Name: Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Aprenda a coletar regiões cerebrais congeladas de roedores para obter proteínas e RNA de alta qualidade. Este método utiliza camundongos CD-1 e preserva a integridade molecular para análises a jusante em neurociência.

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Este trabalho foi apoiado pelo NIH, DA043982 e DA046196.

Os animais utilizados neste estudo foram tratados de forma ética e humana, conforme estabelecido pelas diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e institutos nacionais de saúde (NIH).
NOTA: Todas as ferramentas e superfícies devem ser lavadas com um solvente apropriado para remover as nucleases18 antes de iniciar qualquer trabalho.
1. Armazenar cérebros
<ol><li>Remova rapidamente os cérebros de camundongos adultos do tipo CD1 adultos que pesam aproximadamente 30 g usando uma abordagem convencional13 e congele por 60 segundos em nitrogênio líquido ou isopentano pré-refrigerado com gelo seco.</li>
	<li>Armazene cérebros congelados a -80 °C em papel alumínio ou tubos cônicos até o uso.</li>
</ol>2. Preparando a matriz cerebral
<ol><li>Vinte e quatro horas antes de dissecar o tecido, coloque uma matriz cerebral limpa (ver Tabela de Materiais) em uma pilha de embalagens de congelador descongelados. Sanduiche as laterais da matriz entre duas embalagens de congelador certificando-se de deixar aproximadamente 0,5 cm entre a parte inferior das ranhuras de barbear e a parte superior das embalagens de gel(Figura 1A). Coloque papel alumínio nas extremidades para ajudar no resfriamento. NOTA: Ao comprar uma matriz cerebral, compre uma que seja grande o suficiente para envolver todo o volume do cérebro a ser dissecado.</li>
	<li>Coloque a caixa contendo a matriz cerebral e as embalagens do congelador em um congelador de -20 °C com a parte superior entreaberta durante a noite.</li>
</ol>3. Configuração de uma placa de vidro congelada
NOTA: O objetivo desta configuração é preparar uma superfície congelada para dissecar seções cerebrais.
<ol><li>Coloque gelo em uma caixa isolada até aproximadamente 5 cm da parte superior. Em seguida, coloque uma camada de gelo seco de 2,5 cm sobre cima do gelo e cubra com folhas de plástico preto para ajudar na visualização da amostra(Figura 1B, Figura 1C).</li>
	<li>Coloque uma placa de vidro (deve caber apenas na abertura da caixa) em cima do plástico e coloque gelo seco em cima da placa nos cantos mais distantes(Figura 1C).</li>
	<li>Pegue a matriz cerebral congelada do congelador e insira o cérebro para ser cortado lado a lado do córtex para cima. Deixe-o equilibrar-se à temperatura na caixa por 10 min. Mantenha a tampa na caixa durante este tempo.</li>
	<li>Ajuste a posição do cérebro na matriz com fórceps frios para que o seio sagital e o seio transversal se alinhem com as ranhuras perpendiculares do bloco(Figura 1D). Isso ajudará a garantir seções simétricas para uma dissecção mais fácil. Toque nas pontas dos fórceps para secar o gelo brevemente para esfriar antes de ajustar o cérebro.</li>
	<li>Uma vez que o cérebro esteja em posição, coloque uma lâmina de barbear resfriada perto de seu centro e pressione a lâmina aproximadamente 1 mm no tecido. Adicione lâminas refrigeradas nas extremidades rostral e caudal para ajudar a manter o cérebro no lugar (Figura 2A e Figura 2B).</li>
	<li>Começando na extremidade rostral, adicione lâminas uma de cada vez, colocando-as nas ranhuras e pressionando-as suavemente para baixo no tecido aproximadamente 1 mm(Figura 2B). Continue a adicionar lâminas em intervalos de 1 mm trabalhando em direção à extremidade caudal.</li>
	<li>Certifique-se de que o cérebro não mude durante este tempo. Alinere as lâminas horizontal e verticalmente(Figura 2B). Para cortar as seções em larguras de 0,5 mm, podem ser utilizadas lâminas de microtomo de baixo perfil (ver Tabela de Materiais). Coloque-as entre as lâminas de barbearmaiores (Figura 2C).</li>
	<li>Uma vez que as lâminas estejam no lugar, pressione para baixo na parte superior do grupo com dedos, palma ou alguma outra superfície plana(Figura 2C, Figura 2D). Balance o grupo de lâminas lentamente de um lado para o outro para movê-las através do tecido. NOTA: Isso pode levar algum tempo (1-2 min) e requer paciência. Deve haver resistência às lâminas que se movem através do tecido. Entrada fácil significa que o cérebro está descongelando e o bloco deve ser resfriado com gelo seco.</li>
	<li>Quando todas as lâminas atingirem o fundo das ranhuras, segure cada lado do grupo de lâminas e trabalhe livre da matriz balançando para frente e para trás. NOTA: Tenha cuidado para evitar cortar-se nas bordas afiadas das lâminas.</li>
	<li>Uma vez que o grupo esteja livre, coloque a pilha, o lado rostral para cima, na placa de vidro(Figura 2E). Coloque gelo seco ao lado e/ou em cima da pilha para congelar ainda mais as amostras para facilitar a separação.</li>
	<li>Coloque a pilha com bordas afiadas para baixo na placa de vidro e lâminas separadas, deslocando a pilha entre polegares e dedos. As lâminas devem ser separadas umas das outras com seções anexadas.</li>
	<li>Alinhe seções na placa de vidro de rostral a caudal(Figura 2F).</li>
	<li>Separe o tecido das lâminas flexionando as lâminas entre os dedos, ou separando-se com uma segunda navalha fria(Figuras 2G,2H,2I).</li>
</ol>4. Dissecar seções
<ol><li>Abra o Atlas do Cérebro do Rato Allen ou outra referência e encontre pontos de referência necessários para identificar regiões de interesse. Alguns marcos óbvios incluem a comissura anterior, o corpo caloso, os ventrículos laterais e o hipocampo(Figura 3).</li>
	<li>Gire a seção a ser cortada com fórceps refrigerados e certifique-se de que a região prestes a ser coletada seja consistente em toda a seção. Durante a colheita, consulte o atlas de referência com freqüência para certificar-se de que o ROI correto é obtido. NOTA: Uma lupa ou um microscópio de dissecação são muitas vezes úteis neste processo. Uma boa iluminação também é essencial. Lâmpadas LED de baixa potência ou uma lâmpada fria (ver Tabela de Materiais)podem ser usadas para este fim.</li>
	<li>Com um bisturi ou soco limpo, corte na seção(Figura 4). Pré-frite cada ferramenta antes de cortar tocando-a brevemente para secar gelo. Empurre a lâmina suavemente, mas firmemente para dentro do tecido, balançando-a para frente e para trás para fazer o corte. Não empurre muito forte ou o tecido vai fraturar. NOTA: As ferramentas se aquecerão com o tempo. Lâminas ligeiramente aquecidas podem ser úteis na realização de cortes limpos e podem limitar a fratura, mas tenha cuidado para evitar o descongelamento de tecidos. Arrefece periodicamente ferramentas em gelo seco.</li>
	<li>Uma vez que um ROI é colhido, coloque-o em tubos rotulados de 1,5 mL pré-refrigerados. Armazene tecidos colhidos a -80 °C até que seja necessário.</li>
	<li>Processe o tecido congelado coletado desta forma adicionando tampão RIPA frio (50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% CHAPS e coquetel inibidor de proteína (ver Tabela de Materiais))para extração de proteínas, ou um solvente contendo guanidinium (ver Tabela de Materiais) para extração de RNA para a amostra congelada e homogeneizar imediatamente usando um Dounce de vidro ou homogeneizador mecânico (ver Tabela de Materiais). Desta forma, os inibidores de protease e nuclease estão no lugar à medida que a amostra se aquece para proteger proteínas e ácidos nucleicos da degradação.</li>
</ol>

