Name: Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a técnica de nucleofeção para transfecção de esporozoítos e merozoítos de Eimeria em frangos. Este método viabiliza a manipulação genética de parasitas para desenvolvimento de vacinas e estudos de função gênica.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2017YFD0501200) e pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31572507, 31772728 e 31873007).

As galinhas para todos os experimentos em animais foram alojadas e mantidas de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Agrícola da China e seguiram os Princípios Orientadores Internacionais para pesquisas biomédicas envolvendo animais. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Animais de Laboratório da Administração de Pequim.
1. Extração e purificação de esporozoitas de Eimeria spp. (por exemplo, E. tenella)
<ol><li>Liberação de esporocistos<ol>
<li>Centrífuga 1 x 107oócisos esporulados em solução de dicromomate de potássio (2,5%, m/v) a 2.300 x g por 5 minutos. Lave-os com PBS (solução tampão de fosfato) três vezes.</li>
		<li>Resuspender as pelotas com 1 mL de PBS e transfira para um tubo de 15 mL. Adicione um volume igual de contas de vidro (1 mm x 1 mm de diâmetro) e oscilar a suspensão do oócisto usando um misturador de vórtice para liberar os esporócis.</li>
		<li>Monitore a liberação de esporócitos por microscopia a cada minuto. Pare de vórtice quando mais de 90% dos oocistos são quebrados. NOTA: A maioria dos oócistos (como E. tenella, E. necatrixe E. acervulina) foram quebradas após 1 min usando a misturadora de vórtice.</li>
		<li>Transfira a suspensão de esporocista para novos tubos de 1,5 mL e centrífuga sem 1.600 x g por 5 minutos.</li>
		<li>Resuspender o precipitado com 1 mL de 50% de densidade de gradiente, combine em um tubo de 1,5 mL e centrífuga sem 10.000 x g por 1 min. NOTA: Para a composição do gradiente de densidade, consulte a Tabela 1. O gradiente de densidade é um meio coloidal à base de sílica, composto por partículas de sílica coloidal de 15-30 nm de diâmetro (23% w/w na água), que foram revestidas usando polisrolidona de polivinilida (PVP).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lançamento de esporozoitas<ol>
<li>Resuspender o precipitado com o tampão da excisão (Tabela 1) e incubar em um banho de água de 42 °C por 40-60 min para liberar os esporozoitas. Pare de incubar quando mais de 90% dos esporozoitas são liberados. Em seguida, centrífuga a 600 x g por 10 min. NOTA: Agite os tubos uma vez a cada 5 minutos durante a excisão.</li>
		<li>Resuspender a precipitação com 1 mL de 55% de solução gradiente de densidade e centrífuga em 10.000 x g por 1 min.</li>
		<li>Resuspender a precipitação com 1 mL de PBS e conte os esporozoitas usando um hemocímetro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Coleta e purificação de merozoitas de E. necatrix
NOTA: Use os frangos arbor acre (AA) com idade sacada de 7 a 14 d no experimento. As galinhas sem coccidia (n=3) foram inoculadas com 2 x 105 oocistos de E. necatrix. Às 109 h após a infecção, as aves foram sacrificadas por luxação cervical. O intestino foi removido para a coleta dos merozoitas de2ª geração. Para diferentes espécies de Eimeria, houve um tempo diferente para a coleta dos merozoitas de2ª geração: E. necatrix às 109 h, e E. tenella a 112 h pós-inoculação. Para a transfecção de E. necatrix,merozoitas são a escolha ideal, pois os segundo merozoitas são fáceis de purificar.
