Name: Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a monitorar a dinâmica da sinalização Notch em células-tronco neurais murinas usando imagens de bioluminescência em tempo real. Esta técnica permite visualizar mudanças rápidas na expressão gênica com alta precisão in vitro e in vivo.

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Agradecemos Yumiko Iwamoto para apoiar a produção do vídeo. Também somos gratos a Akihiro Isomura pela discussão e apoio à análise de imagem, Hitoshi Miyachi por suportetécnico para a geração de animais transgênicos, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Masatoshi Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) e Ouin Kunitaki (Andor Japan) para o suporte técnico e discussões sobre o sistema de imagem de bioluminescência. Este trabalho foi apoiado pela Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (MEXT 24116705 for H.S. and MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (JSPS) 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. e H.S.) e Platform for Dynamic Approaches to Living System do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, Japão.

Todo o procedimento, incluindo indivíduos animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee no instituto de Frontier Life and Medical Sciences, Universidade de Kyoto.
1. Repórteres de bioluminescência
NOTA: O repórter luciferase é adequado para medir a dinâmica rápida da atividade promotora, fundindo o sinal de degradação. Além disso, o repórter de fusão luciferase permite o monitoramento da dinâmica proteica na única célula. Ambos os tipos de repórteres estão disponíveis para a cultura mono-camada (cultura da dissociação) e a cultura do tecido (cultura da fatia) experiência.
<ol><li>Repórter para o monitoramento dll1 promotor atividade17 NOTA: Para monitorar as rápidas mudanças na expressão gênica, a resposta rápida e repórter instável é essencial. Firefly luciferase (Fluc) mostra maturação rápida em comparação com os repórteres de fluoresceina. Como a ubiquitina fundiu o repórter luciferase (Ub-Fluc) mostra rápida degradação e rotatividade rápida, é muito útil monitorar a expressão gênica dinâmica nas células vivas20.<ol>
<li>Use Dll1 promotor-driven desestabilizado luciferase repórter, luciferase ubiquitinated (pDll1-Ub-Fluc, Figura 1Um painel superior), para monitorar as rápidas mudanças na expressão Dll1 em um nível transcricional17.</li>
		<li>Gerar uma linha de mouse transgênico carregando pDll1-Ub-Fluc para a expressão estável deste repórter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repórter para o monitoramento dll1 dinâmica da proteína17.<ol>
<li>Para a geração de camundongos knock-in, insira o cDNA luciferase no 3'termini da região codificadora Dll1 para que a proteína de fusão Dll1-luciferase seja expressa (repórter Dll1-Fluc, Figura 1A,painel inferior)17.</li>
		<li>Monitorar a dinâmica de expressão do Dll1 em níveis de proteína, medindo a atividade luciferase.</li>
		<li>Para monitorar a dinâmica da proteína Dll1 nos níveis dos tecidos, introduza o repórter Dll1-Fluc em NPCs na telencefalon embrionária por na eletroporação do útero.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Sistema de imagem de bioluminescência
<ol><li>Construa um sistema de imagem ao vivo de bioluminescência usando um microscópio invertido instalado com uma câmera CCD altamente sensibilidade e refrigerada a água. A fim de reduzir o ruído e obter alta sensibilidade, arrefecer a câmera com água gelada fornecida pelo circulador de água a uma temperatura otimizada de -90 °C.</li>
	<li>Para a imagem de célula/tecido vivo, instale o sistema de incubação, controlando a temperatura e o gás misto, até o estágio do microscópio.</li>
	<li>Para a imagem da imagem da expressão do repórter luciferase desestabilizado, use o ângulo numérico elevado (NA: 1.30) lente objetiva da óleo-imersão de 40x. A distância de trabalho desta lente é de 0,2 mm, ela está disponível não só para a cultura celular monocamada, mas também a cultura de fatia.</li>
	<li>Para o monitoramento duplo da expressão de luciferase e repórter de fluoresceina, instale o dispositivo de iluminação LED no caminho de luz do microscópio.</li>
	<li>Controle a imagem de lapso de tempo com um software associado ao microscópio (por exemplo, programa de aquisição multidimensional do software MetaMorph).</li>
	<li>Prepare todo o sistema em uma sala escura, porque o sinal do repórter lúciferase desestabilizado é muito fraco, e para evitar a luz estranha impedir a aquisição.</li>
