In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato celular espacial com caenorhabditis isolado elegans embrião blastômeros e contas adesivas de poliestireno
26 de novembro de 2019
As complexidades dos tecidos dos sistemas multicelulares confundem a identificação da relação causal entre pistas extracelulares e comportamentos celulares individuais. Aqui, apresentamos um método para estudar a ligação direta entre pistas dependentes de contato e eixos de divisão usando blastômeros de embriões c. elegans e contas de poliestireno adesivo.
Complexo de tecidos multicelulares, este protocolo reconstitui a conduta celular de forma simplificada. Uma coisa é essa técnica para estudar as relações diretas entre prótons condutores celulares e resposta celular. Este protocolo usa contas de poliestireno quimicamente funcionais para reconstituir os prótons do condutor celular.
As contas podem ser cortadas com qualquer próton de interesse, para testar seus efeitos na resposta celular. Usamos este método em C-Elegance em embriões de rato. Portanto, este protocolo pode ser vertical aos estudos de organismos amplos.
Como os embriões são frágeis após o tratamento completo de cloríteis, é necessária prática significativa antes que se possa isolar com sucesso a blastomere. A demonstração visual fornecerá uma maior compreensão de como se deve lidar com capilar durante métodos de isolamento de blastomere. Para começar, pese 10 mili gramas de contas de poliestireno modificadas de carboxilato em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mili litro.
Adicione um mili litro de tampão MES no tubo para lavar. Vórtice do tubo para misturar as contas. Gire o tubo por 60 segundos em 2000XG através de centrífuga de bancada.
Dicard o supernatante, cuidadosamente pipetando o buffer. Lave as contas novamente com um mililitro de amortecedor MES. Após a lavagem, adicione um mili litro de tampão MES contendo 10 mili gramas de EDAC no tubo, para ativar os grupos de carboxíl de superfície.
Vórtice do tubo para misturar as contas. Gire e incubar o tubo por 15 minutos em temperatura ambiente. Gire as contas por 60 segundos em 2000XG.
Descarte o supernatante, extravando cuidadosamente o tampão e lave com um mililitro de PBS. Vórtice do tubo para misturar as contas e repetir a lavagem PBS mais uma vez. Prepare uma série de diluição de 0,65 mil litros de um, 10, 100 e mil vezes de rhodamine Red-X da solução de estoque Rhodamine Red-X de 0,65 mili litros.
Pippette 20 microcompactos de contas em cada tubo de diluição serial. Gire e incuba os tubos por cinco minutos em temperatura ambiente. Lave as contas duas vezes com um mililitro de PBS.
Após a lavagem, adicione um mili litro de PBS nos tubos e armazene-os a quatro graus Celsius por até seis semanas. Verifique a intensidade da fluorescência das contas sob um microscópio usado para imagens vivas. Segure cada extremidade de um micro-capilar com capacidade de 10 micro litros com a mão direita e esquerda.
Puxe o micro-capilar para ambas as extremidades para aplicar tensão e traga o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados à mão. Sob o microscópio dissecando, corte as pontas dos capilares puxados à mão com fórceps. Faça os dois tamanhos de abertura de ponta aproximadamente duas vezes, e uma vez o curto comprimento de acesso de Embriões C-Elegance para a transferência de embriões e remoção de casca de ovo, respectivamente.
Coloque o capilar puxado em um aparelho de boca-pippetting. Pippette 45 microcompactos de solução de sais de ovo em um poço de um slide multi-welled. Coloque de 5 a 10 adultos C-Elegance no poço.
Para obter os primeiros Embriões C-Elegance cortar os adultos em pedaços, posicionando duas agulhas para a direita e para a esquerda do corpo de C-Elegance, e deslizando as agulhas um pelo outro. Pippette 45 microcomplores de solução de hipoclorito em um poço ao lado do poço contendo solução de sal de ovo e pippette 45 microcomprais do Shelton's Growth Medium para os três poços subsequentes. Transfira um estágio celular e dois embriões de estágio celular inicial para a solução de hipoclorito pela pippette bucal com a abertura de tamanho maior e espere por 40 a 55 segundos.
Lave os embriões transferindo-os para os próximos três poços com o Meio de Crescimento de Shelton. Com um a dois segundos em cada um dos dois primeiros poços. Utilizando o capilar desenhado à mão com a abertura de tamanho menor, repita cuidadosamente o embrião para a remoção da casca de ovo.
Depois disso, pippette continuamente com o capilar desenhado à mão para separar os blastomeres embrionários de duas células. Após a remoção da casca de ovo, minimize a força na pippetação dos embriões para cima e para baixo para evitar a explosão. Prepare uma câmara de imagem colocando uma mancha de cobertura em um suporte de deslizamento de tampa e tape as bordas do tapa de cobertura para stabalizá-la.
Gire o suporte do deslizamento e desenhe um círculo na tampa com uma caneta hidrofóbica. Adicione o meio de crescimento de Shelton dentro do círculo desenhado pelo marcador hidrofóbico, e transfira a blastomere isolada para a câmara de imagem dentro do círculo. Agora, dispense um pequeno volume das contas quimicamente funcionalizadas no deslizamento de tampas usando o capilar desenhado à mão com a abertura maior.
Controle a posição das contas soprando no capilar desenhado à mão até que as contas se conectem à blastomere isolada. Monte a mancha de cobertura para evitar a evaporação do meio e realize imagens ao vivo usando um microscópio invertido. Neste estudo, o sinal fluorescente da conta tratada com 0,005 micro gramas por mililitro Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester para a cepa transgênica expressando miosin-2 e M-cherihistone era muito fraco.
