas, mas permaneceu descaracterizado e subestimado pelos investigadores4,6. Como resultado de pesquisas demonstrando as preocupações diretas de toxicidade para a exposição ao VC, a Occupational Safety and Health Administration (OSHA) reduziu o limiar de exposição aceitável para 1 ppm ao longo de um dia de trabalho de 8 h7. Embora o limiar de exposição tenha sido reduzido, o efeito dessa concentração de VC na saúde humana não é claro7. Além disso, o efeito da exposição ao VC sobre as comorbidades existentes, como a doença hepática, é em grande parte desconhecido8. Esta lacuna de conhecimento é especialmente importante hoje devido ao aumento da prevalência global de doença hepática gordurosa não alcoólica (NALFD)4,6,7,9,10,11,12. Importante, VC tem sido mostrado recentemente para ser um fator de risco independente para a doença hepática de outras causas13. O objetivo deste protocolo foi, portanto, desenvolver um modelo de inalação relevante para a exposição ao tóxico ambiental volátil, VC no contexto de lesão hepática subjacente, imitar a exposição humana e identificar potenciais mecanismos novos de lesão hepática induzida por VC ou VC reforçada.
A principal via de exposição de muitos tóxicos e poluentes ambientais é através da inalação. Uma vez inalado, o composto pode entrar em circulação sistêmica através dos pulmões, viajar para o fígado, e tornar-se metabolicamente ativado por enzimas hepáticas antes de ser excretado14,15,16. Muitas vezes são esses metabólitos ativos que causam toxicidade e danos dentro do corpo. Estudos anteriores deste grupo e outros têm usado metabólitos VC como substitutos para exposição ao gás VC17,18. Outros grupos têm utilizado modelos de inalação de VC; no entanto, níveis de exposição extremamente elevados (>50 ppm) foram implementados para induzir toxicidade aguda, lesão hepática grave e desenvolvimento tumoral19. Embora esses estudos tenham fornecido informações e mecanismos cruciais de carcinogenicidade induzida por VC, eles não recapitulam os efeitos sutis e interações complexas com outros fatores contribuintes e, portanto, são menos relevantes para a exposição humana.
A inalação VC mais dieta rica em gordura (HFD) modelo descrito aqui (ver Figura 1 para cronograma), é o primeiro modelo de crônica, baixa dose de exposição vc (ou seja, sub-OSHA concentração), em que os ratos são expostos ao tóxico em condições que imitam a exposição humana muito mais de perto. De fato, dados desse modelo recapitularam resultados observados em humanos expostos ao VC, como o impacto nas vias metabólicas20,estresse oxidativo e disfunção mitocondrial4. Outros modelos de inalação de camundongos, como modelos exclusivos para a cabeça e nariz21,exigem que o animal seja contido, causando estresse ao animal. Aqui, este método de exposição de corpo inteiro não requer injeção ou estresse desnecessário para os animais. Os animais têm acesso a dlibitum a alimentos e água e são colocados dentro da câmara de inalação maior para um determinado número de horas por dia e dias por semana. Além disso, o conceito de que o VC modifica a sensibilidade a outro hepatotóxico é um achado novo, demonstrado pela primeira vez por este grupo12 e tem implicações para a exposição ao VC em concentrações bem abaixo das necessárias para a hepatotoxicidade direta.
Este método de exposição à inalação pode ser usado para imitar a exposição a uma variedade de tóxicos gasosos, incluindo outros compostos orgânicos voláteis, presentes em nosso ambiente. De fato, compostos orgânicos voláteis são um grande grupo de tóxicos ambientais e mais prevalentes em áreas industrializadas, resultando em certas populações em maior risco de exposição crônica22. Este protocolo pode ser modificado para atender a diferentes questões experimentais. O período de tempo e concentração de compostos administrados podem ser variados. Embora inicialmente desenvolvido para determinação de lesão hepática, outros sistemas de órgãos podem e têm sido estudados com este modelo23. Os investigadores que visam estudar exposições crônicas com animais, mas desejam minimizar o estresse animal, devem considerar o uso deste modelo.