</ol>3. Culturas de dissociação de células de tronco/progenitor neural (NPC)
<ol><li>Preparação de mídia cultural, pratos e reagentes para a cultura de dissociação do NPC<ol>
<li>Prepare a mídia N2/B27 para cultivar células de tronco/progenitor neural com uma concentração final de 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetilcysteine, 10 ng/mL bFGF e 50 U/mL Penicilina/Streptomicina na mídia DMEM/F12.</li>
		<li>Prepare a solução de papaína para dissociação contendo 7 U/mL papain, 0,006% DNase e 1 mM N-acetilcisteína na mídia EBSS.</li>
		<li>Prepare 100 mM de solução de sódio luciferinpara imagens de luminescência. Diluir a solução luciferin de 100 mM nos meios N2/B27 para uma concentração final de 1 mM. NOTA: Luciferin mostra auto-fluorescein em si. No caso da imagem dual luciferase-fluorescência dupla, especialmente EGFP, reduzindo a concentração de luciferino para 0,5 mM é melhor.</li>
		<li>Cubra uma solução de fundo de vidro de 35 mm (diâmetro de vidro de 27 mm) com 40 μg/mL de solução poli-L-lisina (PLL) por 1 h à temperatura ambiente. Após a incubação, lave as placas 3x com PBS e deixe secar.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção de embriões e dissociação de NPCs<ol>
<li>Depois de eutanásia de um rato transgênico pDll1-Ub-luc grávida (dia embrionário 12.5 (E12.5)) por asfixia de CO2 e deslocamento cervical, cortado no abdômen e tirar o útero. NOTA: Os pesquisadores devem seguir os regulamentos e diretrizes do comitê de pesquisa animal de sua instituição. Se a anestesia ou drogas de alívio da dor são usados, usá-los corretamente.</li>
		<li>Transfira o útero em uma placa de Petri de 10 cm contendo 25 mL de PBS gelada. Retire os embriões do útero em PBS gelada, usando micro tesouras e fórceps finos.</li>
		<li>Corte a cabeça de cada embrião usando tesoura e transfira-a para 10 cm de placas de Petri contendo DMEM/F12 geladas. Retire a epiderme e cartilagem em torno do cérebro e transferir o cérebro para 35 mm placa de Petri contendo gelo frio 3 mL de mídia N2/B27.</li>
		<li>Cortar o telencefalon direito e esquerdo do diencefalon (Figura 1Ba-f, C,D). Retire as meninges que cobrem a superfície do telencefalon usando fórceps finos (Figura 1Bi). Usando fórceps finos novamente, retire a parte dorso-lateral do córtex do telencefalon (Figura 1Bg,h,j-l E).</li>
		<li>Transfira os tecidos para novos tubos de 1,5 mL usando uma pipeta P1000 e retire qualquer meio extra com uma pipeta P200. Adicione 0,1 mL de solução de papaina por tecido cerebral (um par do córtex). Após 15 min de incubação a 24 °C, delicadamente pipeta as amostras 10 vezes com pipeta P1000. Incubar as amostras novamente por 15 min a 24 °C.</li>
		<li>Delicadamente pipeta as amostras 10 vezes com pipeta P1000. Centrífugas as amostras de 3 min a 400 x g e temperatura ambiente (RT). Descarte o supernatant.</li>
		<li>Adicione 1 mL de mídia DMEM/F12 à pelota. Delicadamente pipeta 10 vezes com pipeta P1000. Centrífuga as amostras de 3 min a 400 x g e RT. Descarte o supernatant. Repita isso pelo menos mais 2 vezes.</li>
		<li>Para a pelota, adicione 0,5 mL de mídia N2/B27 contendo 1 m luciferin e misture bem. Sementes das células (1 x 106 células) para um prato de fundo de vidro revestido pll. Cultura as células da incubadora de CO2 para 1 h. Uma vez que as células aderem ao prato, adicione 2 mL de mídia N2/B27, contendo 1 mM luciferin.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualização da expressão de repórter lúciferase na cultura de dissociação do NPC<ol>
<li>Inicie o sistema de imagem ao vivo de luminescência antes de realizar a dissecação. Para a cultura NPC, definir a temperatura da incubadora de palco em 37 °C e definir a configuração da mistura de gás 20% O2, 5% CO2.</li>
		<li>Coloque o óleo de imersão para a lente objetiva. Coloque o prato de amostra no estágio do microscópio. Veja o campo manualmente e escolha a melhor posição e o foco das células de interesse. Clique ao vivo para adquirir a imagem do teste.</li>
		<li>Executar a aquisição de lapso de tempo por aquisições bidimensionais (luminescência e campo brilhante) por 24 h com o programa de aquisição multidimensional. Escolha o programa de aquisição multidimensional e defina a configuração de aquisição da seguinte forma (passo 3.3.6).</li>
