Name: Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprenda a criar bioink pdECM a partir de tecido pancreático porcino para bioimpressão 3D de construtos com ilhotas encapsuladas. Este método preserva a composição tecido-específica e melhora a viabilidade celular para tratamento do diabetes tipo 1.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa de Desenvolvimento de Biotecnologia e Tecnologia Médica da National Research Foundation (NRF) financiado pelo governo coreano (MSIT) (2017M3A9C6032067) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) e "ICT Consilience Creative Program" (IITP-2019-2011-1-00783) supervisionado pelo IITP (Institute for Information & Communications Technology Planning & Evaluation).

Tecidos pancreáticos suínos foram coletados de um matadouro local. Experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Asan Medical Center, Seul, Coréia.
1. Descelularização de tecidos
<ol><li>Prepare as soluções para a descelularização. NOTA: 1x fosfato-buffered soro lógico (PBS) usado em todos os preparativos de solução é diluído pela adição de água destilada para 10x PBS.<ol>
<li>Para a solução Triton-X 100 de 1%, dissolva 100 mL de 100% de solução Triton-X 100 em 900 mL de 1x PBS usando uma barra de agitação magnética com a agitação a 150 rpm para 6 h. Faça 400 mL de 1% Triton-X 100 solução com 40 mL de 10% Triton-X 100 solução e 360 mL de 1x PBS preparado pouco antes do uso. NOTA: A solução Triton-X 100 de 10% pode ser armazenada à temperatura ambiente até que seja necessário.</li>
		<li>Para a solução de ácido peracético de 0,1%, diluir 8,5 mL de 4,7% de ácido peracético em 22,8 mL de 70% de etanol com 368,7 mL de água destilada pouco antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retire os tecidos periféricos do pâncreas e corte o tecido antes da descelularização.<ol>
<li>Lave o pâncreas porcino ressecado com água da torneira corrente e retire os tecidos periféricos usando tesoura esterilizada.</li>
		<li>Transfira o pâncreas em um saco plástico com fórceps e congele -80 °C por 1 h para ajudar a cortar o pâncreas de forma eficaz para o próximo passo.</li>
		<li>Corte o pâncreas congelado em pedaços de 1 mm de espessura usando um ralador.</li>
		<li>Transfira 50 g do tecido fatiado em um recipiente plástico de 500 mL. NOTA: Um recipiente plástico com uma tampa é recomendado aqui para proteger os tecidos da contaminação e evitar a evaporação da solução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamento com reagentes. NOTA: Todo o processo de descelularização deve ser realizado a 4 °C em um agitador orbital digital às 150 rpm. Em todas as etapas de descelularização, o desprendimento físico usando fórceps é necessário para evitar que as fatias de pâncreas grudem. Lavar o recipiente com água destilada é necessário para remover os reagentes residuais completamente no recipiente.<ol>
<li>Antes de qualquer tratamento de reagente, lave 50 g de pâncreas fatiado com 300 mL de água destilada usando uma coqueteleira.</li>
		<li>Mexa o tecido continuamente a 150 rpm até que a água turva desapareça (após aproximadamente 12 h). Substitua a água destilada a cada 2 h. NOTA: Alterar a água destilada a cada hora é recomendado para a eficiência para remover a água turva mais rapidamente.</li>
		<li>Descarte a água e trate os 50 g de tecidos com 400 mL de 1% Triton-X 100 na solução PBS 1x por 84 h. Refresque a solução a cada 12 h. NOTA: Neste ponto, a quantidade de tecido diminuirá porque os componentes celulares começam a ser removidos.</li>
		<li>Trate com 400 mL de isopropanol (IPA) por 2 h para remover a gordura restante do pâncreas. NOTA: É normal que o tecido se torne difícil devido à remoção de gordura neste processo.</li>
		<li>Após 2 h, retire o IPA e lave o tecido com 400 mL de 1x PBS para 24 h. Refresque o PBS 1x cada 12 h.</li>
		<li>Esterilizar o tecido descelularizado, descarte a solução anterior e trate com 400 mL de 0,1% de ácido peracético em 4% de etanol para 2 h.</li>
		<li>Para remover detergente residual, lave o tecido com 400 mL de 1x PBS para 6 h. Refresque a solução a cada 2 h.</li>