<table><tbody><tr><td>Reagentes ALT/AST</td><td>Thermo Fisher</td><td>TR70121, TR71121</td><td></td></tr><tr><td>camundongos C57Bl/6J</td><td>O Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>estudos em animais devem estar em conformidade com todos os regulamentos relevantes de ética e bem-estar animal e devem ser revisados e aprovados pelos comitê><s governamentais e institucionais apropriados de cuidados e uso de animais. Como este é um estudo crônico, recomendamos o uso de camundongos machos ou fêmeas de 4 a 6 semanas de idade.</td></tr><tr><td>Monitor de CO2</td><td>IEStechno</td><td>Ex-Sens</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma</td><td>E6003</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de câmara de exposição por inalação</td><td>IEStechno</td><td>GasExpo</td><td>O sistema de câmara de exposição por inalação inclui software personalizado, interface e hubs controladores</td></tr><tr><td>Dieta de controle de gordura saturada (13%)</td><td>Teklad Diets</td><td>TD.120336</td><td></td></tr><tr><td>Dieta de gordura saturada (42%)</td><td>Teklad Diets</td><td>TD.07511</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de sódio</td><td>Sigma</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de vinila</td><td>MATHESON TRI-GAS</td><td>Series 3590-CGA*</td><td>Manuseie o gás com cuidado</td></tr></tbody></table>

cloreto de vinil e dieta rica em gordura como modelo de interação ambiental e obesidade

Vinyl Chloride and High-Fat Diet as a Model of Environment and Obesity Interaction

O cloreto de vinil (VC), um contaminante ambiental abundante, causa esteatohepatite em níveis elevados, mas é considerado seguro em níveis mais baixos. Embora vários estudos tenham investigado o papel do VC como um hepatotóxico direto, o conceito de que o VC modifica a sensibilidade do fígado para outros fatores, como a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) causada pela dieta rica em gordura (HFD) é novo. Este protocolo descreve um paradigma de exposição para avaliar os efeitos da exposição crônica de baixo nível ao VC. Os ratos são aclimatados à dieta low-fat ou high-fat uma semana antes do começo da exposição da inalação e permanecem nestas dietas durante todo a experiência. Os camundongos são expostos ao VC (nível sub-OSHA: <1 ppm) ou ar de quarto em câmaras de inalação por 6 horas/dia, 5 dias/semana, por até 12 semanas. Os animais são monitorados semanalmente para ganho de peso corporal e consumo de alimentos. Este modelo de exposição vc não causa lesão hepática evidente com inalação VC sozinho. No entanto, a combinação de VC e HFD aumenta significativamente a doença hepática. Uma vantagem técnica deste modelo de co-exposição é a exposição de todo o corpo, sem restrições. Além disso, as condições assemelham-se mais a uma situação humana muito comum de uma exposição combinada ao VC com doença hepática gordurosa não alcoólica subjacente e, portanto, suportam a nova hipótese de que o VC é um fator de risco ambiental para o desenvolvimento de danos hepáticos como uma complicação da obesidade (ou seja, NAFLD). Este trabalho desafia o paradigma de que os limites atuais de exposição do VC (ocupacional e ambiental) são seguros. O uso deste modelo pode lançar uma nova luz e preocupação com os riscos de exposição ao VC. Este modelo de lesão hepática induzida por tóxicos pode ser usado para outros compostos orgânicos voláteis e para estudar outras interações que podem afetar o fígado e outros sistemas de órgãos.

