Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Os organoides cerebrais humanos são uma ferramenta significativa para estudar a doença em um sistema que é facilmente manipulado e incorpora um ambiente humano e a interação apropriada de vários tipos de células. Essa técnica pode ser aplicada para estudar inúmeras doenças do cérebro, incluindo distúrbios neurodesenvolvimentos, insultos tóxicos e o crescimento e tratamento do câncer no cérebro. A principal vantagem deste protocolo é a capacidade de gerar organoides cerebrais altamente reprodutíveis com uma ampla variedade de tipos de células neuronais.

Isso é feito usando um fluxo de trabalho muito simplista que poderia ser realizado pela maioria dos laboratórios. E estes são produzidos de forma temporária e adequada sem a influência de fatores de crescimento especializados ou matrizes indefinidas tornando-o um sistema muito simples e econômico. Para começar, combine 100 microliters de matriz com 5,9 mililitros de mídia Dulbecco's Modified Eagle Medium ou F12 em um tubo cônico de 15 mililitros.

Cubra cada poço em uma placa de seis poços com um mililitro da matriz de membrana. Enrole a placa em filme de parafina e armazene durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, aspirar o excesso de mídia de cada poço, enxaguar os poços com F12, e adicionar H9 hESCS em um volume total de dois mililitros de mídia mTeSR1 por poço.

Cultura as células de semana a semana. Forneça diariamente com dois mililitros de mídia mTeSR1 e coloque a placa em uma incubadora de oxigênio de 37 graus Celsius com 5% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Use ferramentas de vidro para eliminar células diferenciadas da cultura entre as passagens.

Atualize a mídia diariamente. As células devem ser passagemdas de quatro a seis dias antes de utilizar as células H9 para produção organoide. Para passar as células, comece enxaguando-as com mídia DMEM F12 e aspirando o excesso de líquido.

Após a lavagem, adicione a solução protease e incuba as células por 40 minutos para que as colônias flutuem dentro do poço. Em seguida, lave as células três vezes usando dMEM F12 e, se necessário, titulação para tornar as peças menores. Em seguida, distribua as células em uma proporção aproximada de um a oito sobre quatro placas de seis poços e coloque as placas na incubadora e se alimente diariamente.

Após quatro a seis dias, as células atingem aproximadamente 80% de confluência. Transicioná-los para uma incubadora regular. Diluir a solução de estoque protease para uma concentração de trabalho adicionando um mililitro da solução de estoque a cinco mililitros de DMEM ou médio F12 por cada placa de seis poços de hESCS.

Aspire e remova a mídia de cultura celular, em seguida, cubra o hESCS com a solução protease. Coloque as placas na incubadora por 10 a 15 minutos ou até que as bordas das colônias se parramam e comecem a se separar da matriz, mas antes que elas se recuperem completamente. Incline a placa, aspire a solução protease e lave suavemente as células com dois mililitros de DMEM ou F12 para cada poço três vezes.

Certifique-se de que as colônias permaneçam presas à matriz. Por isso, é fundamental que as peças das células ES estejam no tamanho apropriado, então certifique-se de que elas estão em desabilitar pelo tempo apropriado. Se eles estão lá por muito pouco tempo, pode ser muito difícil tirá-los e separá-los.

E se eles ficarem lá por muito tempo, eles podem realmente apenas sair durante os passos de lavagem. Adicione cerca de um a 1,5 mililitros de mídia mTeSR fresca para cada poço e lave as células da placa em um tubo cônico de 50 mililitros usando tubulação suave. Aspire e dispense hESCS dentro da placa até atingir aproximadamente 1/30 do seu tamanho original.

Agora, os aglomerados da colônia se assemelham a peças de 250 a 350 micrômetros. Transfira as células para um único frasco T75 de fixação ultra baixa contendo 30 mililitros de mídia mTeSR sem bFGF. No dia seguinte, incline o frasco de tal forma que as células vivas se agrupam no canto.

Se houver um grande número de células que aderiram ao fundo do frasco, use uma pipeta de 10 mililitros para transferir as células para um novo frasco. Espere ter uma alta população de células mortas nos primeiros dias. Uma vez que as células se instalem, aspire fora da mídia e células mortas deixando cerca de 10 mililitros de mídia contendo as células vivas e adicione 20 mililitros de baixa mídia bFGF complementados com 30 nanogramas por mililitro de bFGF.

Depois de dois dias, verifique as células. A maioria das células deve parecer saudável e brilhante. No entanto, se mais de um terço das células parecerem escuras, incline o frasco e substitua 20 mililitros de mídia por 20 mililitros de baixa mídia bFGF complementadas com 20 nanogramas por mililitro de bFGF.

No terceiro dia, remova metade da mídia e substitua por 15 mililitros de mídia hESC complementados com 10 nanogramas por mililitro de bFGF. No quinto dia, substitua metade da mídia por 15 mililitros de mídia de indução neural. Depois disso, a cada dois dias, substitua metade do meio por mídia de indução neural.

Depois de três semanas na cultura, adicione penicilina-estreptomicina 100X à mídia em uma concentração final de 1X, se desejar. Refrescar metade da mídia dia não. Neste protocolo, os organoides cerebrais formados pareciam brilhantes e semelhantes em tamanho sem células escuras morrendo nos centros desses aglomerados.

As células foram gradualmente desmamadas do bFGF. No quinto dia, eles foram colocados em mídia de indução neural e permaneceram nesta mídia durante todo o período cultural. Embora os organoides tenham ficado maiores e, portanto, mais escuros com o tempo, as estruturas neurais semelhantes a rosetas se expandiram, o que indica o início da diferenciação neural e contém características do tubo neural embrionário.

Para dar uma olhada mais aprofundada na expressão genética dentro das células, foi realizada a análise qPCR. O transportador de glutamato VLGUT1 foi expresso em duas semanas e meia, aumentou em cinco semanas, e permaneceu consistente durante cinco meses de cultura. Um marcador de cérebro foxg1 foi expresso em níveis baixos até cinco semanas na cultura.

O marcador de camada profunda Tbr1 atingiu o pico em torno de cinco semanas e diminuiu posteriormente. Considerando que a expressão do marcador de camada superior Satb2, o marcador ventral Eng1, o marcador da medula espinhal hindbrain Hoxb4, bem como o marcador oligodendrocyte Olig2 aumentaram ao longo do tempo. Em contraste, o marcador de células-tronco Sox2 diminuiu com o tempo.

O marcador gliano GFAP atingiu o pico de cinco semanas e permaneceu relativamente constante posteriormente. Lembre-se de tomar o máximo cuidado ao manusear células ES em organoides em estágio inicial para evitar contaminação, pois elas são cultivadas sem antibióticos e também lembre-se de se alimentar de acordo com o cronograma. Após este procedimento, você pode avaliar os organoides usando técnicas como RT-PCR quantitativo para expressão genética e imunofluorescência para expressão e localização de proteínas.

Utilizando essa técnica, pudemos estudar a capacidade de uma pequena molécula para aliviar aspectos da lesão hipóxica neonatal humana modelada em uma câmara de hipóxia. É significativo que esses organoides cerebrais humanos se comportem de forma semelhante aos experimentos in vivo do rato.