		<li>Colete os tecidos descelularizados em um tubo cônico de 50 mL com fórceps.</li>
		<li>Congele a amostra a -80 °C para 1 h. Cubra o tubo cônico com uma limpeza sem fiapos em vez da tampa e conserte com um elástico para lioffiização eficiente.</li>
		<li>Lyofilize o tecido descelularizado em -50 °C para 4 d. NOTA: Para a etapa 1.3, 1 g de tecido não decelularizado também deve ser liofilizado as mesmas condições.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Avaliação de tecidos descelularedos
NOTA: Para avaliar a quantidade residual de dsDNA, glicosaminoglicanos (GAGs) e colágeno no tecido descelularizado em comparação com o tecido nativo, pelo menos 1 g de cada um dos tecidos não descelularizados (tecido nativo) e tecido descelularizado são necessários para um lote de avaliação. A quantidade de dsDNA, GAGs e colágeno pode ser calculada com base no peso seco do tecido.
<ol><li>Prepare soluções para ensaios bioquímicos.<ol>
<li>Prepare a solução de papain para a digestão da amostra. NOTA: A quantidade de buffer a ser feita pode ser ajustada de acordo com o número de amostras.<ol>
<li>Dissolva 119 mg de 0,1 M de fosfato de sódio (monobasic), 18,6 mg de 0,5 mM Na2-EDTA, e 8,8 mg de 5 mM cisteína-HCl em 10 mL de água autocllavada.</li>
			<li>Ajuste o pH da solução para 6,5 adicionando a solução De 10 M NaOH.</li>
			<li>Adicione 125 μL de 10 mg/mL solução de ações de papaina para a solução acima e vórtice, permitindo que cada elemento se misture uniformemente.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare soluções para o ensaio azul de dimetileno (DMMB).<ol>
<li>Para fazer dinência de DMMB, dissolva 8 mg de 1,9-dimetileno de zinco azul cloreto de dois sal, 1,52 g de glicina e 1,185 g de NaCl em 500 mL de água autocllavada. Ajuste o pH para 3 adicionando a solução HCl de 0,5 M ao medir a mudança de pH usando um medidor de pH de bancada. Em seguida, filtre isso através de um filtro de vácuo de 500 mL.</li>
			<li>Faça 15 μL de 10 mg/mL chondroitin sulfato Uma solução para o padrão.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare soluções para o ensaio hidroxiproline.<ol>
<li>Para a solução de trabalho de cloramina, dissolva 2,4 g de acetato de sódio, 1 g de ácido cítrico e 0,68 g de hidróxido de sódio em 24 mL de água destilada e adicione 240 μL de ácido acético glacial, 10 μL de tolueno e 6 mL de IPA. NOTA: Dissolva todos os pós em solução usando um misturador de vórtice. A solução de trabalho de cloramina pode ser armazenada a 4 °C por até três meses.</li>
			<li>Para a solução de cloromina T, dissolva 0,35 g de cloramina T em 20 mL de solução de trabalho de cloramina e adicione 2,5 mL de IPA. Vortex para misturar todos os componentes. NOTA: Prepare-se imediatamente antes do uso.</li>
			<li>Para a solução P-DAB, coloque 3,75 g de P-DAB em 6,5 mL de ácido perdérico e 15 mL de IPA; envolvê-lo em folha de alumínio. NOTA: Prepare-se imediatamente antes do uso.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione 1 mL de solução de papaina a 10 mg de tecido lyofificado em um tubo de microcentrírífuga de 1,5 mL e vórtice do tubo para digerir melhor a amostra.</li>
	<li>Coloque o tubo de microcentrírífuga de 1,5 mL em um rack de borracha e digere as amostras em um copo de 500 mL que contém 300 mL de água a 60 °C por 16 h.</li>
	<li>Centrífuga a 9.500 x g por 20 min, recolher o supernatant, e transferi-lo para um novo tubo.</li>
	<li>Quantificar o DNA residual e as principais proteínas do tecido descelularizado.<ol>
<li>Carga 1 μL de amostra digerida no espectrômetro e medir a quantidade de dsDNA de acordo com as instruções do fabricante. NOTA: O experimentador deve amarrar o cabelo para trás e usar uma máscara para evitar contaminar a amostra.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize um ensaio de DMMB para quantificar a quantidade de GAGs que permanece no tecido decellularized.<ol>