Ao longo do experimento, o peso corporal animal e o consumo de alimentos foram monitorados semanalmente para garantir a saúde animal e avaliar o metabolismo vivo. Figura 3A retrata o peso corporal e consumo de alimentos para um experimento de 12 semanas. O peso corporal foi medido uma vez por semana e o consumo de alimentos foi medido duas vezes por semana para todos os grupos. Todos os camundongos ganharam peso ao longo do estudo. Quando, como esperado os ratos nos grupos de HFD ganharam mais peso enquanto os ratos nos grupos de LFD, os ratos expor ao VC não ganharam mais peso do que os ratos no grupo de controle respectivo. O consumo de alimentos não foi diferente entre todos os grupos12,24.
A Figura 3B retrata fotomicrografias representativas de seções hepáticas manchadas com H&amp;E para análise da morfologia geral. No grupo LFD, o VC não causou alterações patológicas evidentes. A alimentação de HFD aumentou significativamente a esteatose (acumulação de gordura) e a exposição ao VC aumentou esse efeito. Além disso, a exposição ao VC no grupo HFD resultou em alguns focos inflamatórios12,24.
Os níveis de transaminase de plasma (ALT e AST) foram medidos como indicadores de danos no fígado e um nível elevado de transaminase é um indicador de danos no fígado. No grupo LFD, o VC não aumentou os níveis de transaminase. Hfd sozinho ligeiramente aumentado níveis de transaminase e importante VC aumentou significativamente este efeito (Figura 3C)12,24.
O peso do fígado em relação ao peso corporal foi calculado para cada grupo. HFD aumentou significativamente as proporções de peso do fígado para o corpo. No entanto, vc não aumentar significativamente este efeito (Figura 3D)12.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do procedimento do modelo de inalação. Os ratos são alimentados com as respectivas dietas de baixo teor de gordura (13% de gordura saturada) ou de alto teor de gordura (42% de gordura saturada) ad libitum por 1 semana para aclimatá-los à dieta purificada. Após uma semana, os ratos são introduzidos ao regime da inalação. Para isso, os camundongos são colocados em câmaras de inalação de corpo inteiro de última geração para exposição a uma concentração de VC de nível sub-OSHA de &lt;1 ppm (0,85 ppm ± 0,1 ppm) ou ar de quarto (controle) por 6 h/dia, 5 dias/semana, por 12 semanas. Durante o procedimento de inalação, os ratos têm acesso gratuito a alimentos e água. Às 12 semanas, os ratos são sacrificados pela manhã. Este modelo pode ser estendido a períodos mais longos de exposição crônica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig02.jpg"> Figura 2: Projeto da câmara da inalação. Um diagrama de um sistema automatizado da exposição da inalação que forneça concentrações tóxicas homogêneas é mostrado. O software personalizado permite que o usuário altere, monitore e registre variáveis ambientais durante exposições por inalação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60351/60351fig03.jpg"> Figura 3: O cloreto de vinil sozinho não causa ferimento evidente do fígado mas realça a doença de fígado dieta-induzida. (A)O peso corporal e o consumo de alimentos foram monitorados semanalmente. (B) Fotomicrografias representativas da morfologia geral do fígado por manchas de H&amp;E são mostradas (ampliação = 200x). (C)Plasma citrado foi coletado ao final do período de exposição e analisado para atividade enzimática transaminase como índice de danos hepáticos. (D)O peso do fígado foi determinado em diferentes pontos de tempo experimentais e comparado ao peso corporal inteiro. Os resultados são apresentados como a média ± SEM.a,p &lt; 0,05 em comparação com o respectivo controle lfd; b, p &lt; 0,05 em comparação com a ausência de VC. Tamanho das amostras por grupo n = 8 a 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60351/60351fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

O objetivo deste protocolo era desenvolver um modelo do murine da exposição low-level do toxicant que não causa ferimento evidente do fígado mas agrava um pouco dano preexistente do fígado. Este paradigma melhor recapitula a exposição humana e as mudanças sutis que ocorrem após a exposição a concentrações tóxicas que são consideradas seguras.