<ol><li>Coleção dos merozoitas de segunda geração de E. necatrix
	<ol>
<li>Corte o intestino de frango longitudinalmente, do talo de gema (no meio do intestino delgado) ao orifício ileocecal, e lave-o com PBS ou HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) suavemente três vezes em uma placa de Petri.</li>
		<li>Corte o intestino em pedaços de 0,5 cm x 0,5 cm e coloque-o em um frasco cônico com um tampão de digestão (Tabela 1). Coloque o frasco em uma batedeira magnética a 37 °C com uma barra de agitação por 30-60 min para liberar merozoitas. Após 30 min de incubação, monitore a liberação de merozoitas por exame microscópico a cada 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar os merozoitas por filtração e centrífuga.<ol>
<li>Filtrar a suspensão contendo merozoitas digeridas usando quatro camadas de gaze14, e centrífuga em 600 x g por 10 minutos.</li>
		<li>Após centrífuga, descarte o supernatante contendo detritos intestinais. Transfira a precipitação com merozoitas purificadas para tubos de 1,5 mL.</li>
		<li>Resuspender a precipitação com 1 mL de PBS e conte os merozoitas usando um hemocímetro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Nucleofection de merozoitas ou esporozoitas
<ol><li>Preparação antes da nucleofection de parasitas<ol>
<li>Prepare cerca de107 merozoitas ou esporozoitas em um tubo. Se transfectingme merozoitas, prepare 3-4 tubos.</li>
		<li>Prepare uma quantidade de DNA plasmídeo ou fragmento de PCR purificado maior ou igual a 10 μg. NOTA: O plasmídeo utilizado neste estudo contém 2 genes: proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP) e sintetizador de teumidito dihidrofolado derivado do Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS)15.</li>
		<li>Prepare 25 U de enzima de restrição. Se os plasmídeos forem linearizados, a enzima de restrição pode melhorar a eficiência da transfecção. Se os plasmídeos são circulares, omita a enzima de restrição.</li>
		<li>Prepare 85 μL de tampão de nucleofection: misture 20 μL de tampão de nucleofection I e 1 mL de tampão de nucleofection II, e use uma parte da solução. O volume do buffer total é de 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nucleofection<ol>
<li>Centrífuga a suspensão sporozoita ou merozoita em 600 x g por 10 min. Em seguida, descarte o supernatant.</li>
		<li>Na ordem a seguir, adicione 85 μL de tampão de transfecção nuclear, 10 μg de plasmídeo (fragmento pcr) e 25 U de enzima de restrição (geralmente 5 μL) no tubo de 1,5 mL contendo esporozoitas ou merozoitas.</li>
		<li>Transfira a suspensão para um copo de transfecção nuclear. Coloque o copo em um sulco de transferência nuclear.</li>
		<li>Ligue o dispositivo de nucleofection usando o botão de alimentação e selecione o procedimento de transfecção U-033. Se o dispositivo de nucleofection começar no modo Free Program Choice, saia deste modo pressionando o botão X.</li>
		<li>Quando o programa terminar, pressione o botão X do dispositivo de nucleofection, e a tela deve ser exibida OK,indicando que a nucleofection é bem sucedida.</li>
