Name: Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a avaliar a toxicidade pulmonar aguda de partículas inaláveis usando células A549 cultivadas na interface ar-líquido. Este método in vitro reduz a necessidade de testes em animais e oferece distribuição homogênea de aerossóis.

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Este trabalho foi apoiado pelo Ministério federal de Educação e Pesquisa (Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF, Alemanha (Grant 031A581, subprojeto A-D)) e pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Grupo de Treinamento de Pesquisa GRK 2338).

NOTA: O protocolo de um experimento de exposição cobre um período de três dias.
Dia 1º
1. Preparações gerais e cultivo de células
NOTA: A linha de células epitelia isopólicas a549 foi usada para experimentos de exposição. As células devem ser manuseadas em condições estéreis. Outras linhas celulares adequadas para o cultivo no ALI podem ser usadas.
<ol><li>Prepare o meio de crescimento (O Meio Mínimo Essencial (DMEM) de Dulbecco, complementado com soro bovino 10% fetal (FBS) e 5 μg/mL gentamicina) e o meio de exposição (DMEM, complementado com 5 μg/mL gentamicina e uma concentração final de HEPES de 100 mM).</li>
	<li>Cultura A549 células em média de crescimento a 37 °C em uma atmosfera umidificada contendo 5% co2.</li>
	<li>Cultivar células em frasco de cultura celular de 75 cm2 (T-75) em 14 mL de crescimento médio até uma confluência de 80-90% antes de se dividir (a cada 2-3 dias) e uma passagem de 35.</li>
	<li>Calcule o volume de suspensão e o número necessário de inserções de cultura celular (três inserções de cultura celular como controles de incubadora e inserções de cultura celular para exposição ao ar limpo e partículas) e placas de cultura celular.</li>
	<li>Antes da experimentação e semeade das células, adicione 2,5 mL de crescimento temperado médio a cada poço de uma placa de 6 poços. Coloque as pastilhas de cultura celular sem células cuidadosamente dentro dos poços e adicione 1 meio de crescimento de mL a cada inserção da cultura celular. Incubar as placas de 6 poços por pelo menos 30 min na incubadora (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>2. Experimentação de células
<ol><li>Soroio tampão de fosfato temperado (PBS) e meio de crescimento a 37 °C e a trippsina/EDTA (0,05%/ 0.02%) solução à temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirar o meio de cultura celular do frasco de cultura celular e lavar as células cuidadosamente com 8 mL de PBS pré-aquecido.</li>
	<li>Remova o PBS, adicione 2 mL da trippsina/EDTA (0,05%/ 0.02%) solução para as células e incubar para máxima de 6 min. na incubadora a 37 °C. Controle o processo de desprendimento o microscópio.</li>
	<li>Neutralize a atividade de experimentação adicionando 8 mL de crescimento pré-aquecido, desapego as células tocando suavemente lateralmente no frasco e resuspende as células, canalizando repetidamente para cima e para baixo.</li>
	<li>Transfira a suspensão da célula para um tubo de 50 mL. Determine o número da célula para procedimento adicional (por exemplo, semeadeamento de células, passagem de células).</li>
</ol>3. Determinação do número da célula
NOTA: A concentração celular foi determinada usando um contador de células ou câmaras de contagem.
<ol><li>Diluir 100 μL da suspensão da cultura celular em um copo cheio de 10 mL de solução isotônica. Incline o copo lentamente sem tremer.</li>
	<li>Determine o número de células viáveis/mL e viabilidade celular com base nos parâmetros de medição específicos da célula das células A549.</li>
</ol>4. Semeade das células em membranas microporosas em inserções de cultura celular
NOTA: O sistema de exposição é equipado com adaptadores especiais para permitir o uso de inserções comerciais de diferentes fornecedores e de diferentes tamanhos. Para esses experimentos de exposição, foram utilizadas placas de 6 poços e as inserções correspondentes de cultura celular. Todas as etapas de trabalho devem ser feitas em condições estéreis.
<ol><li>Fornecer meio de crescimento pré-aquecido condições de cultura celular estéreis (fluxo laminar).</li>
	<li>Prepare um volume suficientemente alto da suspensão celular com uma concentração celular de 3,0 x 105 células/mL.</li>
	<li>Depois de temperar as placas por 30 minutos, aspirar o meio dentro das pastilhas da cultura celular e sementes 1 mL de células A549 com densidade de 3,0 x 105 células/mL em cada inserção de cultura celular. Distribua a suspensão da célula por balanço suave.</li>
	<li>Incubar a cultura celular insere com a suspensão celular por 24 h (37 °C e 5% CO2).</li>
</ol>5. Prensagem de substâncias de teste
NOTA: As substâncias de teste foram pressionadas em bolos de pó usando uma prensa hidráulica totalmente controlável. O pacote de prensa pode aplicar uma força máxima de 18 kN, que é exibida como a pressão atual do óleo (na barra) do pacote de prensa. As condições de imprensa (pressão pressão pressionando, tempo de pressão) de substâncias de teste desconhecidas devem ser estabelecidas e caracterizadas em testes preliminares. Dependendo das propriedades de imprensa de uma substância, diferentes parâmetros de pressão e tipos de êmbolo prensador podem ser usados.
ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção ao pressionar substâncias tóxicas ou perigosas.