Cloreto de vinil e dieta rica em gordura como modelo de interação ambiental e obesidade

Vinyl chloride (VC), an abundant environmental contaminant, causes steatohepatitis at high levels, but is considered safe at lower levels. Although ...

O cloreto de vinil exacerba danos hepáticos causados por outros fatores, como a dieta em concentrações abaixo das restrições de segurança atuais. Assim, os parâmetros de uso para populações médias devem ser reavaliados. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa um protocolo de inalação crônica e não invasiva que imita de perto a exposição humana, causando estresse mínimo ao animal.Demonstrando o procedimento estarão Anna Lang, uma pós-doutora, e Regina Schnegelberger, uma estudante de pós-graduação, ambas do meu laboratório. Uma semana antes do início dos experimentos de inalação, pesar todos os animais experimentais e pesar a quantidade de alimentos dietéticos com baixo ou alto teor de gordura a serem dados por gaiola. Forneça alimento e ad libitum de água, substituindo a comida regular para cada grupo de exposição por uma refeição dietética baixa ou rica em gordura, conforme apropriado.Pesar os alimentos restantes ao final de cada dia de alimentação e monitorar os camundongos durante todo o experimento para garantir que a saúde dos animais seja mantida. Para configurar o sistema de exposição à inalação de cloreto de vinil, certifique-se de que o ar diluído nas câmaras experimentais e de controle é ar particulado de alta eficiência e carbono ativado filtrado, seco e regulado por pressão antes de entrar nos respectivos dispositivos de medição de fluxo. Confirme que a temperatura e a umidade relativa são monitoradas de dentro das câmaras experimentais e de controle, que o escapamento da câmara é passado através de um filtro HEPA, uma sonda de dióxido de carbono e um filtro de carbono ativado, antes de entrar na área de escape da capa química para garantir que os ratos estejam recebendo ventilação aceitável.O software personalizado pode ser usado para alterar, monitorar e registrar as variáveis ambientais de interesse durante as exposições de inalação. Para preparar a câmara para uma exposição de inalação, comece desligando todos os fluxos de ar nas câmaras experimentais e de controle. Abra cada porta de câmara e coloque material absorvente de cama, lado absorvente para cima, em cima da panela excreta.Em seguida, molhe o material absorvente para fornecer um nível de umidade confortável de cerca de 40 a 60% de umidade relativa durante o período de exposição e definir o nível de exposição desejado do cloreto de vinil na câmara experimental. Quando as câmaras estiverem prontas, transfira os ratos para gaiolas individuais dentro dos racks da gaiola da câmara de inalação, randomizando a colocação de cada rato dentro dos racks diariamente para garantir que cada rato seja exposto de forma homogênea dentro das câmaras. Em seguida, coloque cada rack de gaiola em sua respectiva câmara e feche as portas da câmara.Para realizar um experimento de exposição à inalação, confirme que a válvula do tanque de gás cloreto de vinil está em posição aberta e ajuste o fluxo diluído para a câmara experimental para 25 litros por minuto. Confirme que o rotametro na câmara de controle está definido para 25 litros por minuto e verifique se todos os sensores estão funcionando corretamente e exibindo os resultados esperados tanto nas câmaras experimentais quanto de controle. Durante toda a exposição, monitore e grave o tempo de exposição, fluxo diluído, fluxo de cloreto de vinil, temperatura, umidade, pressão da câmara, nível de dióxido de carbono e concentração teórica de cloreto de vinil na câmara experimental.Confirme se a temperatura e a umidade da câmara de controle também são exibidas, gragrafadas e registradas. Na metade de cada exposição, quebre as pontas de vidro em um tubo detector de cloreto de vinil e um tubo de pré-tratamento e conecte o fluxo da extremidade do tubo detector de cloreto de vinil à bomba do tubo detector. Use um pequeno pedaço de tubulação para fixar o fluxo no final do tubo