		<li>Para aquisição de imagem de luminescência, use as seguintes configurações da câmera: baixa taxa de transferência (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min tempo de exposição. Para aquisição de imagem de campo brilhante, use as seguintes configurações: taxa de transferência intermediária (1 MHz), 1 x 1 binning e 100 ms tempo de exposição.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Na eletroporação do útero
NOTA: Isso é realizado para a introdução do repórter Dll1-Fluc nas células progenitoras neurais.
<ol><li>Preparação de ferramentas e reagentes para eletroporação<ol>
<li>Prepare micro capilares para injeção de DNA no ventrículo da telencefalon embrionária. Estique um capilar de grama com calor e corte e espolie a ponta dele com a máquina de polimento.</li>
		<li>Prepare uma mistura de DNA com tinuismo (por exemplo, trypan azul). A concentração de cada DNA é de 1 μg/μL na PBS e adiciona o tinudeve a uma concentração final de 10%. NOTA: Use a mistura de DNA para visualização da dinâmica proteica Dll1 da seguinte forma: Dll1-Fluc (repórter de proteína Dll1, Figura 2E superior)e pEF-EGFP (vetor de expressão do EF dirigido eGFP, Figura 2E menor),monitorando a localização e morfologia das células infectadas.</li>
		<li>Prepare dois tipos de anestésicos: 3,88 mg/mL de pentobarbital e 0,12% de xilazine, em 1x PBS estéril.</li>
		<li>Use os instrumentos estéreis e luvas cirúrgicas durante a operação.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na eletroporação do útero<ol>
<li>Anestésico um rato ICR grávida de tempo (E12.5) pela administração intraperitoneal de anestésicos com 500 μL de 3,88 mg/mL pentobarbital e 500 μL de 0,12% xilazine. NOTA: Os investigadores devem seguir a regulação de experimentos com animais. Se é preciso usar anestesia ou drogas para alívio da dor, usá-los corretamente.</li>
		<li>Clip o cabelo e desinfetar a pele com esfoliação cirúrgica.</li>
		<li>Verifique se há falta de resposta pitada do dedo do dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo do lado. Uma vez que o reflexo do pedal não é observado, faça um corte de 2-3 cm através do abdômen ao longo da linha média. Coloque gazes em torno da parte dissecada e molhar as gazes com PBS quente para não secar a incisão. Retire o chifre uterino direito suavemente com fórceps em forma de anel e conte o número de embriões.</li>
		<li>Injetar 1-2 μL do DNA misto no ventrículo do telencefalon de embriões suavemente com micro capilar. NOTA: Quando a injeção é bem sucedida, pode-se ver a cor azul do corante sobre a superfície do útero.</li>
		<li>Molhe o útero e o eletrodo antes de fornecer os pulsos de tensão, e, em seguida, segure a cabeça de um embrião suavemente. Definir o eletrodo carregado positivamente para o lado do hemisfério, em que o DNA foi injetado. Certifique-se de que a condição do pulso de eletroporação é 30-50 V para 50 ms, o intervalo dos pulsos é de 1 s (50 ms carga e 950 ms não-carga). Fornecer 5 pulsos para um embrião e verificar se as bolhas são geradas a partir do eletrodo carregado negativamente. NOTA: Certifique-se de que a direção do eletrodo: o DNA é incorporado em células do lado do eletrodo positivo. Durante este procedimento, não mova a posição do eletrodo.</li>
		<li>Repita os passos 4.2.3-4.2.4 para outros embriões e retorne o chifre uterino à cavidade abdominal. Realize o mesmo procedimento para os embriões no chifre uterino esquerdo.</li>
		<li>Depois de colocar de volta o lado esquerdo, sutura da incisão por uma sutura de seda (4-0) com uma agulha (17 mm). Antes de fechar a incisão completamente, coloque PBS quente na cavidade abdominal NOTA: O intervalo entre as suturas é de cerca de 2 mm.</li>
		<li>Depois de terminar a cirurgia, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para recuperação pós-anestesia. Abrigar o mouse individualmente. NOTA: Os investigadores devem seguir a sua regulação instiutional local de experimentos com animais. Se é preciso usar drogas de alívio da dor, usá-los corretamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparação de culturas de fatia do córtex em desenvolvimento e visualização da expressão repórter lúciferase nas fatias corticais
<ol><li>Preparação de mídia cultural e reagentes para fatia culturas do córtex<ol>
<li>Prepare meios enriquecidos para cultivar fatias corticais contendo 5% de soro bovino fetal e 5% de soro de cavalo na mídia N2/B27.</li>
		<li>Bolha 100% O2 gás através dmem/ f12 mídia para dissecação e fazer fatias cortical. NOTA: Para usar gás oxigênio com segurança, armazenar o cilindro O2 no armário do cilindro e monitorar a concentração de oxigênio no ar por um medidor de concentração de oxigênio.</li>