<ol><li>Allen Institute. Allen Mouse Brain Atlas. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas">https://mouse.brain map.org/experiment/thumbnails/100048576?image_type=atlas</a> (2008).</li>
<li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li>
<li>Scanziani, M., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+in+the+age+of+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930(2009).</li>
<li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Clusters%2C+Hubs%2C+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), New York, N.Y. 3743-3757 (2015).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312(2016).</li>
<li>Mitulović, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPLC+techniques+for+proteomics+analysis%E2%80%94a+short+overview+of+latest+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">HPLC techniques for proteomics analysis—a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li>
<li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314(2011).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269(2007).</li>
<li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAring%2C+L+%22Laser+Capture+Microdissection.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology</a>. Murran, G. 1723, Humana Press. 2457(2018).</li>
<li>Björk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain%3A+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li>
<li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Systems+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%2C+Neuromethods%22">Neuroproteomics, Neuromethods</a>. Li, K. W. 57, Humana Press. 13-26 (2011).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li>
<li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalkovits%2C+M+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. 103, Academic Press. 368-376 (1983).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+2+edn%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+4+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn</a>. , Academic Press. (1998).</li>
<li>RNaseZap. Ambion. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/ manuals/cms_056889.pdf</a> (2008).</li>
<li>Mueller, O. L., Samar,, Schroeder,, Andreas, RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/ applications/5989-1165EN.pdf</a> (2016).</li>
<li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li>
<li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li>
<li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li>
<li>Sampaio-Silva, F., Magalhães, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+%5Bcorrected%5D+interval%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507(2013).</li>
<li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+biological+activities+of+28%2C000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050(2019).</li>
<li>Ambion. RNAlater® Tissue Collection: RNA Stabilization Solution. ThermoFisher Sci. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf">http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf</a> (2011).</li>
<li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Este trabalho descreve uma técnica para isolar pequenas regiões específicas do cérebro, limitando a degradação do ácido nucleico e da proteína. Danos aos tecidos cerebrais acontecem rapidamente quando um organismo morre. Isto deve-se, em parte, ao rápido acúmulo de glutamato extracelular e à excitotoxicidade resultante que ocorre21. O RNA mensageiro é particularmente vulnerável à degradação22,23. A discriminação de proteínas e ácido nuclei...

