Análise imunoblot da electroforese do gel do polyacrylamide nativo da dimerization IRF5 endógena
6 de outubro de 2019
Um método ocidental nativo do borrão para analisar o dimerização regulador endógeno do fator 5 do interferon na linha de pilha dendríticas do plasmacytoid Cal-1 é descrito. Este protocolo pode ser aplicado a outras linhas de célula também.
Este protocolo utiliza uma técnica amplamente utilizada, juntamente com reagentes e ferramentas que podem ser adquiridas comercialmente para avaliar a ativação endógena do IRF5 durante os primeiros eventos de estimulação. Pode ser facilmente aplicado para sondar a biologia IRF5 em outro contexto celular. Embora o PAGE nativo seja uma técnica amplamente utilizada, obter resultados claros, robustos, interpretatáveis e reprodutíveis pode ser tecnicamente desafiador.
O uso de um sistema comercial de buffer e gel ajuda a minimizar a variabilidade. E prestar atenção aos detalhes é essencial, e a experiência é a chave para o sucesso na obtenção de bons resultados. Este protocolo page nativo modificado envolve muitas etapas com detalhes sutis que são fundamentais para o sucesso.
A demonstração visual pode mostrar esses detalhes que seriam benéficos para os pesquisadores. Mantenha a cultura celular CAL-1 em um frasco T75 a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, com meio RPMI completo 1640. Quando estiver pronto para estimular as células, transfira-as para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífugas a 200 x g por cinco minutos.
Remova o supernatante e suspenda a pelota em média para obter uma suspensão celular única homogênea. Em seguida, contatabiliza as células com um hemótmetro, e as semeia a uma densidade de 1.000.000 células por poço em uma placa de seis poços com quatro mililitros de meio pré-aquecido em cada poço. Incubar as células por 20 a 24 horas para permitir que a confluência atinja 90 a 95% No dia seguinte, estimule as células adicionando quatro microliters de um miligrama por mililitro R848 por poço, certificando-se de deixar um controle bem com as células e sem tratamento R848.
Balance suavemente a placa de um lado para o outro para dispersar uniformemente o R848, em seguida, incubar as células por 2 a 16 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a incubação, transfira as suspensões celulares da placa para tubos de centrífugas de 5 mililitros. Centrifugar as células a 200 x g por cinco minutos, depois remova o supernasce e suspenda novamente a pelota em um mililitro de PBS.
Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mililitro, e gire-a a 12.000 x g por 30 a 60 segundos a 4 graus Celsius, depois remova cuidadosamente o supernasce. Prepare o tampão de lise de acordo com as instruções do manuscrito, e mantenha-o no gelo até estar pronto para uso. Suspenda a pelota celular em 30 microliters de tampão de lise gelada, e pipeta para cima e para baixo para misturar.
Em seguida, incubar o tubo no gelo por 15 a 20 minutos. Esclareça o lise por centrifugação a 12.000 x g por 15 a 20 minutos a 4 graus Celsius, e transfira o supernasce para um tubo pré-refrigerado de 1,5 mililitro, certificando-se de manter os extratos no gelo o tempo todo. Em seguida, meça a concentração de proteínas usando Bradford Reagent.
Prepare os buffers de eletroforese de câmara superior e inferior de acordo com as instruções do manuscrito e enxágue um gel PAGE nativo de 3-12% com água, sem distorcer os poços O cuidado extra deve ser tomado ao manusear o desoxicolato de sódio. Epi para proteção como jaleco, óculos de segurança e máscara são necessários para manusear o produto químico. Em seguida, coloque o gel no Mini Gel Tank, remova o pente, adicione os buffers de eletroforese de câmara superior e inferior preparados e pré-execute-o em uma sala fria de 4 graus Celsius ou no gelo a 150 volts por 30 minutos.
Enquanto isso, prepare as amostras para o carregamento misturando as proteínas celulares no gelo com o Buffer de Amostra Nativa 4X. Uma vez que o pré-funcionamento esteja completo, carregue de 10 a 15 microgramas de proteína para cada poço, e execute o gel por 30 minutos a 85 volts, seguido por duas horas a 150 volts. Em seguida, mergulhe o gel em SDS correndo tampão por 30 minutos em temperatura ambiente.
Ative a membrana de difluoreto de polivinidae, encharcando-a em metanol por aproximadamente cinco minutos. Faça um corte em um canto da membrana para indicar sua orientação, e monte o sanduíche de transferência de acordo com o protocolo do fabricante. Coloque o de transferência no tanque e transfira a 20 volts por uma hora no gelo.