<li>Misture 1 μL de sulfato de condroitina Uma solução e 499 μL de 1x PBS para fazer padrões. Diluir o sulfato de condroitina Uma solução com água destilada em concentrações de 0, 4, 8, 12, 16 e 20 μg/mL.</li>
		<li>Carregar triplicados de 50 μL de cada concentração do padrão e amostras digeridas em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Adicione 200 μL do tintendência DMMB a cada poço usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Leia imediatamente a absorção em 525 nm em um leitor do microplate.</li>
	</ol></li>
	<li>Realize um ensaio hidroxiproline para quantificar a quantidade de colágeno.<ol>
<li>Para realizar um ensaio hidroxiproline, incubar 250 μL de amostra digerida com volumes iguais de HCl em 120 °C para 16 h.</li>
		<li>Seque os resíduos à temperatura ambiente por 3 h para resfriar as amostras e, em seguida, redissolver as amostras em 1 mL de 1x PBS.</li>
		<li>Centrífuga a 2.400 x g por 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Prepare a solução hidroxiproline de 100 μg/mL como padrão.</li>
		<li>Diluir a solução hidroxiproline com água destilada a uma concentração de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30 μg/mL para uma solução padrão.</li>
		<li>Carregar triplicados de 50 μL de amostras e solução padrão em uma placa de 96 poços.</li>
		<li>Adicione 50 μL de solução De Cloramina T, em seguida, incubar por 20 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 50 μL de solução p-DAB e incubar por 30 min a 60 °C. NOTA: Aliquot em um quarto escuro. Após a adição, envolva a placa com papel alumínio.</li>
		<li>Incubar à temperatura ambiente por 30 min.</li>
		<li>Após o resfriamento, medir a absorção em 540 nm em um leitor de microplaca.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Preparação bioink
NOTA: pó pdECM pode ser armazenado de forma evigorada a -80 °C por pelo menos um ano. Antes do ajuste do pH, a solução de pdECM digerido pode ser armazenada a -20 °C por um mês. Antes do uso, descongele a amostra da solução congelada do pdECM em 4 °C durante a noite. A solução pdECM ajustada ao pH pode ser armazenada a 4 °C por até uma semana. A solução de pdECM digerido pode ser armazenada a 4 °C por pelo menos alguns dias, mas não deve exceder 1 semana.
<ol><li>Dime o pdECM liofilizado com pepsina.<ol>
<li>Para uma digestão eficaz do bioink, pulverize o pdECM lyophilized com nitrogênio líquido usando um almofariz e um pilão.</li>
		<li>Colete 200 mg do pó pdECM no tubo cônico de 50 mL e adicione 20 mg de peptina e 8,4 mL do ácido acético de 0,5 M (concentração final é de 2 w/v%).</li>
		<li>Coloque a barra de agitação magnética no tubo cônico de 50 mL e mexa em 300 rpm para 96 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste o pH da solução de pdECM digerido. NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, esse processo deve ser realizado no gelo.<ol>
<li>Filtrar as partículas não digeridas na solução pdECM usando um filtro de célula de 40 μm usando uma pipeta de deslocamento positivo no gelo para obter a digestão ideal das partes.</li>
		<li>Adicione 1 mL do PBS 10x e vórtice antes de usar NaOH.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7 com 10 M NaOH verificando o pH com tiras indicadoras de pH. NOTA: Vortex cada vez Que NaOH é adicionado de modo que o bioink seja misturado completamente com os outros reagents.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Análise reológica
<ol><li>Configuração experimental<ol>
<li>Prepare os 1,5% (w/v) de bioink pdECM para avaliar as propriedades reológicas.</li>
		<li>Estabeleça uma geometria da placa do cone de 20 milímetros (diâmetro do cone de 20 milímetros com um ângulo de 2°) na modalidade taxa-controlada de um rheometer.</li>
		<li>Criar sequências experimentais no software instalado (TRIOS) para medir a viscosidade, a cinética de gelação e o modulus dinâmico do bioink pdECM.<ol>
<li>Viscosidade: Coloque o bioink pdECM na placa. Medir viscosidade complexa (Pa·s) de bioink pdECM uma taxa crescente de cisalhamento de 1 para 1.000s-1 a uma temperatura constante de 15 °C.</li>