		<li>Diluir a solução de sódio luciferin de 100 mM em mídia enriquecida para uma concentração final de 1 mM. NOTA: Luciferin mostra auto-fluorescein em si. No caso da imagem dual luciferase-fluorescência dupla, especialmente EGFP, menor concentração de luciferin (0,5 mM) é melhor.</li>
		<li>Defina a incubadora multigás a 37 °C em 40% O2 e 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção de embriões e exame da expressão do repórter fluorescente<ol>
<li>Depois de eutanásia do rato grávida para que os repórteres (E13.5) são introduzidos pela eletroporação no útero (passo 4.2), cortar o abdômen e tirar o útero. NOTA: Os investigadores devem seguir a regulação de experimentos com animais. Se usar anestesia ou drogas para alívio da dor, use-as corretamente.</li>
		<li>Transfira o útero para uma placa de Petri de 10 cm contendo PBS. Retire os embriões do útero em PBS, usando micro tesouras e fórceps finos. Corte a cabeça de cada embrião e transfira para uma placa de Petri de 10 cm contendo mídia DMEM/F12 borbulhada com gás 100% O2. Remover epiderme e cartilagem em torno do cérebro na mídia DMEM/ F12.</li>
		<li>Coloque o cérebro na tampa da placa de Petri com fórceps em forma de anel e coloque a tampa no estágio de microscópio estereoscópico de fluorescência. Verifique a região do córtex expressando proteína fluorescente a luz de excitação(Figura 2A,B).</li>
		<li>Transfira o cérebro para uma placa de corte de borracha de silicone cheia de 30 mL de mídia DMEM/F12 borbulhada com gás 100% O2. Retire meninges cobrindo a superfície da telencefalon por fórceps finos.</li>
		<li>Corte a fronteira entre parte medial e lateral do telencefalon dorsal e separe em dois hemisférios usando micro faca cirúrgica ou fórceps finos. Usando uma micro faca cirúrgica, corte o córtex como listras e faça fatias corticais(Figura 2C,D). Fatias de pipeta com meio usando pipeta e transferi-las para a mídia enriquecida em um prato de 35 mm.</li>
		<li>Coloque as fatias nas inserções culturais nos pratos de fundo de vidro com mídia enriquecida. Corrija a direção das fatias usando fórceps finos. Configure a superfície cortada das fatias na superfície da inserção da cultura. Retire a mídia extra por uma pipeta. Incubar as fatias na incubadora multi-gás definida por 40% O2 e 5% CO2 a 37 °C por 30 min.</li>
		<li>Adicione 300 μL de mídia enriquecida contendo 1 mm luciferin para o exterior da cultura inserir no prato de fundo de vidro.</li>
	</ol></li>
	<li>Visualização da expressão de repórter lúciferase em culturas fatia<ol>
<li>Comece o sistema de imagem ao vivo de luminescência antes de iniciar a dissecação. Use a seguinte condição de culturas de fatias corticais: 40% O2,5% CO2 e 37 °C.</li>
		<li>Coloque o óleo de imersão para lente 40x objetivo. Coloque o prato de amostra para o estágio do microscópio. Adquirir a imagem de teste de fluorescente e definir a posição eo plano de foco para a região de interesse a iluminação da luz de excitação.</li>
		<li>Executar a aquisição de lapso de tempo por 3-dimentional (luminescência, fluorescência e campo brilhante) aquisições para 24 h(Figura 2F-H). Para aquisição de imagem de luminescência, use as seguintes configurações da câmera: baixa taxa de transferência (50 kHz), 2x2/4x4 binning, tempo de exposição de 10 min/5 min. Para a fluorescência e a aquisição de imagem de campo brilhante, use as seguintes configurações: taxa de transferência intermediária (1 MHz), 1x1 binning e 100 ms tempo de exposição.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Processamento e análise de imagem
<ol><li>Conecte cada imagem e faça as imagens da pilha. Clique na sequência de imagens de importação do menu de arquivos (Arquivo | Importação | Sequência de Imagem)e escolha a pasta, onde as imagens adquiridas são salvas. Coloque algumas palavras contidas no nome do arquivo para a coluna de nome File contém.</li>
	<li>Para remover o ruído do raio cósmico nas imagens de bioluminescência, aplique o plug-in do Filtro SpikeNoise do ImageJ/Fiji. Abra as imagens da pilha e clique no Filtro SpikeNoise.</li>
	<li>Aplique savitzky golay filtro temporal plug-in para obter uma clara dinâmica de expressão repórter. Abra as imagens da pilha e clique em Savitzky Golay Filtro Temporal.</li>
	<li>Para medir a intensidade da expressão do repórter, aplique o plug-in Z Axis Profile Plus a cada célula. Selecione as células e defina ROIs, região de interesse e clique no Z Axis Profile Plus.
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm interesse financeiro conflitante.