Em seguida, remova a membrana do com fórceps plásticos e bloqueie a membrana no bloqueio do tampão à temperatura ambiente por 45 minutos em um agitador de balanço. Em seguida, incubar a membrana com o anticorpo primário a 4 graus Celsius durante a noite ou à temperatura ambiente por duas horas e lavá-la com tampão de lavagem 1XTBST por três minutos enquanto balança. Em seguida, incubar a membrana com o anticorpo secundário novamente usando o tampão de lavagem 1XTBST à temperatura ambiente por 45 minutos, repetindo as lavagens.
Em seguida, escaneie a mancha usando um sistema de documentação de gel apropriado. Utilizando este protocolo, foram analisadas células CAL-1 estimuladas ou não com R848 com um imunoblot. Em células CAL-1 não estimuladas, o IRF5 foi detectado como uma única banda na PÁGINA nativa correspondente à sua forma monomérica.
Para as células estimuladas, o nível de monômero IRF5 diminuiu, enquanto o nível do escudeiro aumentou. Um imunoblot com anticorpo anti-IRF5 foi realizado em células IRF5 super-expressas 293 T transfectadas com várias construções. Nenhum IRF5 foi detectado no controle não transtrafetado, demonstrando a especificidade do anticorpo anti-IRF5.
Uma única banda correspondente ao IRF5 monomérico só foi detectada nas células 293 T que expressam demais o IRF5. Quando construções codificando proteínas ativantes IRF5 foram co-transfeinadas, uma banda lentamente migratória correspondente à forma dimeric de IRF5 apareceu. No entanto, o NMDA5, uma proteína relacionada ao RIG-I, não induziu a dimerização IRF5.
O uso de géis gradientes Bis-Tris é crucial, provavelmente devido ao pH específico e à composição química deste sistema eletroforético de gel que permitiu a separação de formas monoméricas e dimeric de IRF5. Além disso, a lise e a preservação de lises celulares em tampão de amostra nativa não desnaturação retém estruturas proteicas nativas. Aqui usamos um comercialmente disponível que é adaptado para ácidos PAGE nativos.
Um método adicional que complementa muito com isso é utilizar o sistema de citometria de fluxo de imagem ImageStream para avaliar a translocação nuclear IRF5, que é a substância que na ativação do IRF5 após a dimerização. Quando combinado com nosso protocolo, ele serve como um outro tipo de teste para validar as etapas envolvidas na ativação do IRF5. Sendo um dos principais reguladores da resposta inflamatória, o IRF5 desempenha um papel importante na infecção e imunidade, doenças autoimunes, câncer e muitas outras doenças importantes para a saúde humana.
Há também esforços no desenvolvimento de terapêuticas para atingir o IRF5 e fatores relacionados à transcrição. Este protocolo permitirá que pesquisadores de diversas áreas compreendam e testem a biologia IRF5.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método de Western blot nativo para analisar a dimerização endógena do fator regulador de interferon 5 (IRF5) na linhagem de células dendríticas plasmocitoides CAL-1. O protocolo é adaptável para uso em outras linhagens celulares, facilitando o estudo da biologia do IRF5 em diversos contextos celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Imunologia
Contexto
- O IRF5 desempenha um papel crucial na resposta imune.
- Compreender a dimerização do IRF5 é importante para elucidar sua função.
- A PAGE nativa pode ser tecnicamente desafiadora, mas é essencial para obter resultados confiáveis.
- Reagentes comerciais podem ajudar a padronizar o processo experimental.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo confiável para avaliar a ativação de IRF5.
- Aprimorar o entendimento da biologia de IRF5 em diferentes contextos celulares.
- Minimizar a variabilidade nos resultados experimentais.
Métodos Utilizados
- Técnica de eletroforese nativa em gel seguida de transferência para membrana.
- Uso de tampões de corrida comerciais e sistemas de gel.
- Atenção aos detalhes na execução do protocolo.
- Abordagem passo a passo para garantir reprodutibilidade.
Resultados Principais
- Análise bem-sucedida da dimerização de IRF5 em células CAL-1.
- O protocolo produz resultados claros e interpretáveis.
- Aplicabilidade demonstrada em outras linhagens celulares.
- Destacou a importância da precisão técnica.
Conclusões
- O protocolo de PAGE nativo modificado é eficaz para o estudo do IRF5.
- A atenção aos detalhes é fundamental para obter bons resultados.