			<li>Cinética gelatação: Coloque o bioink pdECM na placa. Calcule o complexo modulus (G*) medindo o modulus do armazenamento e da perda do bioink do pdECM em 4-37 °C com uma taxa incremental do aumento de 5 °C/min (modalidade da tempo-varredura).</li>
			<li>Modulo dinâmico: Coloque o bioink pdECM na placa a 37 °C por 60 minutos antes da medição. Medir o modulus de armazenamento dependente da frequência (G') e o modulus de perda (G'') do bioink pdECM na faixa de 0,1-100 rad/s em 2% de tensão.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. impressão de células 3D de construções de tecidopanpático usando ilhota
<ol><li>Preparação de ilhotas isoladas<ol>
<li>Isolar ilhotas primárias de um rato de acordo com os protocolos descritos em um trabalho anterior5.</li>
		<li>Para separar detritos e células mortas da ilhota isolada, passe a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm. Ilhotas com um diâmetro inferior a 70 μm são consideradas mortas ou anormais.</li>
		<li>Suspenda as ilhotas isoladas no meio RPMI-1640 e coloque-as na placa de Petri. Remova ilhotas maiores que 300 μm de diâmetro usando uma pipeta de volume P200 o microscópio (lente objetiva 4x) no armário de biossegurança.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encapsulamento de ilhota em bioink pdECM<ol>
<li>Prepare bioink pdECM ajustado pH e ilhota isolada. NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, este processo deve ser realizado no gelo.</li>
		<li>Misture suavemente o bioink pdECM e a mídia suspensa com ilhotas (proporção 3:1) usando uma pipeta de deslocamento positivo até uniformemente misturada. NOTA: A concentração final do bioink pdECM é de 1,5% e a densidade celular no bioink pdECM é de 3.000 IEQ/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impressão de células 3D de construções de tecidopanpático<ol>
<li>Prepare uma seringa esterilizada e um bico de 22 G. NOTA: Este medidor foi selecionado para ilhotas de impressão com um diâmetro de 100-250 μm.</li>
		<li>Carregar ilhota-laden pdECM bioink na seringa.</li>
		<li>Imprima o bioink com a condição de impressão otimizada (taxa de alimentação: 150 mm/min; pressão pneumática: 15 kPa) a 18 °C em forma de treliça.</li>
		<li>Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa na incubadora por 30 min.</li>
		<li>Mergulhe a construção impressa na mídia de cultura ilhota, que é rpmi-1640 médio complementado com 10% fetal bovino soro (FBS), 100 U/ mL penicilina e 100 U/mL estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. impressão de células 3D de construção pancreática com estrutura padronizada
<ol><li>Preparação de dois tipos do bioink<ol>
<li>Para validar a versatilidade de impressão usando bioinks múltiplos, prepare dois conjuntos de bioinks pdECM e manche-os adicionando 0,4% da solução Trypan Blue e Rose Bengal em cada bioink pdECM em uma proporção de 1:20, respectivamente. NOTA: Para evitar a gelação antes do ajuste do pH, este processo deve ser conduzido no gelo.</li>
		<li>Misture suavemente o bioink pdECM e a mídia suspensa com ilhotas (proporção 3:1) usando uma pipeta de deslocamento positivo até uniformemente misturada. NOTA: A concentração final do bioink pdECM é de 1,5% e a densidade celular no bioink pdECM é de 3.000 IEQ/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Impressão de células 3D de construções de tecidopanptica baseadas em vários materiais<ol>
<li>Prepare seringas esterilizadas e um bico de 25 G.</li>
		<li>Carregue cada bioink (azul e vermelho) em duas seringas diferentes, respectivamente.</li>
		<li>Imprima o bioink com condição de impressão otimizada (taxa de alimentação: 150 mm/min; pressão pneumática: 15 kPa) a 18 °C em forma de treliça com linhas alternadas de azul e vermelho.</li>
		<li>Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa na incubadora por 30 min.</li>
		<li>Mergulhe a construção impressa na mídia de cultura de ilhotas, que é rpmi-1640 médio complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/ mL penicilina e 100 U/mL estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423 (6942), 876(2003).</li>
</ol>