Este trabalho ilustra a dissecção de regiões cerebrais congeladas para extração de ácido nucleico ou proteína de alta qualidade usando uma referência, como o Allen Mouse Brain Atlas1, como guia. Nesta técnica, os cérebros são congelados e armazenados a -80 °C para secção posterior e dissecção enquanto são mantidos em uma condição congelada. Esse processo permite ao pesquisador colher um grande número de cérebros em uma sessão e depois dissecá-los para uma coleta precisa de múltiplas regiões cerebrais.
A coleta precisa de regiões cerebrais de interesse (ROIs) é frequentemente necessária ao responder perguntas relacionadas à expressão genética e proteica. Enquanto a farmacologia, a eletrofisiologia e a optogenética podem ser usadas em roedores selvagens ou geneticamente modificados para ajudar a elucidar mudanças moleculares que sustentam comportamentos observados2,3,4, a medição de alterações induzidas em transcriptomas e proteomas é frequentemente usada para apoiar esses achados. Técnicas como a reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR), a mancha ocidental, RNAseq5,MAPSeq6 e HPLC7 são robustas e relativamente baixas de custo, permitindo que muitos laboratórios estudem alterações moleculares induzidas em pequenas regiões cerebrais22,4,5,6.
Existem várias maneiras de extrair e purificar o ácido nucleico ou proteína das regiões cerebrais8,,9,,10,,11,12. Muitos laboratórios colhem regiões cerebrais resfriando e cortando cérebros no gelo no momento da colheita9,13. Embora essa abordagem possa resultar em ácido nucleico e proteína de alta qualidade, é um pouco limitada, pois a degradação dentro do microambiente do tecido pode ocorrer a essas temperaturas. Isso pode ser particularmente verdadeiro ao tentar dissecar um grande número de animais ou ROIs em uma sessão. Manter amostras congeladas ajuda a manter moléculas alvo labile, ao mesmo tempo em que fornece ao pesquisador tempo para comparar cuidadosamente marcos em ambos os lados de cada seção no esforço de coletar amostras relativamente puras. A captura a laser é outra forma de coletar tecido para RNA ou análise de proteínas de áreas cerebrais10. Este procedimento é superior à dissecção mecânica em que os ROIs muito pequenos e de forma irregular podem ser identificados e isolados. No entanto, a captura a laser é limitada pelo uso de equipamentos caros e reagentes, é demorada e também pode ser mais suscetível à degradação da amostra.
A dissecção de microperfuração em tecidos congelados não é nova. Os primeiros trabalhos de Miklos Palkovits e outros descrevem as técnicas básicas em detalhes14,15. Esta apresentação segue em grande parte o trabalho original, com algumas melhorias para facilitar a eficiência e diminuir o gasto com os equipamentos necessários. Por exemplo, seções cerebrais são feitas em um bloco cerebral congelado em vez de em um criostato. Isso produz seções mais grossas, o que reduz o número de seções necessárias para coletar amostras de ROI. Este método também disseca amostras em uma placa de vidro congelada que se senta em gelo seco dentro de uma caixa isolada. Isso produz uma fase de subcongelamento no banco em que trabalhar. As seções dissecadas dessa forma são facilmente manipuladas, permitindo ao pesquisador comparar ambos os lados de cada seção com uma referência, a fim de limitar a contaminação de regiões fora do ROI desejado.
As vantagens deste protocolo são que 1) o cérebro é mantido em uma condição congelada durante todo o processo, o que ajuda a preservar proteína e ácido nucleico e dá ao pesquisador tempo para colher cuidadosamente os ROIs, e 2) os reagentes necessários são baratos e são encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular. Nesse processo, cérebros inteiros são seccionados em 0,5-1,0 mm em uma matriz cerebral e colocados em uma placa de vidro congelada que é continuamente resfriada com gelo seco. Marcos encontrados no Atlas do Cérebro Allen1 ou em outros atlas cerebrais16,17 são usados para identificar regiões de interesse, que são então dissecadas usando um soco frio ou bisturi. Como o tecido nunca é descongelado, as regiões colhidas dessa forma fornecem RNA de alta qualidade e proteína para análises a jusante.

