Visualização e quantificação de dados de citometria de alta dimensão usando Cytofast e os métodos de agrupamento upstream FlowSOM e Cytosplore
December 12th, 2019
Cytofast é uma ferramenta de visualização usada para analisar a saída do agrupamento. Cytofast pode ser usado para comparar dois métodos de agrupamento: FlowSOM e Cytosplore. Cytofast pode rapidamente gerar uma visão quantitativa e qualitativa dos dados de citometria de massa e destacar as principais diferenças entre diferentes algoritmos de agrupamento.
Os dados gerados pela citometria em massa são complexos e precisam ser visualizados de forma eficiente e simples. Citofast é um método que destaca padrões imunológicos dentro da população de células imunes e determina subconjuntos celulares que estão ligados a tratamentos clínicos ou grupos experimentais. O citofasto pode ser aplicado após qualquer método de cristal agem como FlowSOM ou Cytosplore.
Ele permitirá que você descubra um subconjunto celular que está ligado ao tratamento clínico ou a um grupo experimental. Com este método, você poderá ver a visão geral imunológica dos dados de uma forma quantitativa. Comece criando clusters com Cytosplore ou FlowSOM.
Se estiver usando Cytosplore, carregue os arquivos FCS clicando em Arquivos e abra arquivos FCS. Em seguida, selecione um cofator para transformação de ArcSinh hiperbólico quando solicitado e clique em adicionar tag de exemplo exclusiva como canal. Selecione executar HSNE para executar um nível HSNE de três e esperar que o mapa seja gerado.
No primeiro nível de HSNE, verifique as células positivas para CD161 selecionando as células positivas cd161 e clicando com o botão direito do zoom na seleção. No segundo nível, repita o procedimento para chegar ao terceiro nível com apenas eventos positivos de CD161. Uma vez que o último mapa TSNE seja gerado, salve os clusters definidos pelo Cytosplore clicando com o botão direito do mouse no mapa e escolhendo salvar clusters.
Escolha o diretório dos arquivos de saída conforme solicitado pelo Cytosplore e observe este local, pois ele será usado mais tarde para carregar arquivos FSC em R.Use um nome de caracteres simples apenas ao renomear os arquivos de saída que facilitarão a identificação e o manuseio mais fácil e selecionarão salvar. Carregue os arquivos em R com a função designada readcytosploreFCS. Para limpar os dados, remova alguns parâmetros, como tempo e antecedentes, verificando a posição da coluna relacionada aos seus parâmetros desnecessários e removendo-os da matriz.
Em seguida, reordene os marcadores para que os marcadores de linhagem sejam exibidos primeiro seguidos por marcadores funcionais. Vincule o arquivo de metadados aos dados gerados do Cytosplore carregando o metafile da planilha contendo informações clínicas. Para realizar o clustering pelo FlowSOM, carregue os dados brutos que foram previamente fechados em eventos positivos cd161 em R com a leitura.
Função flowSet. Selecione os marcadores biológicos relevantes selecionando as colunas adequadas e transformando os dados de forma ArcSinh5. Aplique um cofator de cinco escolhendo cofacter=5 na função.
Cluster os dados usando a função FlowSOM e compare FlwoSOM e Cytosplore escolhendo agrupar os dados em 10 subconjuntos iguais aos anteriormente produzidos pela Cytosplore. Em seguida, atribua cada célula ao seu subconjunto identificado e iD de amostra.Carregue o arquivo metadados em R contendo a atribuição do grupo e vincule-o aos arquivos FCS usando o código do manuscrito de texto. Crie uma lista CF com base no dataframe obtido do FlowSOM.
Em seguida, reordene os marcadores para aparecerem de forma semelhante à saída da análise cytosplore. Antes de criar os mapas de calor, gere a tabela de contagem por amostra usando o cellCount de função. Uma vez que alguns clusters contêm menos células do que outros, dimensione os dados por cluster especificando escala=true dentro da função que facilita a visualização entre as amostras.
Visualize os dados com um mapa de calor e visualize com plots de caixa gerando a contagem de células, mas não dimensionando os dados para obter a frequência de cada cluster. Por fim, visualize a intensidade de expressão dos marcadores CD45, CD11c e CD54 pelos nomes dos marcadores de observação e incluindo-os na função de plot MSI. O Citofast executa várias saídas possíveis, incluindo o mapa de calor de todos os clusters identificados na análise e com base na expressão do marcador.
O dendrograma na parte superior representa a semelhança hierárquica entre os aglomerados identificados. O painel superior exibe outro mapa de calor mostrando a quantidade relativa de subconjuntos correspondentes em cada amostra. Enquanto isso, o dendrograma à direita mostra a semelhança entre amostras baseadas em frequências subconjuntas demonstrando que o fenótipo de células assassinas naturais é moldado pelo tratamento PD-L1 três dias após a injeção.
Os mapas de calor combinados podem ser obtidos para o FlowSOM seguido por Cytofast e para Cytosplore seguido por Cytofast. O citofast também pode ser usado para apresentar os dados quantitativamente e exibir os resultados em parcelas de caixa. Outra característica que está incluída no pacote Cytofast é a função de enredo MSI que mostra o gráfico de intensidade de sinal mediano de cada marcador por grupo.