Os componentes da sinalização notch mostram expressões oscilatórias em sincronia durante a somitogênese, mas fora de sincronia durante a neurogênese, levando às dificuldades em capturar a dinâmica de expressão por análise estática neste último caso. Assim, o monitoramento em tempo real é necessário para revelar a dinâmica de expressão dos componentes de sinalização notch, como Hes1 e Dll1. Porque os períodos das expressões das oscilações de Hes1 e Dll1 são extremamente curtos, aproxima...

O cérebro de mamíferoé composto por um grande número de vários tipos de neurônios e células gliais. Todas as células são geradas a partir de células de tronco neural /progenitoras (NPCs), que primeiro proliferam para expandir seus números, em seguida, começam a se diferenciar em neurônios e, finalmente, dar origem às células gliais1,2,3,4,5. Uma vez que as células se diferenciaram em neurônios, elas não podem proliferar ou aumentar seus números e, portanto, a manutenção de NPCs até estágios posteriores é importante. Notch sinalização através de interações célula-célula desempenha um papel importante na manutenção npcs6,7. Os ligantes de notch interagem com a proteína da membrana, Notch, na superfície das células vizinhas e ativa mproteína Notch. Após a ativação, ocorre a proteólese da proteína Notch, liberando assim o domínio intracelular de Notch (NICD) da membrana celular para o núcleo8,9,10. No núcleo, nicd liga-se às regiões promotorde Hes1 e Hes5 (Hes1/5)e ativa a expressão desses genes. Hes1/5 reprimir a expressão dos genes proneuris Ascl1 e Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Como os genes neurais induzem a diferenciação neuronal, Hes1/5 desempenha papéis essenciais na manutenção de NPCs. Além disso, como os genes proneuris podem ativar a expressão do Entalhe ligand Delta-like1 (Dll1), Hes1/5 também reprimir a expressão de Dll1. Portanto, a expressão de Dll1 leva a células vizinhas sendo negativa para Dll1 via sinalização Notch. Desta forma, as células inibem as células adjacentes de seguir seu mesmo destino, um fenômeno conhecido como a inibição lateral8. No cérebro em desenvolvimento, a inibição lateral desempenha um papel na geração de vários tipos de células diferentes.
Imagens em tempo real no nível único celular revela expressões dinâmicas dos componentes da sinalização Notch em NPCs15,16,17. Notch sinalização ativa a expressão de Hes1, mas a proteína Hes1 se liga ao seu próprio promotor e reprime sua própria expressão. Além disso, Hes1 é uma proteína extremamente instável, que é degradada pela via ubiquitina-proteasome; Portanto, a repressão de seu próprio promotor é de curta duração e, em seguida, a transcrição começa novamente. Desta forma, a expressão de Hes1 oscila tanto nos níveis de transcrição quanto translacional em um ciclo18de 2 h. A expressão oscilatória de Hes1, por sua vez, induz a expressão oscilatória dos genes-alvo a jusante, como Ascl1, Neurog2 e Dll1, via repressão periódica15,16,17, 19. Enquanto os genes neurais podem induzir diferenciação neuronal, sua expressão oscilatória não é suficiente para diferenciação neuronal; sim sua expressão sustentada é essencial para a diferenciação neuronal. A expressão oscilatória de genes proneuris é importante para a manutenção de NPCs em vez de induzir diferenciação neuronal14,15,16. A expressão de Dll1 oscila em ambos os níveis de transcrição e translação durante várias morfogêneses, como neurogênese e somitogênese. A expressão dinâmica do Dll1 é importante para a morgênese normal e expressão constante de Dll1 induz defeitos na neurogênese e somitogênese17. Estes resultados demonstram a função importante que a dinâmica da expressão do gene e da cinética da proteína tem no regulamento de vários eventos desenvolventes (isto é, dinâmica diferente da expressão produz saídas diferentes em comportamentos celulares).
Para analisar a dinâmica da sinalização notch, a análise estática de tecidos e células são insuficientes porque eles estão em constante mudança. Imagens em tempo real de células únicas é uma ferramenta poderosa para revelar a dinâmica na expressão gênica. A expressão dinâmica das moléculas de sinalização notch sofre respostas cíclicas rápidas no período de 2-3 h. Esta rápida expressão periódica apresenta dois problemas difíceis para o monitoramento em tempo real: (1) a expressão das moléculas é suprimida a níveis baixos, e (2) a rotatividade rápida requer repórteres de resposta rápida. Para superar esses problemas, anteriormente desenvolvemos um método de imagem em tempo real de bioluminescência20. Como o repórter de bioluminescência tem maior sensibilidade e menor tempo de maturação do que os repórteres fluorescentes, essa estratégia nos permite monitorar a dinâmica rápida nas células vivas. Usando a visualização em tempo real, descobrimos que mais genes exibiam expressão dinâmica do que pensávamos anteriormente. Além disso, o número de relatos que mostram expressão e dinâmica proteica em células vivas e o significado dessas dinâmicas em vários eventos biológicos tem aumentado, sugerindo um papel fundamental da dinâmica nas expressões gênicas21,22.
Neste relatório, descrevemos uma maneira de visualizar a expressão do Notch ligand Dll1 em NPCs em culturas dissociadas e em culturas de fatias corticais. Para monitorar a dinâmica da transcrição Dll1 em níveis de célulaúnica, geramos culturas dissociadas de NPCs derivadas da telencefalon embrionária de camundongos transgênicos carregando repórter pDll1-Ub-Fluc, um repórter lúciferase desestabilizado dirigido por promotor dll1. Para monitorar a dinâmica da proteína Dll1 in vivo, introduzimos o repórter de fusão Dll1-Fluc em NPCs no córtex e visualizamos a expressão do repórter em NPCs em culturas de fatias corticais. Imagens em tempo real nos permitiram capturar as várias características da expressão gênica e da dinâmica proteica em células vivas em alta resolução temporal.