		<li>Adicione 0,5-1 mL do Medium de Águia Modificada (DMEM)8 do Dulbecco ao copo de nucleofection para parar a reação e transferir a suspensão para o tubo de 1,5 mL depois de misturar suavemente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Inoculação cloacal ou injeção endovenosa
<ol><li>Inocule os parasitas nucleotados em galinhas de 7 dias de idade. Inocula os merozoitas de E. necatrix ou os esporozoitas de E. tenella através da rota cloacal, mas inoculado E. acervulina sporozoitas via injeção intravenosa. Inocular cerca de 2 x 107 milhões de esporozoitas em cada frango, e merozoitas incoluates 107 para cada pássaro.</li>
</ol>5. Propagação e classificação FACS
<ol><li>Colete oócistos das fezes 5-9 dias após a inoculação com esporozoitas transfeccionadas. Colete os oocistos no terceiro dia após o inoculação com merozoitas transfecdas.</li>
	<li>Use classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e 150 mg/kg de pirimethamina8 para aumentar sucessivamente a relação populacional transgênica. NOTA: Use pirimethamina adicionando-a diretamente na alimentação. Para uso mais conveniente, prepare a pirimethamina solúvel em água. Dissolva 1 g de pirimethamina em 0,2 mL pf H2SO4 e 9,8 mL de pirrolido N-metil (NMP), e depois adicione 1,5 mL desta solução de estoque em 1 L de água potável para aves.</li>
</ol>6. Purificação opcional da coluna
NOTA: Se forem necessários esporozoitas ou merozoitas mais puros, há um método opcional que os purifica através de uma coluna de celulose diethylaminoethyl-52 (celulose DE-52).
<ol><li>Prepare a coluna de celulose DE-52 com pelo menos um dia de antecedência.<ol>
<li>Prepare o tampão eluente de glicina(Tabela 1). Ajuste o pH do tampão eluente de glicina de 7,6 a 8,0 e pré-aquecido para 41 °C.</li>
		<li>Adicione 2,5 g de celulose DE-52 à coluna. Adicione água e mergulhe durante a noite. Descarte o supernatante.</li>
		<li>Adicione água e mergulhe por 1h. Descarte o supernatant.</li>
		<li>Adicione 0,1 M NaOH e mergulhe por pelo menos 2 horas. Repita este passo.</li>
		<li>Substitua o supernatante por água. Depois que a celulose se fixa completamente na parte inferior (cerca de meia hora), repita este passo.</li>
		<li>Descarte o supernatant, adicione 0,1 M HCl e mergulhe por pelo menos 2 horas. Repita este passo.</li>
		<li>Descarte o supernatante e mergulhe a celulose duas vezes com tampão eluente de glicina.</li>
		<li>Meça e ajuste o pH de 7,6 a 8,0 adicionando 0,1 M HCl ou 0,1 M NaOH. NOTA: Nesta parte, o líquido tem pelo menos 5x mais volume do que o da celulose DE-52.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste a taxa de fluxo entre 40-50 r/min.</li>
	<li>Quando a sedimentação da celulose for concluída, adicione a suspensão de esporozoita ou merozoita à coluna cromatográfica. Ajuste a taxa de fluxo para 30-40 r/min. NOTA: Resuspender a precipitação de esporozoita ou merozoite com tampão eluente de glicina antes de adicionar a coluna cromatográfica.</li>
	<li>Colete com tampão eluente de glicina em tubos de 50 mL. Pare a coleta de acordo com os resultados do exame microscópico de esporozoitas ou merozoitas durante o processo de elusão.</li>
	<li>Centrífuga o tampão eluente de glicina coletado em 600 x g por 10 min. Transfira a precipitação esporozoita ou merozoite para novos tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Conte os esporozoitas ou merozoitas usando um hemocímetro.</li>
</ol>