Esta função permite a detecção de mudanças globais, como aumentos na expressão de CD54 ou CD11c em células assassinas naturais do grupo tratado PD-L1. Esta técnica é uma maneira rápida de visualizar e quantificar dados e pode ser usada para descobrir novas respostas celulares após a terapia. Após este método, o pacote de teste global em R pode ser usado para testar um grupo de covariáveis para associação com variáveis de resposta.
Isso mostrará a correlação entre cada subconjunto e o desfecho clínico.
Visão geral
Cytofast é uma ferramenta de visualização projetada para analisar dados de citometria de massa, comparando métodos de agrupamento como FlowSOM e Cytosplore. Ele fornece uma visão geral rápida, quantitativa e qualitativa dos dados, destacando diferenças entre algoritmos de agrupamento.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Citometria de massa
- Visualização de dados
- Análise de agrupamento
Fundo
- A citometria de massa gera dados complexos que requerem visualização eficiente.
- Cytofast identifica padrões imunológicos dentro de populações de células imunes.
- Pode ser aplicado após métodos de agrupamento como FlowSOM ou Cytosplore.
- Compreender subconjuntos celulares ligados a tratamentos clínicos é crucial para a pesquisa.
Objetivo do estudo
- Fornecer uma ferramenta para visualizar e quantificar dados de citometria de massa.
- Comparar diferentes métodos de agrupamento de forma eficaz.
- Facilitar a descoberta de subconjuntos celulares relacionados a resultados clínicos.
Métodos utilizados
- Clusters são criados usando Cytosplore ou FlowSOM.
- Dados são transformados e limpos no R para análise.
- Agrupamento é realizado e os resultados são visualizados através de mapas de calor e gráficos de caixa.
- A função de gráfico MSI é usada para detectar mudanças globais na expressão de marcadores.
Principais resultados
- Cytofast gera mapas de calor e dendrogramas para ilustrar os resultados de agrupamento.
- Destaca o impacto de tratamentos nos fenótipos das células assassinas naturais.
- Resultados quantitativos são apresentados através de gráficos de caixa e gráficos MSI.
- A ferramenta permite visualização e quantificação rápidas de respostas celulares.
Conclusões
- Cytofast é uma ferramenta eficaz para analisar dados de citometria de massa.
- Ele melhora a compreensão dos subconjuntos de células imunes em relação aos tratamentos.
- O método suporta a descoberta de novas respostas celulares pós-terapia.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Mass cytometry generates high-dimensional immune profiling data that require rapid visualization and quantification to support target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. Cytofast enables biopharma R&D teams to compare clustering outputs from FlowSOM and Cytosplore, facilitating hypothesis testing of immune cell subset responses to PD-L1 blockade. This accelerates go/no-go decisions by providing quantitative, reproducible readouts of NK cell activation and phenotypic shifts in the tumor microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking immune cell subsets to clinical treatments or experimental groups.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative comparison of cluster abundance and marker expression across conditions.
- Predictive Confidence: Enhances confidence in target mechanisms by visualizing PD-L1-induced changes in NK cell activation markers like CD54 and CD11c.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems from clustering outputs for downstream compound screening and biomarker evaluation.
- Reproducibility: Standardizes data transformation and cleaning steps (e.g., ArcSinh transformation, parameter removal) to ensure consistent inputs across experiments.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple samples and conditions via automated R-based workflows for heat maps, box plots, and MSI plots.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models immune modulation in the tumor microenvironment, specifically NK cell responses to immunotherapy, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by quantifying immune subset frequencies and functional states prior to in vivo studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by identifying reproducible immunological patterns linked to therapeutic response.
Pipeline & Workflow Integration
Cytofast integrates into the discovery continuum from early immune profiling through lead identification to preclinical validation, enabling data-driven progression of immunotherapy candidates.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying cell subsets associated with experimental groups or clinical outcomes.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible quantitative outputs (e.g., scaled cluster frequencies) for reliable compound or modulator evaluation.
- Analytics: Provides MSI plots and heat maps that quantify marker expression intensity and subset dispersion, enabling cross-condition comparisons.
- Translational Research: Connects immune phenotyping to preclinical continuity by linking NK cell activation states to immunotherapy mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable analytical module applicable across multiple immunotherapy projects and immune monitoring campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in immune responses to checkpoint blockade.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through scripted R workflows and consistent preprocessing steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of immunotherapy targets through quantitative immune profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying immunological signatures of response that inform advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass cytometry data analysis, R programming, and clustering interpretation (FlowSOM, Cytosplore, HSNE/t-SNE).
- Depends on instrumentation for CyTOF data acquisition and computational infrastructure for R-based processing and visualization.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies, marker panels, and metadata annotation for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying workflows to different immune cell types, disease models, or therapeutic modalities beyond NK cells and PD-L1 blockade.
- Limited by the quality of upstream clustering and the need for manual optimization of parameters (e.g., cofactor, cluster number) in Cytosplore and FlowSOM steps.