Este protocolo descreveu o desenvolvimento de bioinks pdECM e a fabricação de construções de tecidopanpático 3D usando técnicas de impressão de células 3D. Para recapitular o microambiente do tecido alvo na construção de tecidos projetados em 3D, a escolha do bioink é fundamental. Em um estudo anterior, validamos que bioinks de dECM específicos do tecido são benéficos para promover a diferenciação de células-tronco e proliferação10. Em comparação com polímeros sintéticos, o dECM pode servir como u...

Recentemente, o transplante de ilhotas pancreáticas tem sido considerado um tratamento promissor para pacientes com diabetes tipo 1. A segurança relativa e a invasidão mínima do procedimento são grandes vantagens deste tratamento1. No entanto, tem várias limitações, como a baixa taxa de sucesso de ilhotas isolante e os efeitos colaterais das drogas imunossupressoras. Além disso, o número de ilhotas enxertadas diminui de forma constante após o transplante devido ao ambiente hostil2. Vários materiais biocompatíveis, como alginato, colágeno, poli (ácido láctico-coglicólico) (PLGA) ou polietilenoglicol (PEG) foram aplicados ao transplante de ilhotas pancreáticas para superar essas dificuldades.
A tecnologia de impressão de células 3D está surgindo em engenharia de tecidos devido ao seu grande potencial e alto desempenho. Escusado será dizer que os bioinks são conhecidos como componentes importantes para fornecer um microambiente adequado e permitir a melhoria dos processos celulares em construções de tecidos impressos. Um número substancial de hidrogéis de afinamento de tesoura, como fibrina, alginato e colágeno são amplamente utilizados como bioinks. No entanto, esses materiais mostram falta de complexidade estrutural, química, biológica e mecânica em comparação com a matriz extracelular (ECM) no tecido nativo3. Pistas microambientais, como as interações entre ilhotas e ECM são sinais importantes para melhorar a função das ilhotas. ECM descelularizado (dECM) pode recriar a composição específica do tecido de vários componentes de ECM, incluindo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e glicoproteínas. Por exemplo, ilhotas primárias que retêm seus ECMs periféricos (por exemplo, tipo I, III, IV, V e VI colágeno, laminina e fibronectina) exibem baixa apoptose e melhor sensibilidade à insulina, indicando assim que as interações de matriz celular específicas do tecido são importantes para melhorar sua capacidade de funcionar de forma semelhante ao tecido original4.
Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de biotilidade sacarcelulares descelularizadas (pdECM) derivadas de tecidos pancreáticos (pdECM) para fornecer sugestões microambientais benéficas para impulsionar a atividade e as funções das ilhotas pancreáticas, seguidas pelos processos de geração de construções de tecidos pancreáticos 3D usando uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusion (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Armários de Segurança Biológica</td><td>CRYSTE</td><td>PURICUBE 1200</td><td></td></tr><tr><td>Deep Freezer</td><td>Thermo Scientific Forma</td><td>957</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital digital</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>DH. </td><td></td>WSO04010</tr><tr><td>Forno seco</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WON-155</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>LABCONCO</td><td>7670540</td><td></td></tr><tr><td>Geladeira</td><td>SANSUNG</td><td>CRFD-1141</td><td></td></tr><tr><td>Ralador</td><td>ABM</td><td>1415605793</td><td></td></tr><tr><td>Microscópios invertidos</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>CRYSTE</td><td>PURISPIN 17R</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan GO</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>CF-5</td><td></td></tr><tr><td>Agitadores de placa multi-aquecimento</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SMHS-6</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>medidor de bancada de pH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>STARA2110</td><td></td></tr><tr>Misturador de vórtice <td>Rheometer</td><td>TA Instrument</td><td>Discovery HR-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>Cirurgical Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de operação</td><td>Hirose</td><td>HC.13-122</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>Coreia Ace Scientific</td><td>HC.203-30</td><td></td></tr><tr><td>Materiais </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>frasco de vidro de 10 ml</td><td>Scilab</td><td>SL. VI1243</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; filtro de célula m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Copo de 5 L</td><td>Dong Sung Science</td><td>SDS 2400</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cornical de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Copo de 500 mL</td><td>Korea Ace Scientific</td><td>KA.23-08</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de vácuo de 500 mL Corning</td><td></td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Recipiente de plástico de 500 mL</td><td>LOCK& LOCK</td><td>INL301</td><td></td></tr><tr><td>96well placa</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Folha de alumínio</td><td>DAEKYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barra magnética</td><td>Coréia Ace Scientific</td><td>BA.37110-0003</td><td></td></tr><tr><td>Almofariz e pilão</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>SC. MG100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetador multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>4982000314</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>SPL</td><td>10100</td><td></td></tr><tr><td>Tiras indicadoras de pH</td> Malha de filtro de peneira <td>1095350001</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td></td><td>DAIHAN Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decellularization</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x pbs</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.01</td><td></td></tr><tr><td>4.7% Ácido peracético</td><td>Omegafarm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>E0220 SAM</td><td></td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td></td>destilada</tr><tr><td>IPA</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>samchun I0348</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Biosesang</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio bioquímico</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1,9-Dimetil-Metileno Azul cloreto de zinco sal duplo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2018</td><td></td></tr><tr><td>Cloramina T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>857319</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de condroitina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4384</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>Supelco</td><td>46933</td><td></td></tr><tr><td>Cisteína-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Merok</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Na2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SAMCHUN CHEMICALS</td><td>S2097</td><td></td></tr><tr><td>Papaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p4762</td><td></td></tr><tr><td>P-DAB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2004</td><td></td></tr><tr><td>Ácido perclórico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5636</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Supelco</td><td>SX0607N</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio (monobásico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Bioink</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Charicterized FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7215</td><td></td></tr><tr><td>Rosa bengala</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198250</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 meio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>solução Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3d carregadas de células

