Name: Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Aprenda a usar co-cultura Transwell para estudar sinalização paracrina tumoral e seus efeitos imunossupressores em macrófagos. Este método permite analisar fatores secretados sem contato direto celular, facilitando investigações sobre evasão imune do câncer.

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Eric Ubil foi financiado, em parte, pela American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). O trabalho foi apoiado por uma doação do NIH (R01-CA205398) e de um prêmio da Breast Cancer Research Foundation (BCRF-18-041) ao HSE.

Todos os procedimentos relacionados à colheita e uso de macrófagos peritoneal murine foram realizados na Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill (UNC) e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da UNC (IACUC).
1. Cultura do macrófago
NOTA: Este procedimento pode utilizar macrófagos peritoneal primários (descritos em detalhes abaixo), macrófagos derivados de medula óssea ou linhas celulares de macrófagos, como J774 (ATCC) ou RAW264 (ATCC).
<ol><li>Macrófagos peritoneal da colheita como descrito previamente16,17 e placa diretamente na câmara superior (s) de uma membrana do poliéster de 0.4 μm inserem a co-cultura 6 placa de poço(figura 1A). NOTA: O rendimento aproximado dos macrófagos de cada isolamento é de 1 x 106 células no total, de modo que o número médio de células por poço é de ~1,5-1,6 x 105 células em uma placa de 6 poços.</li>
	<li>Cultura os macrófagos colhidos no Modificado Méxio águia de Dulbecco (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x penicilina/estreptomicina, 20 ng/mL macrophage colony stimulating factor (M-CSF) por 3 dias a 37 °C, 5% CO2. NOTA: A câmara superior contém 1 mL de meio de cultura, enquanto a câmara inferior é preenchido com 1,5 mL. O meio deve ser adicionado a cada câmara.</li>
</ol>2. Cocultura de células tumorais com macrófagos
<ol><li>Antes do uso, as pilhas comercialmente disponíveis do tumor da cultura em seus métodos médios respectivos da cultura do tecido DO ATCC-recomendado.</li>
	<li>Lave células tumorais aderentes uma vez com soro soro lógico amortecida de fosfato (PBS), adicione 0,05% de trippsina + ácido etilediatriáptico (EDTA) e incubada a 37 °C até que as células se seseparem. Resuspenda as células em FBS contendo médio, quantidade o número total de células usando um hemocytometer ou contador de células, e depois centrífuga por 5 min em 220 x g para pelota.</li>
	<li>Durante a centrífugação, aspirar o meio das câmaras superior e inferior das placas de suporte permeáveis contendo macrófagos de membrana e substituir por meio fresco.<ol>
<li>Para câmaras inferiores, onde as células tumorais serão banhadas, preencha com 1 mL de médio em vez de 1,5 mL para permitir o volume suficiente para adição celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspiruais médios de células tumorais pelleted e células resuspendem no DMEM/F12 com 10% FBS, 1x penicilina/estreptomicina e 20 ng/mL M-CSF a uma concentração de 3 x 105 células/mL.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de 3 x 105 células/mL células tumorais para a câmara inferior dos poços desejados (Figura 1B). NOTA: As células podem ser tratadas imediatamente.</li>
</ol>3. Tratamento de células co-cultivadas
<ol><li>Para induzir a expressão genética pró-inflamatória do macrófago, trate macrófagos com singly ou co-cultivadas adicionando 100 ng/mL IFNγ e 50 NG/mL LPS.<ol>
<li>Variar a duração dos tempos de tratamento na cultura, conforme necessário. A ativação do macrófago ocorre dentro de 2 h e alguma supressão tumor-mediada ocorre por 8 h. Co-culture para 24 h rende a supressão tumor-derivada robusta e consistente. NOTA: Alternativamente, macrófagos podem ser induzidos a adotar um fenótipo de cura pró-ferida através da adição de fatores como interleucina-10 (IL10), e o efeito do ligand tumoralmente-secretado avaliado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Como um controle negativo, macrófagos cultura singly e deixar sem tratamento. Como um controle positivo, trate macrófagos singly cultivados com 100 ng/mL IFNγ e 50 ng/mL LPS.</li>
</ol>4. Análise a jusante de células co-cultivadas
<ol><li>Após o tempo de incubação desejado ter decorrido, isolar o lysate celular ou o meio de cultura condicionada, conforme desejado, dependendo das necessidades de teste.</li>