- Este método pode ser adaptado para aplicações mais amplas em biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A avaliação dos estados de ativação de fatores de transcrição, como a dimerização da IRF5, fornece uma compreensão mecanicista das vias de sinalização inflamatória relevantes para doenças autoimunes e validação de alvos em oncologia. Este método de imunoblotagem em PAGE nativa permite a detecção de alterações conformacionais endógenas de proteínas sem artefatos de superexpressão, apoiando testes iniciais de hipóteses em programas de descoberta com foco em imunologia. O ensaio fornece leituras quantitativas e reprodutíveis que orientam decisões de prosseguir/interromper, esclarecendo o engajamento do alvo e a modulação da via em sistemas celulares relevantes para a doença.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação do mecanismo de ativação do IRF5 por meio da detecção direta da formação de dímeros endógenos em resposta à estimulação da via TLR-MyD88.
- Valor Operacional: Utiliza reagentes comercialmente disponíveis e condições padronizadas de eletroforese em gel nativo para reduzir a variabilidade e melhorar a transferibilidade do ensaio entre laboratórios.
- Valor Preditivo: Distingue as formas monomérica e dimérica do IRF5, correlacionando condições de estimulação com estados funcionais de ativação, o que auxilia na redução de riscos do alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Fornece um formato de imunoblotagem validado para monitorar a ativação de IRF5 como leitura farmacodinâmica em cascatas de triagem de compostos.
- Reprodutibilidade: Enfatiza condições padronizadas de lise, eletroforese e transferência para garantir a separação consistente de complexos proteicos nativos.
- Escalabilidade: Adaptável a múltiplas linhagens celulares, incluindo pDCs CAL-1 e HEK293T, permitindo a validação cruzada do alvo em diferentes modelos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Relaciona a dimerização de IRF5 com a indução de citocinas pró-inflamatórias, conectando a ativação molecular a desfechos funcionais na imunidade e autoimunidade.
- Continuidade Translacional: Complementa ensaios de translocação nuclear (por exemplo, ImageStream) para validar a cascata completa de ativação, desde a dimerização até a sinalização nuclear.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Confirma a especificidade da ativação de IRF5 ao demonstrar que proteínas relacionadas, como MDA5, não induzem dimerização, reduzindo preocupações com alvos fora do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se na fase inicial da descoberta, na qual a validação do alvo precede a identificação de compostos líderes, oferecendo um ponto de verificação bioquímico para modulação da via antes da triagem fenotípica celular. Ele auxilia nos esforços de desenvolvimento de ensaios que exigem detecção quantitativa de proteínas em seu estado nativo para avaliar o engajamento do alvo por moléculas pequenas ou biológicos. O fluxo de trabalho gera razões claras entre dímeros e monômeros que servem como entradas analíticas para comparar a eficácia de compostos ou os efeitos de perturbações genéticas em projetos de imunologia.
- Biologia da Descoberta: Testa hipóteses mecanicistas sobre a ativação de IRF5 downstream de agonistas de TLR, como R848, esclarecendo relações causais na sinalização imune.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios de ligantes ou inibidores nos quais a dimerização de IRF5 serve como um ponto final mensurável para modulação do alvo.
- Análises: Gera dados quantitativos de imunoblot para comparar estados de ativação entre diferentes condições, apoiando análises de resposta à dose e de curso temporal.
- Pesquisa Translacional: Conecta a ativação bioquímica (dimerização) à localização subcelular (translocação nuclear) quando combinada com métodos complementares de imagem.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma nativa de imunoblot transferível, aplicável a outros fatores de transcrição ou proteínas de sinalização que exijam análise em estado nativo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao visualizar diretamente mudanças conformacionais endógenas do IRF5 sem desnaturação ou superexpressão.
- Valor Operacional: Promove a padronização por meio do uso de sistemas comerciais de tampão e controles procedimentais detalhados, aumentando a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Melhora a confiança no alvo ao fornecer evidência direta da ativação da via, orientando a priorização de terapêuticas direcionadas ao IRF5.
- Impacto no Portfólio: Permite decisões de avanço ajustadas ao risco ao confirmar o engajamento do alvo em modelos humanos de pDC relevantes para a doença.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência no manuseio de proteínas nativas e em eletroforese não desnaturante para preservar os complexos proteicos durante a preparação das amostras.
- Depende do acesso a sistemas compatíveis de géis de PAGE nativa, tampões de corrida e equipamentos de eletroforese em baixa temperatura para manter a resolução.
- Necessita padronização das condições de lise e dos tampões amostrais entre equipes para garantir detecção consistente de monômeros e dímeros.
- Deve levar em conta os níveis de expressão específicos de cada tipo celular e a otimização da estimulação ao ser adaptado a modelos não-pDC.
- Limitado pela necessidade de anticorpos de alta qualidade e específicos, capazes de detectar IRF5 nativo em lisados complexos sem reatividade cruzada.