<table><tbody><tr><td>0,5 mm Matriz cerebral coronal de camundongo</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 505C</td><td>Bloco de corte</td></tr><tr><td>0,5 mm Matriz cerebral coronal de rato</td><td>Braintree Scientific</td><td>BS-SS 705C</td><td>Bloco de corte</td></tr><tr><td>Punção de biópsia de 1,0 mm com êmbolo</td><td>Microscopia eletrônica Ciências</td><td>69031-01</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Dot Scientific</td><td>229443</td><td>para armazenar ROIs congelados</td></tr><tr><td>Punção de biópsia de 1,5 mm com êmbolo</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>69031-02</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia de 2,0 mm com êmbolo</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>69031-03</td><td></td></tr><tr><td>4-12% NuPage gel</td><td>Invitrogen</td><td>NPO323BOX</td><td>gel gradiente de proteína</td></tr><tr><td>Bioanalyzer System</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Sistema de análise de RNA</td></tr><tr><td>Dounce moedor de tecido</td><td>Millipore Sigma</td><td> D8938</td><td>Homogeneizador de tecido de vidro</td></tr><tr><td>Fibra de gelo</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td><td></td><td>Modelo 180</td><td>Cool lamp</td></tr><tr><td>Placas de vidro</td><td>LabRepCo</td><td>11074010</td><td></td></tr><tr><td>HALT</td><td>ThermoFisher</td><td>78440</td><td>coquetel inibidor de protease</td></tr><tr><td>Lâminas de baixo perfil</td><td>Sakura Finetek USA Inc.</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-actina de camundongo</td><td>Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma</td><td>JLA20</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>Usado na análise inicial de pureza de RNA</td></tr><tr><td>Lâmina cirúrgica nº 15</td><td>Surgical Design Inc</td><td>17467673</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Tampão de bloqueio</td><td>LiCor Biosciences</td><td>927-40000</td><td>Reagente</td></tr> <tr>de bloqueio ocidental<td>Omni Tissue Master 125</td><td>VWR</td><td>10046-866</td><td>Homogeneizador</td></tr> de <tr><td>tecidos coelho anti-KCC2 anticorpo</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>94725S</td><td>Antibody</td></tr><tr><td>RNA Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>73034</td><td>Usado para extrair RNA de pequenas amostras de tecido</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Cabo de bisturi</td><td>Excelta Corp.</td><td></td><td></td>16050103</tr><tr><td>Lâminas de barbear padrão</td><td>American Line</td><td>66-0362</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>usado para extrair RNA do tecido</td></tr></tbody></table>

coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

À medida que nossa compreensão da neurobiologia progrediu, análises moleculares são frequentemente realizadas em pequenas áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal medial (mPFC) ou núcleo accumbens. O desafio neste trabalho é dissecar a área correta, preservando o microambiente a ser examinado. Neste artigo, descrevemos um método simples e de baixo custo usando recursos prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. Este método preserva o ácido nucleico e as proteínas mantendo o tecido congelado durante todo o processo. Os cérebros são cortados em seções de 0,5 a 1,0 mm usando uma matriz cerebral e dispostos em uma placa de vidro congelada. Marcos dentro de cada seção são comparados a uma referência, como o Atlas do Cérebro do Rato Allen, e as regiões são dissecadas usando um bisturi frio ou um soco de biópsia. O tecido é então armazenado a -80 °C até o uso. Através desse processo, o mPFC de ratos e ratos, núcleo accumbens, hipocampo dorsal e ventral e outras regiões foram analisados com sucesso utilizando ensaios qRT-PCR e ocidentais. Este método está limitado a regiões cerebrais que podem ser identificadas por marcos claros.