	<li>Para isolar o lysate celular para análise quantitativa de reação em cadeia de polimerase (qPCR), assaa a mídia de ambas as câmaras do poço e lave uma vez com 2 mL de PBS. Aplique o amortecedor da lyse do RNA à câmara superior que contem os macrófagos. Raspe delicadamente a membrana para liberar a lysate da pilha, e transfira a um tubo da coleção para processar mais de acordo com o protocolo do fabricante do fabricante do jogo da isolação do RNA.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engagement+of+the+PD-1+immunoinhibitory+receptor+by+a+novel+B7+family+member+leads+to+negative+regulation+of+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).</li>
<li>Agata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+PD-1+antigen+on+the+surface+of+stimulated+mouse+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes.</a> International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).</li>
<li>Dong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+B7-H1+promotes+T-cell+apoptosis%3A+a+potential+mechanism+of+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion.</a> Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).</li>
<li>Sznol, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonist+antibodies+to+PD-1+and+B7-H1+%28PD-L1%29+in+the+treatment+of+advanced+human+cancer--response%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response.</a> Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542(2013).</li>
<li>Kortylewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+IL-23+and+IL-12+balance+by+Stat3+signaling+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).</li>
<li>Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+interleukin-10+inhibits+type+1+immune+responses+directed+at+a+tumor+antigen+as+well+as+a+non-tumor+antigen+present+at+the+tumor+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site.</a> Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+innate+and+adaptive+immune+responses+by+Stat-3+signaling+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells.</a> Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).</li>
<li>Mazzoni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+suppressor+lines+inhibit+T+cell+responses+by+an+NO-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism.</a> The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).</li>
<li>Zea, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginase-producing+myeloid+suppressor+cells+in+renal+cell+carcinoma+patients%3A+a+mechanism+of+tumor+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion.</a> Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).</li>
<li>Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+macrophage+content+in+human+breast+cancer+is+not+associated+with+favourable+prognostic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors.</a> British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).</li>
<li>Evans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T-+and+B+lymphocyte+responses+to+mitogens+by+tumor-associated+macrophages%3A+the+dependency+on+the+stage+of+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth.</a> Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).</li>
<li>Noy, R., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+macrophages%3A+from+mechanisms+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy.</a> Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-educated+macrophages+promote+tumour+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54356(2016).</li>
<li>Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Proximal+Culture+Method+to+Study+Paracrine+Signaling+Between+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58144(2018).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-secreted+Pros1+inhibits+macrophage+M1+polarization+to+reduce+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).</li>
<li>Ray, A., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+peritoneal+cavity+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse peritoneal cavity cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (35), e1488(2010).</li>
<li>Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+proinflammatory+and+chemokine+genes+by+lipopolysaccharide+and+paclitaxel+%28Taxol%29+in+murine+and+human+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines.</a> Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O ensaio co-cultural apresentado aqui é uma modificação de ensaios previamente estabelecidos que permite o estudo de fatores tumorados na ativação de células imunes. Enquanto o contato célula-célula é conhecido por induzir alterações na atividade imunológica, a capacidade de ligantes tumorais para modular a ativação imunológica é menos bem compreendida. Descrevemos um método que, ao contrário da cocultura direta, pode ser usado para interrogar como fatores secretos derivados do tumor afetam a ativação de células imunes s...