Por outro lado, o sinal fluorescente das contas tratadas com cinco micro gramas por litro de rhodamina Red-X Succinimidyl Ester era muito forte. A concentração de Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester a 0,5 micro gramas por mililitro foi ótima para esta cepa transgênica em particular. Durante a imagem ao vivo foi identificado um avião onde dois centrossomos estavam verticalmente alinhados.
O avião com ângulo de mais ou menos 90 graus deste avião é plano de fuso. O ângulo de orientação do fuso em relação à interface de contato celular/contas após a citocinese mostra que ambas as células filhas foram anexadas à conta em uma linha que passa por ambos os pontos de contato foi usado como orientação de contato. É preciso aprender como embriões e casca de ovo reagem a certas forças externas aplicadas pela pippette bucal.
Teoricamente, qualquer resposta celular pode ser estudada, por exemplo, a especificação sulfato pode ser estudada por células de cultivo e contato com contas adesivas em longo prazo. Esta técnica tem sido usada para entender o mecanismo de orientação da divisão celular dependente de contato. O filtro PTF foi utilizado para evitar a inalação de vapores de solução hipoclorito via pippette bucal.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para investigar a ligação direta entre sinais dependentes de contato e comportamentos celulares usando blastômeros de embriões de C. elegans e contas adesivas de poliestireno. O protocolo simplifica as complexidades dos sistemas multicelulares para melhor compreensão das respostas celulares a sinais extracelulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biologia do Desenvolvimento
Fundo
- Tecidos multicelulares exibem interações complexas.
- Compreender as respostas celulares é crucial para a biologia do desenvolvimento.
- Sinais dependentes de contato desempenham um papel significativo no comportamento celular.
- Reconstituindo a conduta celular pode auxiliar no estudo dessas interações.
Propósito do Estudo
- Estabelecer um método para estudar respostas celulares a sinais extracelulares.
- Utilizar contas de poliestireno para reconstituir ambientes celulares.
- Aplicar este método a embriões de C. elegans para insights biológicos mais amplos.
Métodos Utilizados
- Uso de contas de poliestireno quimicamente funcionais.
- Reconstituição da conduta celular de maneira simplificada.
- Aplicação do método a embriões de C. elegans.
- Testando efeitos de vários sinais sobre respostas celulares.
Principais Resultados
- Demonstrou uma relação direta entre sinais de contato e comportamento celular.
- Validou o uso de contas de poliestireno no estudo de respostas celulares.
- Forneceu insights aplicáveis a uma gama de organismos.
- Facilitou uma melhor compreensão das interações multicelulares.
Conclusões
- O método efetivamente liga sinais extracelulares a comportamentos celulares.
- Contas de poliestireno são uma ferramenta versátil para tais estudos.
- Esta abordagem pode melhorar a pesquisa em biologia do desenvolvimento e celular.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This method enables direct interrogation of contact-dependent signaling in a controlled in vitro system, reducing confounding variables from multicellular complexity. By isolating blastomeres and using adhesive beads to define precise spatial contact patterns, researchers can establish causal links between extracellular cues and cellular responses such as division orientation. This supports mechanistic de-risking in early target validation by clarifying how physical microenvironmental inputs regulate cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests hypotheses about how specific cell-contact geometries influence division axis orientation and downstream fate specification.
- Operational Value: Provides a reductionist platform to deconvolute contact-mediated signaling from soluble factor effects.
- Predictive Value: Enables quantitative correlation of contact pattern parameters with cellular phenotypic outputs for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible cell-bead interfaces for consistent phenotypic readouts across experimental replicates.
- Scalability: Supports preparation of bead libraries with graded ligand densities to probe dose-dependent contact responses.
- Workflow Integration: Outputs such as spindle orientation angles or division symmetry serve as quantifiable endpoints for automated image-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Findings on contact-dependent division orientation inform models of tissue patterning defects relevant to congenital disorders.
- Translational Continuity: Establishes a bridge from in vitro contact mechanism discovery to in vivo validation in developing embryos.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct contact modulation versus secondary signaling cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where understanding spatial regulation of cellular behavior informs target selection and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how adhesive interface composition and geometry regulate mitotic spindle alignment.
- Screening: Enables assay standardization via fluorescently tagged beads and controlled contact geometry for reproducible phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative spatial readouts (e.g., division axis angle relative to contact plane) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links in vitro contact response data to in vivo spatial patterning outcomes in embryonic development.
- Enterprise Reuse: The bead functionalization and blastomere isolation workflow can be adapted to other model systems for cross-species target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in attributing cellular responses to specific spatial contact cues.
- Operational Value: Delivers a robust, reproducible system for generating defined cell-contact microenvironments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating targets within physiologically relevant spatial contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on evidence of contact-dependent mechanism validity.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgical techniques for blastomere isolation and capillary handling.
- Access to fluorescence microscopy and microfluidic-compatible imaging chambers for live-cell analysis.
- Standardization of bead functionalization protocols (e.g., EDAC activation, Rhodamine labeling) across users and batches.
- Adaptation considerations for applying the method to non-nematode blastomeres or alternative adhesive substrates.
- Practical limitations include embryo fragility post-isolation and the need for optimization of bead concentration and ligand density per cell type.