<ol><li>Suo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+and+economic+benefits+of+Supercox%2C+a+live+anticoccidial+vaccine+in+a+commercial+trial+in+broiler+chickens+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The efficacy and economic benefits of Supercox, a live anticoccidial vaccine in a commercial trial in broiler chickens in China.</a> Veterinary Parasitology. 142 (1-2), 63-70 (2006).</li>
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</ol>

Na década de 1990, foi desenvolvido um sistema de transfecção para parasitas apicomplexos, e foi usado para estudos em parasitas eimerianos. Recentemente, a transfecção estável foi realizada em E. tenella8,9 e E. nieschulzi15. Alcançamos a transfecção estável de E. necatrix transfecting merozoites de segunda geração11. A inoculação de esporozoitas transfeccionadas de E. acervulina...

Eimeria spp. causa coccidiose, o que leva a perdas econômicas substanciais na pecuária e na indústria avícola. Embora os medicamentos anticoccidial, e até certo ponto, atenuados vacinas anticoccidial, tenham sido amplamente utilizados para o controle da coccidiose, ainda há deficiências em relação à sua resistência a medicamentos, resíduos de drogas e a potencial difusão de cepas de vacinas que recuperam a virulência1. Com o desenvolvimento da biologia molecular, a transfecção tornou-se uma ferramenta vital para estudar funções genéticas, desenvolver novas vacinas e triagem de novos alvos medicamentosos para Eimeria.
Nas últimas décadas, a transfecção foi aplicada com sucesso para parasitas apicomplexos como Plasmodium e Toxoplasma gondii2,3,4,5,6. Um estudo usando β-gal como repórter para a transfecção em E. tenella pilotou tal trabalho na Eimeria7. A transfecção de E. tenella8,9, E. mitis10, e E. acervulina (Zhang et al., dados inéditos) foi bem sucedida em galinhas. Recentemente, conseguimos transfecção usando merozoitas de E. necatrix através da nucleofection11.
Estudos mostraram que a Eimeria expressando um antígeno heterologous tem potencial para ser desenvolvida como uma vacina recombinante, como as expressas que expressam o antígeno Campylobacter jejuni A (CjaA) ou interleucina de frango 2 (chIL-2)12,13. Portanto, este protocolo descreve um estudo de nucleofection de Eimeria spp. em galinhas. O procedimento descreve a purificação de esporozoitas ou merozoitas, nucleofection com DNA plasmídeo, inoculação cloacal/injeção intravenosa e propagação in vivo para ajudar pesquisadores a iniciar estudos sobre parasitas transgênicos da Eimeria.

<table><tbody><tr><td>ATP-dissódico</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Celulose DE-52</td><td>Solarbio</td><td>C8350</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de Fluxo Constante</td><td>SHANGHAI JINGKE INDUSTRIAL CO., LTD.</td><td>HL-2B</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>MACGENE</td><td></td><td></td></tr> CM15019 <tr><td>grânulos de vidro</td><td>Sigma</td><td>Z250473-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>No. V900116</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Biotopped</td><td>G6200</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>MACGENE</td><td>CC016</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>No. V900041</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de baixa velocidade</td><td>BEIJING ERA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.</td><td>Misturador magnético DT5-2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SCILOGEX</td><td>MS-H280-Pro</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>449164</td><td></td></tr><tr><td>classificador de células MoFlo</td><td>BeckMan Coulter, US</td><td>201309995</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de nucleofecção</td><td>LONZA/amaxa</td><td>90900012 (Nucleofector II)</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td></td></tr><tr><td>Percoll (solução estoque de gradiente DG)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de taurodesoxicolato de sódio</td><td>Sigma</td><td>T0875</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>A composição do DMEM: 4,5 g/L de glicose com piruvato de sódio, L-glutamina e 25 mM HEPES.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de</td> vórtice Trypsin <td></td><td>Solarbio T8150</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beijing North TZ-Biotech Develop.co.</td><td>HQ-60-II</td><td></td></tr><tr><td>Termostato de banho-maria</td><td>Grant Instruments (Cambridge), Ltd.</td><td>GD120,GM0815010</td><td></td></tr></tbody></table>

nucleofection e in vivo propagação de parasitas de eimeria de frango

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Transfecção é um processo técnico através do qual material genético, como DNA e RNA de dupla cadeia, são entregues em células para modificar o gene de interesse. Atualmente, a tecnologia transgênica está se tornando uma ferramenta indispensável para o estudo da Eimeria, os agentes causadores da coccidiose em aves e pecuária. Este protocolo fornece uma descrição detalhada da transfecção estável em parasitas eimerianos: purificação e nucleofeção de esporozoitas ou merozoitas de segunda geração, e propagação in vivo de parasitas transfeccionados. Usando este protocolo, conseguimos transfecção em várias espécies de Eimeria. Juntas, a nucleofection é uma ferramenta útil para facilitar a manipulação genética em parasitas eimerianos.

Este protocolo foi usado para transfect parasitas eimerianos. Neste estudo, os meronts e merozoitas de2ª geração da E. necatrix foram mostrados na Figura 2A e Figura 2B,enquanto a Figura 2C e a Figura 2D mostraram os esporócitos e esporozoitas de E. tenella depois de usar as ...

Aqui, fornecemos um método para alcançar a transfecção estável de parasitas de frango Eimeria por nucleofecting esporozoitas ou merozoitas de segunda geração. Parasitas eimerianos geneticamente modificados expressando genes antigênicos heterologous poderiam ser usados como veículos de entrega de vacinas.

Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...