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

O transplante de ilhotas pancreáticas é um tratamento promissor para pacientes que sofrem de diabetes tipo 1 acompanhado sofrem de hipoglicemia e complicações secundárias. No entanto, o transplante de ilhotas ainda tem várias limitações, como a baixa viabilidade das ilhotas transplantadas devido ao mau enxenxerto de ilhotas e ambientes hostis. Além disso, as células produtoras de insulina diferenciadas das células-tronco pluripotentes humanas têm capacidade limitada de secretar hormônios suficientes que podem regular o nível de glicose no sangue; Portanto, melhorar a maturação, cultivando células com pistas microambientais adequadas é fortemente necessária. Neste artigo, elucidamos protocolos para a preparação de um biotilétil de matriz extracelular descelular descelular (pdECM) derivado do tecido pancreático para fornecer um microambiente benéfico que pode aumentar a sensibilidade à glicose das ilhotas pancreáticas, seguida pela descrição os processos para a geração de tecidos pancreáticos 3D são construídos por meio de uma técnica de bioimpressão baseada em microextrusão.

Descelularização dos tecidos pancreáticos Desenvolvemos o processo de preparação de biotilidade pdECM para fornecer microambientes específicos de tecido pancreático para melhorar a funcionalidade das ilhotas em uma construção de tecido bioimpresso 3D (Figura 2A). Após o processo de descelularização, 97,3% do dsDNA foi removido e os componentes representativos da ECM, como colágeno e GAGs, permaneceram em 1278,1% e 96,9% em...

A matriz extracelular descelularizada (dECM) pode fornecer pistas microambientais adequadas para recapitular as funções inerentes dos tecidos-alvo em uma construção projetada. Este artigo elucida os protocolos para a descelularização do tecido pancreático, avaliação do bioink dECM derivado do tecido pancreático e geração de construções de tecidopanpático 3D usando uma técnica de bioimpressão.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