Estudos recentes têm se concentrado na capacidade das células cancerosas para evitar a detecção por células imunes, suprimir a ativação imunológica local, ou para produzir um ambiente tolerogênico tumor-permissivo no microambiente tumoral. Duas classes largas de interações do tumor e da pilha imune foram descritas que facilitam estes efeitos: interações contato-mediadas ou ligands tumor-secretados. Um dos mecanismos mais bem estudados e clinicamente tratável de inibição imunológica mediada por contato utilizada por tumores é a expressão de PD-L1, que interage com PD-1 em células T para inibir sua ativação e função1,2. Em resposta ao interferon-gama (IFNγ), que é expressa por um número de células imunes ativadas, as células tumorais podem aumentar a expressão de PD-L1 para induzir a exaustão de células T ativadas por PD-1, impedindo-as de erradicar efetivamente as células tumorais3. O uso de anticorpos para bloquear a interação entre PD-L1 e PD-1 é usado atualmente para tratar vários tipos de câncer em seres humanos4. À luz desse sucesso clínico e de outros, a identificação e a segmentação de mecanismos imunossupressores derivados do tumor tem recebido cada vez mais atenção.
Além da supressão da imunidade adaptativa, os tumores também são conhecidos por secretar fatores que suprimem as respostas pró-inflamatórias das células imunes inatas. Secreções induzidas por tumores ou induzidas por tumor, incluindo IL-6, IL-10, VEGF, IL-23 e fator estimulante da colônia (CSF-1), têm sido mostrados para inibir as respostas antitumorais de células assassinas naturais (NK), gringócitos e células dendríticas no microambiente tumoral5,6,7. As células tumorais também podem secretar fatores que distorcem o recrutamento e diferenciação de células derivadas de mieloide no microambiente tumoral para promover a supressão da ativação de células T8,9.
Um tipo de célula imune inata que tem um efeito profundo sobre a progressão do tumor é o macrófago. Por muitos anos, a presença de macrófagos associados ao tumor (TAMs) tem sido usada como prognóstico negativo da sobrevida do paciente10. O conceito de que os TAMs imunossupressores amortecem a liberação de tumores mediada por células imunes foi introduzido há mais de 40 anos há11. Mais recentemente, tem sido demonstrado que o macrófago resposta pró-inflamatória pode ser desregulada, enquanto um fenótipo pró-tumor pode ser induzido no microambiente tumoral. Estes macrófagos imunossupressores podem contribuir para uma resposta tolerogênica, impulsionando a progressão do tumor e resistência à quimioterapia e imunoterapia12. Dado que os macrófagos são muitas vezes um dos leukócitos mais abundantes com o tumor, a restauração de sua atividade imunológica específica do tumor representa um alvo potencial para a terapêutica anticâncer13.
Embora as interações mediadas pelo contato entre células tumorais e macrófagos possam ser modeladas por meio da cocultura direta, o uso de suportes permeáveis da membrana pode elucidar quais fatores secretados por tumor são imunomodulatórios sem a influência potencialmente confusa do contato celular-imune ao tumor. Usando métodos um pouco semelhantes, outros demonstraram o potencial de identificar fatores secretos em interações microglia / neuronal14, bem como células tumorais com células mesoteliais15. Também usamos com sucesso essa técnica de cocultura para caracterizar o papel de uma proteína secretada por tumor, Pros1, como supressora da expressão gênica pró-inflamatória após a estimulação dos macrófagos peritoneal com LPS e interferon-gama16. Aqui descrevemos uma metodologia direta que pode ser usada para interrogar como fatores secretados por tumor podem afetar a ativação do macrófago.