do detector de cloreto de vinil ao fluxo da extremidade do tubo pré-tratamento e anexar um pequeno pedaço de tubulação ao fluxo no final do pré-tratamento.Remova um plugue de uma das portas de amostragem perto da zona de respiração e conecte a tubulação do fluxo no final do tubo de pré-tratamento à porta de amostragem. Desde a posição completa, estenda a alça do pistão da bomba do tubo detector até a posição completa para puxar 100 mililitros de gás amostrado da câmara para o tubo detector de cloreto de vinil. Depois de 90 segundos, empurre a alça de volta.Após a última amostra de gás ter sido obtida, remova o tubo da porta de amostragem da câmara e reinsira o plugue na porta. Inspecione a mudança de cor no tubo do detector de cloreto de vinil para verificar a concentração de cloreto de vinil dentro da câmara e registre a leitura do tubo detector para comparação com o valor teórico. Se ocorrer algum problema durante a exposição, ajuste o fluxo de cloreto de vinil como zero e aumente o fluxo diluído para seu valor máximo para limpar rapidamente a câmara.Uma vez que a duração da exposição tenha sido atingida, o software desligará automaticamente o fluxo de cloreto de vinil. O temporizador de segurança de 15 minutos começará então a contar a duração da câmara experimental para limpar o cloreto de vinil. Uma vez que seja seguro remover os animais, clique em ok.No final do período de exposição, gire a torneira da válvula do tanque de cloreto de vinil para a posição fechada e desligue todos os fluxos de ar na câmara de exposição. Gire o rotametro até que nenhum ar esteja fluindo através da câmara de controle e remova a porta de cada câmara. Remova os racks da gaiola das câmaras e transfira os ratos de volta para suas gaiolas sob um capô de fluxo laminar.Em seguida, descarte qualquer resíduo da panela excreta de acordo com as normas institucionais de saúde e segurança e limpe as portas da câmara, panela, racks de exposição e câmaras. Aqui, o peso corporal semanal e o consumo quinzenal de alimentos de um experimento de 12 semanas são mostrados. Todos os camundongos ganharam peso ao longo deste estudo.No entanto, enquanto os camundongos nos grupos de dieta com alto teor de gordura ganharam mais peso em comparação com os camundongos nos grupos de dieta com baixo teor de gordura, os camundongos expostos ao cloreto de vinil não ganharam mais peso do que os camundongos nos respectivos grupos de controle. O consumo alimentar também não difere entre os grupos. Nestes representantes fotomicrogramas de seções hepáticas manchadas de H&E, o cloreto de vinil não causou alterações patológicas no grupo de dieta de baixa gordura.A alimentação de alta gordura com esteatose aumentou significativamente, foi ainda mais exacerbada pela exposição ao cloreto de vinil. Além disso, a exposição ao cloreto de vinil no grupo de dieta rica em gordura resultou em alguns focos inflamatórios. Nos animais de dieta com baixo teor de gordura, o cloreto de vinil não aumentou os níveis de transaminase, enquanto a dieta rica em gordura sozinha aumentou ligeiramente a expressão transaminase, com um aprimoramento significativo desse efeito observado no grupo de dieta rica em gordura exposto ao cloreto de vinil.Além disso, a dieta rica em gordura aumentou significativamente as relações peso do fígado para o corpo, embora o cloreto de vinil não tenha impactado significativamente esse efeito. Ao implementar este protocolo, tome cuidado sempre para que as precauções de segurança adequadas sejam tomadas para que a exposição inadvertida ao cloreto de vinil pelos seres humanos seja evitada. Este procedimento pode responder a perguntas sobre efeitos a curto prazo, de longo prazo e cumulativos do impacto da exposição ao cloreto de vinil na saúde animal, bem-estar e danos aos órgãos.Esses estudos impactam o campo da nossa avaliação de risco ambiental e ocupacional. Por exemplo, nosso grupo agora estuda as interações mecanicistas entre cloreto de vinil e dieta.

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Research

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