<table><tbody><tr><td>Sistema de imagem de bioluminescência</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Circulador de água gelada (chiller)</td><td>Julabo</td><td>Modelo: F12-ED</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD refrigerada</td><td>Andor Technology</td><td>Modelo: iKon-M 934</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de incubadora</td><td>TOKAI HIT</td><td>Modelo: INU-ONICS</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>Modelo: IX81</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Olympus</td><td>Modelo: IX83</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de iluminação LED</td><td>CoolLED</td><td>Modelo: pE1</td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>MOLECULAR DEVICES</td><td>Modelo: 40000</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de gás misto</td><td>Tokken</td><td>Modelo: TK-MIGM OLO2</td><td></td></tr><tr><td>Lente objetiva</td><td>Olympus</td><td>Modelo: UPLFLN 40X O</td><td></td></tr><tr><td><forte>Preparações para dissecção</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Nikon</td><td>Modelo: SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio estereoscópico de fluorescência</td><td>Leica</td><td>Modelo: MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>DUMONT</td><td>INOX No.5</td><td></td></tr><tr><td><forte>Tesoura, Micro tesoura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>em forma de anel</tr><tr><td>10 cm de plástico</td><td>Graxa</td> de placa de Petri <td>664160-013</td><td></td></tr><tr><td>35 mm de plástico</td><td>Graxa</td> de placa de Petri <td>627160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>invitrogen</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Reagentes para NPC cultura de dissociação</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>invitrogen</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>invitrogen</td><td>13256-029</td><td>Solução de estoque: 1 &mu; g/ml em 0,1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01493-85</td><td>Solução de estoque: 100mM em solução salina a 0,9%</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003172</td><td>Solução de estoque: 1000U/ml em EBSS</td></tr><tr><td>EBSS Worthington</td><td>Biochemical Corporation</td><td>LK003188</td><td></td></tr><tr><td>Prato de fundo de vidro</td><td>IWAKI</td><td>3910-035</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de N2 (100x)</td><td>invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetil-cisteína</td><td>Sigma</td><td>A-9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003178</td><td>Solução de estoque: 7U/ml em EBSS</td></tr><tr><td>Penicilina/Streptmycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P-6281</td><td>40 mg/ml em DW</td></tr><tr><td><forte>Preparações para electroporação in utero</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>seringa de 50 ml</td><td>TERUMO</td><td>181228T</td><td></td></tr><tr><td>Eléctrodo</td><td>Neppagene</td><td>7-mm</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Neppagene</td><td>CUY21 EDIT</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gazes</td><td>Kawamoto co.</td><td>7161</td><td></td></tr><tr><td>Micro capilar</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Pentbarbital</td><td>Kyoritsuseiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>em forma de anel</tr><tr><td>Tesoura, Micro tesoura Agulha</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>sutura</td><td>Akiyama MEDICAL MFG. CO</td><td>F17-40B2</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer</td><td>Seractal</td><td></td></tr><tr><td>Preparações para cultura de fatias</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm de plástico</td><td>Graxa</td> de placa de Petri <td>664160-013</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de placa de Petri de plástico de 35 mm</td><td></td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>Inserção de cultura</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>invitrogen</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovino Soro</td><td>Sigma</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pinça Fina</td><td>DUMONT</td><td>INOX No.5</td><td></td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cavalo Soro</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Micro faca cirúrgica</td><td>Alcon</td><td>19 Gauge V-Lance</td><td></td></tr><tr><td>Multi-gás incubadora</td><td>Panasonic</td><td>MCO-5MUV-PJ</td><td></td></tr><tr><td>N2/B27 mídia</td><td>Feita internamente</td><td></td><td>ref. Cultura de dissociação NPC</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td>em forma de anel</tr><tr><td>Tesoura, micro tesoura Tábua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de corte de borracha de silicone</td><td>Feita internamente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de murine

Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis

A sinalização de notch regula a manutenção de células-tronco/progenitoras neurais por interações célula-célula. Os componentes da sinalização notch exibem expressão dinâmica. Notch sinalização efetor Hes1 e o Notch ligand Delta-like1 (Dll1) são expressos de forma oscilatória em células de tronco neural / progenitor. Como o período de expressão oscilatória desses genes é muito curto (2 h), é difícil monitorar sua expressão cíclica. Para examinar tais mudanças rápidas na expressão do gene ou na dinâmica da proteína, os repórteres rápidos da resposta são exigidos. Devido à sua rápida maturação cinética e alta sensibilidade, o repórter de bioluminescência luciferase é adequado para monitorar mudanças rápidas de expressão gênica nas células vivas. Usamos um repórter lúciferase desestabilizado para monitorar a atividade do promotor e um repórter luciferase fundido para visualização da dinâmica de proteínas na resolução de célulaúnica. Estes repórteres da bioluminescência mostram o retorno rápido e geram sinais muito fracos; Portanto, desenvolvemos um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível para detectar tais sinais fracos. Esses métodos nos permitem monitorar várias dinâmicas de expressão gênica em células vivas e tecidos, que são informações importantes para ajudar a entender os estados celulares reais.

Expressões dos genes Hes1/7 exibem 2 h ciclo de oscilação em várias linhas celulares e durante a somitogênese. Além disso, o período de oscilação é muito curto e tanto os seus mRNAs como as proteínas são extremamente instáveis, com a meia-vida de cerca de 20 min. Se usar um repórter de resposta lenta, não podemos rastrear uma dinâmica tão rápida, e se usar um repórter estável, ele gradualmente se acumula enquanto a expressão gênica oscila. Assim, o repórter deve ser rapidamente degradado para monitorar a rápida ...

Células de tronco neural/progenitor apresentam várias dinâmicas de expressão de componentes de sinalização notch que levam a diferentes resultados de eventos celulares. Essa expressão dinâmica pode ser revelada pelo monitoramento em tempo real, não pela análise estática, usando um sistema de imagem de bioluminescência altamente sensível que permite a visualização de mudanças rápidas nas expressões gênicas.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

Notch signaling regulates the maintenance of neural stem/progenitor cells by cell-cell interactions. The components of Notch signaling exhibit dynamic ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o significado da dinâmica da expressão genética na proliferação e diferenciação celular, particularmente a dinâmica das moléculas de sinalização notch em células-tronco neurais. A principal vantagem dessa técnica é que podemos monitorar a expressão genética tanto in vitro quanto in vivo com uma precisão muito alta por imagem ao vivo. Demonstrando o procedimento estará Hiromi Shimojo, professora assistente do meu laboratório que desenvolveu essa nova tecnologia.Para a introdução do repórter de luciferase Dll1 F no NPC, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um dia embrionário de 12,5 a 14,5 camundongos grávidas antes de fazer uma incisão de dois a três centímetros através do abdômen, ao longo da linha média. Coloque gaze encharcada de PBS ao redor da incisão e use fórceps em forma de anel para extrair cuidadosamente o chifre uterino direito. Depois de contar os embriões, use um micro capilar para injetar um a dois microliters de DNA misto de repórter de luciferase Dll1 F no ventrículo do telencephalon de cada embrião.Uma injeção bem sucedida resultará na observância do corante azul sobre a superfície do útero.