O estabelecimento de protocolos de transfecção para espécies de Eimeria ajudaria a avançar no estudo das funções genéticas, desenvolvendo novas vacinas e rastreando novos alvos de medicamentos para a Eimeria. Usando essa técnica, conseguimos a transfecção de várias espécies de Eimeria, e a nucleofecção é uma ferramenta útil para facilitar a aplicação da manipulação genética em parasitas eimerianos. A nucleofecção de Eimeria fornece uma referência para a transfecção de outros parasitas que não podem ser cultivados in vitro e acelerarão o estudo de sua manipulação genética.Se você tentar esta técnica pela primeira vez, você deve preparar bem todos os reagentes e seus instrumentos antes do início da transfecção para evitar embaralhar durante o experimento. A realização deste método ajuda as pessoas que se concentram na transfecção de Eimeria a ver os detalhes intrincados deste experimento. Para começar com a liberação de esporos, centrífuga uma vez 10 para os sete oocistos esporulados em solução de dicromato de potássio a 2.300 vezes g por cinco minutos.Lave-os com PBS três vezes. Resuspenda a pelota com um mililitro de PBS, e transfira a mistura para um tubo de 15 mililitros. Adicion

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Usando ponta fina micropipetas injetamos DNA plasmídeo em subdomínios de somitos frango ou tubos neural. A concentração do plasmídeo é ajustada para gerar única células transfectadas. Em seguida, permitir que as células de se transformar em populações clonais.

Transfecção única célula em embriões de galinha

Um método de transferência de genes em embriões de galinha em fases posteriores de incubação (com mais de Hamburger e Hamilton fase (HH) 22) é descrito. Este método supera as desvantagens...

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

Fonte: Yates, J. G. E., et al. Produção de Vírus Recombinante da Doença de Newcastle de Alto Título a Partir de Fluido Alantoico. J. Vis. Exp. (2022)O vídeo demonstra a purificação e concentração de partículas virais a partir de fluido alantoico clarificado coletado de ovos de galinha embrionados infectados com o vírus. Ele apresenta uma série de etapas de filtração e separação, incluindo filtração em profundidade, filtração de fluxo tangencial e ultracentrifugação em gradiente de densidade...

Purificação de Vírus do Fluido Alantoide de Ovos de Galinha Embrionados

Neste vídeo, descrevemos a nucleofecção, um procedimento de transfecção baseado em eletroporação para fornecer DNA de plasmídeo codificador de proteína repórter fluorescente na forma de esporozoíto do parasita Eimeria de galinha.

Nucleofecção de formas de parasitas: um método de transfecção baseado em eletroporação para entregar plasmídeos codificadores de proteínas fluorescentes no núcleo do esporozoíto

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An Ex-ovo Eletroporação Approach

Ovos férteis de galinha são amplamente utilizados para produzir grandes quantidades de vírus da gripe humana A, pois fornecem um sistema conveniente e econômico para provar altos rendimentos de vírus.

Propagação do vírus Influenza em ovos de galinha embrionados

O diagnóstico de infecção por Eimeria em galinhas continua exigente. As abordagens baseadas na morfologia do parasita e na patologia do hospedeiro são comumente inconclusivas, enquanto as abordagens moleculares baseadas em PCR provaram ser exigentes em custo e experiência. O objetivo deste protocolo é estabelecer a amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP) como um diagnóstico molecular direto para infecção eimeriana.

Isothermal amplificação (lâmpada), Ensaios mediada por loop para detecção específica da espécie os de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectam Galinhas

O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.

Em Ovo Injeção intravascular em embriões de frango

Este método mostra o embrião de galinha como um modelo in vivo simples e econômico para reviver o patógeno bacteriano L. monocytogenes de um estado viável, mas não cultivável (VBNC) e com potenciais usos adicionais na compreensão dos mecanismos de dormência bacteriana.

Embrião de galinha como modelo in vivo para reviver patógenos viáveis, mas não cultiváveis

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Aprenda a técnica de nucleofeção para transfecção de esporozoítos e merozoítos de Eimeria em frangos. Este método viabiliza a manipulação genética de parasitas para desenvolvimento de vacinas e estudos de função gênica.

Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango

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