<table><tbody><tr><td>B16-F10</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>kit de síntese de cDNA</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12 mídia</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Soro Bovino Fetal</td><td>Millipore</td><td>TMS-013-B</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-67</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos de Escherichia coli O111: B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5293-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Murine M-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-439</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pros1 ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS2886720</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Recombinante Mouse IFN&gamma;</td><td>BioLegend</td><td>575302</td><td></td></tr><tr><td>Sensimix SYBR Low-ROX kit</td><td>Bioline</td><td>QT625-05</td><td></td></tr><tr><td>Transwell permeável suporta</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific- Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

A sinalização paracrina derivada do tumor é um componente negligenciado da imunossupressão local e pode levar a um ambiente permissivo para o crescimento contínuo do câncer e metástase. Sinais paracrinos podem envolver contato célula-célula entre diferentes tipos de células, como PD-L1 expressa na superfície de tumores interagindo diretamente com PD-1 na superfície das células T, ou a secreção de ligantes por uma célula tumoral para afetar uma célula imune. Aqui descrevemos um método de co-cultura para interrogar os efeitos dos ligantes tumorais na ativação de células imunes (macrófago). Este procedimento direto utiliza suportes permeáveis de membrana de policarbonato de 0,4 μm disponíveis comercialmente e placas padrão de cultura de tecido. No processo descrito, os macrófagos são cultivados na câmara superior e as células tumorais na câmara inferior. A presença da barreira de 0,4 μm permite o estudo da sinalização intercelular sem a variável de confusão do contato físico, pois os dois tipos de células compartilham o mesmo meio e exposição a ligantes paracrinos. Essa abordagem pode ser combinada com outras, como alterações genéticas do macrófago (por exemplo, isolamento de camundongos knock-out genéticos) ou tumor (por exemplo, alterações mediadas pela CRISPR) para estudar o papel de fatores e receptores secretos específicos. A abordagem também se presta a análises biológicas moleculares padrão, como a reação em cadeia de transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR) ou a análise de borrões ocidentais, sem a necessidade de triagem de fluxo para separar as duas populações celulares. Os ensaios imunosorventes ligados a enzimas (ELISAs) podem ser utilizados da mesma forma para medir ligantes secretados para entender melhor a interação dinâmica da sinalização celular no contexto do tipo de célula múltipla. A duração da cocultura também pode ser variada para o estudo de eventos temporalmente regulamentados. Este método de co-cultura é uma ferramenta robusta que facilita o estudo de sinais tumorais no contexto imunológico.

Para determinar o efeito dos ligands tumor-secretados na polarização do macrófago, o procedimento descrito foi utilizado. Macrófagos peritoneal cultivados na ausência de células tumorais foram utilizados como negativos (não tratados = extrema esquerda) e positivo (IFNγ e LPS estimulados = 2nd da esquerda) controles (Figura 2A). Alternativamente, os macrófagos peritoneal foram co-cultivados com células tumorais de melanoma B16F10 (ATCC) (Figura 1A). Im...

Aqui, apresentamos um método usando suportes de membrana permeáveis para facilitar o estudo da sinalização paracrina sem contato usada pelas células tumorais para suprimir a resposta imune. O sistema é passível de estudar o papel dos fatores tumorados no amortecimento da ativação do macrófago.