real-time-bioluminescence-imaging-notch-signaling-dynamics-during

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Imagem tecido embrionário em tempo real, é um desafio durante longos períodos de tempo. Aqui nós apresentamos um ensaio para o monitoramento das alterações celulares e sub-celular na medula espinhal pinto por longos períodos com resolução espacial e temporal. Esta técnica pode ser adaptado para outras regiões do sistema nervoso e embrião em desenvolvimento.

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias...

Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Fonte: Breid, S., et. al. Imagem de bioluminescência da neuroinflamação em camundongos transgênicos após inoculação periférica de fibrilas de alfa-sinucleína. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a imagem de bioluminescência da neuroinflamação em camundongos transgênicos, mostrando reações de luciferase-luciferina em astrócitos ativados. O protocolo permite a quantificação não invasiva da ativação astrocítica, auxiliando estudos sobre inflamação do SNC e eficácia terapêutica.

Imagem de bioluminescência da neuroinflamação em um camundongo transgênico

Fonte: Ciraku, L., et. al. Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático cerebral do câncer de mama. J. Vis. Exp. (2021). Este vídeo demonstra a imagem de células tumorais que expressam luciferase em uma fatia de cérebro de camundongo organotípica. A luciferina é adicionada ao meio e a placa é colocada dentro da câmara do sistema de imagem in vivo. Os parâmetros para captura de imagem são ajustados e a forma e o tamanho do tumor são definidos.

Imagem de bioluminescência para avaliar o crescimento do tumor em uma fatia de cérebro de camundongo organotípica

Fonte: Shimojo, H., et al. Imagem de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização Notch durante a neurogênese murina. J. Vis. Exp. (2019)Neste vídeo, culturas de fatias corticais de embriões de camundongos transgênicos são usadas para monitorar a expressão gênica por meio de imagens tridimensionais. Imagens de bioluminescência, fluorescência e campo claro são usadas para visualizar a expressão gênica em tempo real durante a diferenciação neuronal dentro do tecido nativo.

Monitoramento da expressão gênica em tempo real em fatias cerebrais por meio de imagens tridimensionais

Fonte: Weber, R. Z., et al., Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)Este vídeo demonstra o método para imagens de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas geneticamente modificadas injetadas em um cérebro de camundongo. O processo envolve injeção de luciferina, preparação de imagens e detecção de sinais bioluminescentes das células transplantadas no local...

Imagem de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas em um cérebro de camundongo

Aqui nós apresentamos um romance Ca 2+ -Imaging abordagem usando um repórter bioluminescente. Esta abordagem utiliza um GFP-aequorina constructo fundido que se liga a Ca 2+ e emite luz, eliminando a necessidade de excitação da luz. Significativamente este método permite imagem longa e contínua, o acesso a estruturas cerebrais profundas e alta resolução temporal.

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Este método descreve uma preparação crônica que permite o acesso óptico ao hipocampo de camundongos vivos. Esta preparação pode ser utilizada para realizar imagens ópticas longitudinais de plasticidade estrutural neuronal e plasticidade celular evocada por atividade ao longo de um período de várias semanas.

Imagem latente longitudinal do dois-fotão do hipocampal dorsal CA1 em ratos vivos

Descrevemos o transplante intraparenquimal de células progenitoras neurais transduzidas com um vetor de repórter duplo expressando proteína fluorescente verde-luciferase (GFP) no cérebro do camundongo. Após o transplante, o sinal de luciferase é repetidamente medido usando bioluminescência in vivo e células enxertadas expressas por GFP identificadas em seções cerebrais usando microscopia de fluorescência.

Transplante intracerebral e rastreamento de bioluminescência in vivo de células progenitoras neurais humanas no cérebro do camundongo

Aqui, descrevemos um protocolo combinando injeção de vírus adenoassociado com implante de janela craniana para obtenção simultânea de imagens da dinâmica microglial e atividade neuronal em camundongos acordados.

Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Aprenda a monitorar a dinâmica da sinalização Notch em células-tronco neurais murinas usando imagens de bioluminescência em tempo real. Esta técnica permite visualizar mudanças rápidas na expressão gênica com alta precisão in vitro e in vivo.

Imagens de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização de notch durante a neurogênese de Murine

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