o bioink pdECM pode fornecer um microambiente benéfico para ilhotas pancreáticas usando componentes e arquitetura específicos do tecido e tem propriedades neurológicas ideais que reduzem as mortes celulares e aumentam sua impressão. A principal vantagem dessa técnica é que a composição específica do tecido pode ser preservada dentro do bioink pdECM promovendo um crosstalk construtivo entre construções de tecido pancreático 3D e ilhotas encapsuladas. O desenvolvimento do encapsulamento de ilhotas no bioink pdECM pode ser aplicado à fabricação de construções transplantáveis de tecido pancreático para o tratamento de diabetes tipo um.Este bioink pode ser usado para ampliar a aplicação de construtos transplantáveis, bem como modelos de tecido in vitro para diabetes, complicações relacionadas ao diabetes e câncer de pâncreas. Para a descelularização de uma amostra de tecido de pâncreas suíno congelado, use um ralador para cortar o pâncreas congelado em pedaços de um milímetro de espessura e transfira 50 gramas do tecido fatiado em um recipiente plástico de 500 mililitros. Lave o tecido com 300 mililitros de água destilada a quatro graus Celsius em um agitador orbital digital a 150 rotações por minuto por aproximadamente 12 horas.Quando a água turva desaparecer, substitua a água por 400 mililitros de 1%Triton-X 100 na PBS por 84 horas. No final do tratamento do detergente, incubar o tecido com 400 mililitros de isopropanol por duas horas para remover a gordura restante do pâncreas, seguido por uma lavagem de 24 horas em 400 mililitros de PBS. No final da lavagem, esterilize o tecido descelularizado com 400 mililitros de ácido peracético de 0,1% em 4% de etanol por duas horas antes de lavar a amostra com 400 mililitros de PBS fresco por seis horas para remover qualquer detergente residual.No final da lavagem, use fórceps para transferir os pedaços de tecido em um tubo cônico de 50 mililitros e recongelar a amostra a menos 80 graus Celsius por uma hora. Em seguida, cubra o tubo cônico com um lenço sem fiapos fixado com um elástico e liofilize o tecido descelularizado a menos 50 graus Celsius por quatro dias. Para preparar o bioink, transfira 200 miligramas de pdECM seco congelado para um novo tubo cônico de 50 mililitros e adicione 20 miligramas de pepsina e 8,4 mililitros de ácido acético molar de 0,5 para a amostra de tecido.Em seguida, coloque uma barra de agitação magnética no tubo para uma incubação de 96 horas de agitação a 300 rotações por minuto. No final da incubação, use um coador de células de 40 micrômetros e uma pipeta de deslocamento positiva para filtrar a solução em um novo tubo no gelo para filtrar quaisquer partículas não digeridas e adicionar um mililitro de 10X PBS ao tubo. Após o vórtice, use hidróxido de sódio para ajustar o pH da solução para sete.Para preparar o bioink para a impressão de células 3D de uma construção pancreática com uma estrutura padronizada, colora uma alíquota de bioink pdECM com 0,4%Trypan Blue e uma alíquota com Rose Bengal Solution em uma proporção de um a 20. Em seguida, use uma pipeta de deslocamento positiva para misturar suavemente cada solução de bioink com uma solução de ilhota suspensa média em uma proporção de três para um para uma concentração final de 1,5% bioink e uma densidade celular de três vezes 10 para o equivalente de três ilhotas por mililitro. Para a impressão celular 3D de construções de tecido pancreático de base multimaterial, carregue cada mistura de ilhotas de bioink em seringas esterilizadas individuais equipadas com bicos de 25 bitolas e imprimam 3D cada bioink em condições otimizadas de impressão a 18 graus Celsius na forma de uma rede com linhas alternadas de azul e vermelho.Para cruzar o bioink, coloque a construção impressa em uma incubadora de cultura celular de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Em seguida, mergulhe a construção impressa em RPMI 1640 médio suplementado com soro bovino 10% fetal e 100 unidades por mililitro de penicilina e estreptomicina. Após o processo de descelularização, 97,3% do DNA de dupla garuda é removido e os componentes da matriz extracelular representativa, como colágeno e glicosaminoglicanos permanecem em 1278,1% e 96,9% em comparação com o tecido pancreático nativo, respectivamente.Nesta análise representativa, o bioink pdECM apresentou um comportamento de afinamento de tesoura com um valor de aproximadamente 10 pascals por segundo na taxa de tesoura de um por segundo indicando que o bioink demonstrou as características reológicas apropriadas para extrusão através de um bocal. Além disso, o módulo complexo do bioink começou a aumentar quando a temperatura atingiu 15 graus Celsius e rapidamente aumentou quando a temperatura foi mantida a 37 graus Celsius indicando a transição sol-gel da solução. O dinâmico G prime e G duplo prime do bioink pdECM foram investigados a temperaturas fisiologicamente relevantes para garantir sua estabilidade após o processo de impressão resultando na obtenção de um módulo estável sob a condição de varredura de frequência.Usando um sistema de impressão multifacetado, vários tipos de construções 3D poderiam então ser fabricados como demonstrado usando o pdECM desenvolvido demonstrando a versatilidade do pdECM com o propósito de bioimpressão 3D para harmonizar dois ou mais tipos de tecidos vivos em um arranjo semelhante a tecido. Seja gentil ao misturar o bioink com as células para evitar a morte celular e a formação de bolhas, pois a presença de bolhas reduz a resolução de impressão e reduz a viabilidade celular. A funcionalidade das ilhotas pancreáticas encapsuladas dentro das construções de tecido pancreático 3D pode ser avaliada por coloração de imunofluorescência ou um teste de tolerância à glicose.Esta técnica de bioink pdECM e bioimpressora 3D pode potencialmente ser usada para o desenvolvimento de construções funcionais de tecido pancreático no campo da engenharia de tecidos. Os pesquisadores devem usar os equipamentos de proteção individual adequados para evitar lesões ao manusear o ralador afiado e os reagentes.