Para validar esse método, o córtex pré-frontal medial foi coletado de camundongos machos adultos do tipo CD1 e RNA e proteína foram extraídos e caracterizados. O RNA foi analisado por eletroforese capilar. O RNA degradado apresenta uma perda na intensidade das bandas ribossômicas 28S e 18S e também mostra produtos de degradação como uma mancha entre 25 e 200 nucleotídeos(Figura 5A, amostra 1). O RNA de alta qualidade mostra bandas ribossômicas distintas com pouco ou nenhum sinal na região de...

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis. Como as regiões cerebrais são mantidas congeladas da colheita através da dissecção, as moléculas-alvo são preservadas e o pesquisador tem tempo para dissecar cuidadosamente e armazenar regiões de interesse. Identificar regiões de interesse pode inicialmente ser um desafio.O uso de marcos cerebrais comuns à medida que emergem e recuam através das seções em relação às regiões desejadas, deixará a identificação clara. Depois de remover cérebros de camundongos adultos de CD-1, o flash congela o tecido por 60 segundos em nitrogênio líquido ou isopentane. Pré-frio com gelo seco e armazene-o a menos 80 graus Celsius.24 horas antes de dissecar o tecido, coloque uma matriz cerebral limpa em uma pilha de embalagens de congelador descongeladas. E sanduiche as laterais para a matriz entre dois pacotes de congelador certificando-se de deixar aproximadamente meio centímetro entre a parte inferior das ranhuras de barbear e a parte superior das embalagens. Configure uma placa de vidro congelada para a dissecção preenchendo u

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

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Neuroscience

Neurociência

Micro dissecção de cérebro de rato em várias regiões é extremamente importante para o estudo de diferentes doenças neurodegenerativas. Este vídeo demonstra dissecção de micro-regiões do cérebro de quatro principais incluem bulbo olfatório, córtex frontal, estriado e hipocampo em tecido fresco de cérebro de rato. Dicas úteis para remoção rápida de respectivas regiões para evitar a degradação de proteínas e RNA do tecido são dadas.

Micro-dissecção de cérebro de um rato para RNA ou Extração de Proteína da região específica do cérebro

O perfilamento da expressão de RNA em regiões discretas do cérebro de camundongos exige uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecidos. Aqui é descrito um protocolo que utiliza o seccionamento coronal do cérebro e a microdissecação assistida por perfurador de tecidos. O rendimento e a qualidade do RNA total obtido a partir das amostras resultantes confirmam a utilidade do método descrito.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

Nós descrevemos um modelo de rato do transtorno de estresse pós-traumático (TEPT), que revela as alterações persistentes na função neuroendócrina eo atraso de longo prazo, resposta de medo exagerado, característico de pacientes com TEPT. O modelo animal e os métodos descritos aqui são úteis para correlacionar biomarcadores em núcleos do cérebro, que são mecanicista, mas não pode ser medido em pacientes com biomarcadores em células brancas do sangue periférico, os quais podem.

Biomarcadores em um modelo animal para Revelando correlatos neurais, hematológica e Comportamental do TEPT

Este vídeo demonstra um protocolo passo a passo detalhado para preparar seções congeladas de tecido cerebral de camundongo para análises a jusante.

Processamento de um cérebro de camundongo para análise a jusante

Nós descrevemos o uso do laser microdissection de captura para obter amostras de populações de células distintas de regiões diferentes do cérebro para análise genética e microRNA. Esta técnica permite o estudo dos efeitos diferenciais de traumatismo crânio-encefálico em regiões específicas do cérebro de ratos.

Estereotáxica guiada por Atlas Laser Microdissection de captura de regiões do cérebro afetadas por lesão traumática

Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expressão genética.

Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.

Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes

Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.

Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Aprenda a coletar regiões cerebrais congeladas de roedores para obter proteínas e RNA de alta qualidade. Este método utiliza camundongos CD-1 e preserva a integridade molecular para análises a jusante em neurociência.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

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