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Este método de co-cultura Transwell é usado para estudar sinalização paracrina usada por células tumorais para suprimir a resposta imune. Este método pode ser usado para descobrir novos ligantes secretados, bem como os fundamentos mecanicistas de seus efeitos supressivos imunológicos. Já usamos esse método para mostrar como fatores secretados pelo tumor podem amortecer a transcrição genética pró-inflamatória do macrófago.Acreditamos que esta ferramenta tem amplas implicações no estudo da supressão imunológica derivada do tumor. Uma das principais vantagens dessa técnica é que ela pode ser usada para estudar a sinalização paracrina entre células tumorais e células imunes sem a variável potencialmente confusa do contato célula-celular. Esta plataforma também é favorável a uma variedade de técnicas biológicas moleculares para análise a jusante.Após a colheita de macrófagos peritoneais, emplaque-os diretamente nas câmaras superiores de uma membrana de poliéster de 0,4 micrômetros insira co-cultura de seis poços. Em seguida, adicionou DMEM suplementado ao poço de tal forma que a câmara superior contém um mililitro e a câmara inferior contém 1,5 mililitros. Incubar por três dias a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Em primeiro lugar, a cultura comercialmente disponível células tumorais em seu respectivo meio, seguindo os métodos recomendados pela ATCC de cultura tecidual. Em seguida, lave as células tumorais aderentes uma vez com PBS. Adicione 0,05% de trippsina em EDTA e incubar a 37 graus Celsius até que as células se desprendem.Em seguida, suspenda novamente as células em mídia contendo FBS. Use um hemótmetro ou contador celular para quantificar o número total de células e centrífugas a 220 vezes G durante cinco minutos para a pelota. Durante a centrifugação, aspire o meio das câmaras superior e inferior do macrófago contendo placas de suporte de membrana permeável e substitua por meio fresco.Para as câmaras inferiores onde as células tumorais serão banhadas, preencha com um mililitro de médio em vez de 1,5 mililitros para deixar volume suficiente para adição celular. Quando a centrifugação estiver completa, aspire o meio das células tumorais pelleted e suspenda as células em DMEM suplementado a uma concentração de 300.000 células por mililitro. Adicione 0,5 mililitros desta suspensão celular à câmara inferior dos poços desejados.Para induzir a expressão genética pro-inflamatória macrófago, trate macrófagos singly ou co-cultivados adicionando gamma interferon em uma concentração de 100 nanogramas por mililitro e LPS a uma concentração de 50 nanogramas por mililitro. Varie a duração dos tempos de tratamento na cultura conforme necessário. A ativação do macrófago ocorre dentro de duas horas, e alguma supressão mediada por tumores ocorre em oito horas.A co-cultura por 24 horas produz supressão robusta e consistente derivada do tumor. Como um controle negativo, macrófagos culturais cantam e saem sem tratamento. Como um controle positivo, trate macrófagos singly-cultivados com interferon gama e LPS nas mesmas concentrações utilizadas para as amostras.Após o tempo de incubação desejado ter transcorrido, isole o meio de cultura de lise celular ou condição conforme desejado, dependendo das necessidades de teste. Para isolar o lisecelular para análise quantitativa da reação em cadeia de polimerase, aspire o meio de ambas as câmaras do poço e lave uma vez com dois mililitros de PBS. Aplique tampão de RNA lysis na câmara superior contendo os macrófagos.Depois disso, raspe suavemente a membrana para liberar o lisete celular e transfira-a para um tubo de coleta para processamento posterior de acordo com o protocolo do fabricante do kit de isolamento RNA. O método de cocultura descrito aqui envolve a cultura de macrófagos e células tumorais sem contato físico. Macrófagos peritoneais cultivados na ausência de células tumorais são usados como controles negativos e positivos.Macrófagos peritoneais co-cultivados na presença de células tumorais B16F10, mas sem estímulos ativados, não aumentam a expressão de genes associados pró-inflamatórios. Isso implica que os ligantes secretados por tumores ou não são suficientes para induzir a expressão genética pró-inflamatória por si só, ou se houver ativação imune por secreções tumorais, ligantes paracrinos são suficientes para suprimi-lo aos seus níveis nativos. Este método de cocultura ilustra que quando macrófagos polarizados por interferon gama e LPS são cultivados na presença de células tumorais, a supressão da expressão genética associada à inflamação foi reduzida em até 60% Um nível comparável de supressão genética pro-inflamatória do macrófago é observado quando a linha de células macrófagos de murina J774 é substituída por macrófagos peritoneais.Trabalhos anteriores identificaram a proteína S como um fator secreto pelo tumor que pode inibir a ativação do macrófago, de modo que o modelo de co-cultura de suporte de membrana permeável é usado em conjunto com um lysA para avaliar a concentração de proteína S em mídia condicionada após 24 horas. Em mídia condicionada de células de melanoma B16F10 tratadas com interferon e LPS, a proteína S é expressa em uma concentração de aproximadamente 475 nanogramas por mililitro. Macrófagos peritoneais tratados nas mesmas condições expressavam proteína S a aproximadamente 61 nanogramas por mililitro.Curiosamente, quando co-cultivada, a concentração de proteína S na gama interferon e no poço tratado por LPS foi de aproximadamente 86 nanogramas por mililitro. Isso sugere que os macrófagos ingerem proteína s secretada por tumor ou que a quantidade de proteína S secretada pelas células B16F10 é substancialmente diminuída quando na presença de macrófagos. Esses resultados destacam mudanças profundas da ativação do macrófago e da sinalização paracrina quando os macrófagos são co-cultivados com células tumorais.O método de co-cultura transwell pode responder a uma variedade de perguntas relativas à sinalização paracrina. A análise de manchas ocidentais poderia ser conduzida para determinar como proteínas secretadas por tumores alteram várias vias de sinalização em macrófagos.

studying-effects-tumor-secreted-paracrine-ligands-on-macrophage

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra um ensaio para estudar a regulação de células-tronco mesenquimais (MSC) da fagocitose de macrófagos em uma cocultura. Após a co-cultura de MSC com macrófagos, partículas de zimosana não opsonizadas conjugadas a um fluoróforo sensível ao pH são adicionadas para serem fagocitadas pelos macrófagos. Com o aumento da fagocitose, a intensidade da fluorescência aumenta, permitindo a determinação da regulação da atividade fagocítica mediada por CTM.