pancreatic-tissue-derived-extracellular-matrix-bioink-for-printing-3d

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Uma bioimpressora cartesiana foi projetada e fabricada para permitir a deposição de vários materiais em geometrias precisas e reprodutíveis, ao mesmo tempo em que permite o controle de fatores ambientais. Utilizando a bioimpressora tridimensional, construções complexas e viáveis podem ser impressas e facilmente reproduzidas.

Viabilidade de Bioprinted celulares Construções Usando uma impressora cartesiano Dispenser Três

Nós descrevemos um conjunto de protocolos que, juntos, oferecem uma bioink hidrogel que imita o tecido com o qual construções de tecido 3-D funcionais e viáveis ​​podem ser bioprinted para uso em aplicações in vitro de rastreio.

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Aqui, um método é descrito para a preparação de co-cultura 3-dimensional (3D) esferoide de células de câncer no pâncreas e fibroblastos, seguidos por medição das funções metabólicas, usando um analisador de fluxo extracelular.

Preparação e ensaio metabólico de 3-dimensional Spheroid co culturas de células de câncer no pâncreas e fibroblastos

Análogos de cartilagem e pele foram bioprinted usando um bioink de nanocellulose-alginato com base. Os bioinks era compartimentados antes da impressão através de uma unidade de mistura passiva de passo único. As construções foram demonstradas para ser uniformemente compartimentado, têm alta viabilidade e exibem favoráveis marcadores de diferenciação.

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar insulina expressando 3D pancreatoids murino de progenitores pancreático flutuantes e10.5 dissociada e a mesênquima associada.

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.

Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula

Este protocolo descreve a produção de filamento policaprolactona (PCL) com microesferas de (PLA) de ácido polilático incorporado que contêm matrizes decellularized (DM) para impressão 3D estruturais de engenharia de tecidos construções.

Novo processo de impressão 3D Decellularized matrizes

Apresentado aqui é um simples de usar, Core/Shell, tridimensional bioprinting set-up para uma etapa de fabricação de andaimes ocas, adequado para a engenharia de tecidos vasculares e outras estruturas tubulares.

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Este protocolo destaca um método para avaliar rapidamente a biocompatibilidade de uma nanocelulose cristalina (CNC)/agarose tinta biomaterial de hidrogel composto com células de mastro derivadas da medula óssea em termos de viabilidade celular e expressão fenotípica dos receptores de superfície celular, Kit (CD117) e receptor IgE de alta afinidade (FcεRI).

Fabricação de uma nanocelulose cristalina incorporada tinta biomaterial agarose para cultura de célula de mastro derivada da medula óssea

Este estudo apresenta um novo banho de suspensão de submicrogel de κ-carragenina, exibindo notáveis propriedades reversíveis de transição de interferência-desobstrução. Esses atributos contribuem para a construção de tecidos e órgãos biomiméticos em bioimpressão 3D embarcada. A impressão bem-sucedida de tecidos semelhantes ao coração/esôfago com alta resolução e crescimento celular demonstra aplicações de bioimpressão e engenharia de tecidos de alta qualidade.

Bioimpressão Incorporada de Estruturas Semelhantes a Tecidos Usando Meio Submicrogel κ-Carragenana

Aprenda a criar bioink pdECM a partir de tecido pancreático porcino para bioimpressão 3D de construtos com ilhotas encapsuladas. Este método preserva a composição tecido-específica e melhora a viabilidade celular para tratamento do diabetes tipo 1.

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células (Vídeo) | JoVE Journal

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

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