Um ensaio para estudar a regulação da fagocitose de macrófagos por células-tronco mesenquimais

Aqui apresentamos um protocolo de co-cultura em três dimensões, que é útil para investigar interações multicelulares e modulação dependente de matriz extracelular do comportamento das células cancerígenas. Neste modelo experimental, as células cancerígenas são cultivadas em géis de colágeno incorporados com fibroblastos associados ao câncer humano.

Tridimensional modelo de co-cultura para Interaction Tumor estromal-

Compreender o comportamento maligno do câncer requer a criação de modelos precisos de como as células tumorais interagem com componentes do microambiente tumoral, como macrófagos. Aqui descrevemos dois métodos para estudar a interação das células de glioblastoma com macrófagos associados a tumores e micróglia, onde o efeito na invasão do glioblastoma é avaliado.

Co-cultura Ensaios para estudar macrófagos e Microglia Estimulação do Glioblastoma Invasion

Adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável para mimetizar o microambiente tumoral (TME). O modelo consiste em uma cultura de células mistas, permite a geração simplificada de populações de células individuais altamente enriquecidas sem o uso de marcação fluorescente ou classificação de células e permite estudar a comunicação intercelular dentro do TME em condições normais ou de estresse.

A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Aqui, descrevemos um método de cultura tridimensional para analisar a morfologia da mama primário de células de câncer, também como para estudar suas interações direta/indireta com os monócitos e os resultados tais como a degradação do colagénio, recrutamento de células imunes, célula invasão e promoção de inflamação relacionadas ao câncer.

Analisando a comunicação entre monócitos e células de câncer primário da mama em uma matriz Extracellular extrair (ECME)-sistema tridimensional baseado em

Parácrina e justácrina interacções celulares desempenham um papel importante em muitos processos biológicos, incluindo a progressão do tumor, respostas imunes, angiogênese e desenvolvimento. Aqui, um método de cultura proximal é usado para estudar a sinalização parácrina onde as concentrações localizadas dos fatores secretados são mantidas, evitando o contato direto do celular.

Um método de cultura Proximal para estudar a parácrina sinalização entre as células

Este artigo representa um ensaio in vitro útil para avaliar a capacidade do meio condicionado das células tumorais para atrair macrófagos.

Ensaio in vitro para estudo do tumor-interação macrófago

A atividade fagocítica do macrófago contra as células cancerosas, especificamente as células carcinomas mamárias do camundongo 4T1, foi imagemda neste estudo. O modelo de cocultura de células vivas foi estabelecido e observado por meio de uma combinação de microscopia de contraste de interferência fluorescente e diferencial. Esta avaliação foi imagemdo usando o software de imagem para desenvolver multiponto de vídeo time-lapse.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a interação de macrófagos primários derivados de monócitos humanos com um esferóide tumoral em uma matriz tridimensional (3D) de colágeno I, com a possibilidade de comparar o impacto das propriedades solúveis e físicas do microambiente na invasão celular.

Um ensaio de co-invasão de esferoides macrófagos-tumores

Dados os modelos limitados de xenoenxerto disponíveis para estudar as interações entre CART humano e células mieloides, estabelecemos modelos in vitro e in vivo para entender os impactos dos macrófagos humanos nas células CART. Os resultados podem ser potencialmente generalizados para avaliar os papéis dos macrófagos no microambiente tumoral e testar imunoterapias direcionadas a macrófagos.

Estudando interações entre células mieloides e células T CAR in vitro e in vivo

Aprenda a usar co-cultura Transwell para estudar sinalização paracrina tumoral e seus efeitos imunossupressores em macrófagos. Este método permite analisar fatores secretados sem contato direto celular, facilitando investigações sobre evasão imune do câncer.

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana (Vídeo) | JoVE Journal

Estudando os efeitos dos ligantes paracrinos tumorais na ativação do macrófago usando a co-cultura com suportes permeáveis da membrana

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