<ol><li>Defina o tempo de pressão através do controle de tempo no lado da frente da imprensa.</li>
	<li>Abra o suprimento de ar comprimido na válvula de ar comprimida. Ajuste a pressão de ar comprimida para aproximadamente 2 barras (indicada por um medidor de pressão no lado da frente) usando o regulador de pressão na parte frontal da prensa ou na válvula de ar comprimida do suprimento de ar comprimido. Retire a gaveta, pressione o botão Pressionar e leia a pressão pressão no interruptor de pressão digital.<ol>
<li>Leia apenas a pressão no regulador de pressão se a pressão é muito alta ou muito baixa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monte o recipiente da substância e certifique-se de que o cilindro de vidro esteja corretamente centrado (Figura Complementar 1). Encha o recipiente da substância com uma pequena quantidade da substância de ensaio. Insira o êmbolo no recipiente da substância e gire-o ligeiramente para frente e para trás para distribuir uniformemente o pó no recipiente.</li>
	<li>Coloque o recipiente da substância com o êmbolo na gaveta e pressione o botão Pressionar. O pistão hidráulico da prensa se move para o êmbolo e exerce uma pressão sobre a substância de teste para o tempo de pressão definido. Abra a gaveta e remova o êmbolo.</li>
	<li>Repita as etapas 5.3 e 5.4 até que o recipiente da substância esteja pelo menos metade cheio.</li>
	<li>Após a conclusão do trabalho premente, remova o recipiente da substância da gaveta e vire-o de cabeça para baixo para remover partículas soltas e depositadas.</li>
	<li>Se o recipiente da substância não for necessário no mesmo dia, feche o recipiente de substância com parafilme, a fim de evitar que a substância de teste seque ou absorva umidade.</li>
</ol>Dia 2.
6. Montagem do sistema de exposição e conexão do equipamento periférico
NOTA: Uma visão mais detalhada é fornecida na Figura 3, Figura Suplementar 2 e Figura Suplementar 3. Monte os dois módulos e o gerador de aerossol de acordo com as instruções do fabricante.
<ol><li>Coloque o sistema de exposição em uma superfície sólida e uniforme, com o abastecimento de água voltado para a frente. Conecte os controladores de fluxo de massa com o gerador de aerossol e uma garrafa de três pescoços conectada ao módulo para exposição ao ar limpo.</li>
	<li>Conecte o controlador de fluxo e a bomba de vácuo. Conecte os tubos dos controladores de fluxo com o conector do tubo nos anexos do módulo de orientação aerossol. Conecte os tubos do outro lado dos controladores de fluxo com a bomba de vácuo. Certifique-se de que o fluxo está indo do módulo através dos controladores de fluxo para a bomba de vácuo.</li>
	<li>Conecte o banho de água com o fornecimento de água de aquecimento. O abastecimento de água está indo do banho de água para a caixa de água no módulo de guia do aerossol. Conecte a saída de água do módulo de guia de aerossol com a caixa d'água do módulo de amostragem. Feche o círculo com uma conexão da saída de água do módulo de amostragem até o banho de água.</li>
	<li>Coloque o gerador de aerossol, incluindo o elutriador próximo ao módulo de exposição e conecte as linhas excedentes do elutriador e o módulo de exposição e ar limpo com grandes micro filtros, e a sucção das câmaras de exposição com pequenos micro filtros (por exemplo, filtros descartáveis). O elutriador serve como um reservatório para a atmosfera particulada gerada e retém partículas maiores que aproximadamente 7 μm, enquanto partículas menores são transportadas para o módulo de exposição.</li>
	<li>Conecte o computador usado para controlar a geração de aerossol à porta USB da parte superior do gerador de aerossol através de um cabo USB e a fonte de alimentação à porta de alimentação. Conecte a tomada de alimentação CA da unidade de alimentação a uma tomada (220-240 V).</li>
	<li>Conecte os tubos para a alimentação média e remoção com duas bombas. Em vez de usar uma bomba para a alimentação média, o meio também pode ser preenchido manualmente.</li>
</ol>7. Preparação para exposição ao ar limpo e partículas
<ol><li>Ligue a bomba de vácuo, os controladores de fluxo e o banho de água (37 °C) para um período de aquecimento de pelo menos 30 min.</li>
	<li>Abra o suprimento de ar comprimido. Defina os controladores de fluxo de massa a 8 L/min para a linha de abastecimento para o gerador de aerossol e a 3 L/min para a linha de abastecimento para a garrafa de três pescoços. Feche as guias dos controladores de fluxo de massa. NOTA: Esses valores podem variar dependendo das características da substância de ensaio.</li>
	<li>Ajuste os controladores de fluxo através do computador para regular o fluxo do módulo (1,5 L/min) e a sucção da câmara (30 mL/min).</li>
</ol>8. Teste de vazamento do sistema de fluxo radial
NOTA: A verificação de vazamento deve ser realizada vácuo e para ambos os módulos (exposição e módulo de ar limpo) a fim de garantir que o módulo tenha sido remontado corretamente.
<ol><li>Remova o adaptador de inlet e o refletor condensado do módulo orientador do aerossol. Feche os três furos de alimentação aerossol no módulo de orientação aerossol com plugues e as conexões médias de fornecimento no módulo de amostragem com retalhos de bonecos.</li>
	<li>Conecte as linhas de vácuo sem o filtro com o conector do tubo do módulo de guia de aerossol. Feche o módulo usando a roda manual e meça o valor dos controladores de fluxo. Os valores devem diminuir alguns minutos após fechar abaixo de 5 mL/min.</li>
	<li>Após a verificação de impermeabilidade, remova todos os plugues e retalhos manequim, insira o adaptador de entrada e o refletor condensado no módulo de guia de aerossol e conecte os tubos para alimentação média e remoção.</li>
</ol>9. Geração aerossol
<ol><li>Inicie o computador e o software (Figura Complementar 4). Inicie o software do gerador de aerossol clicando duas vezes no botão de partida do gerador de aerossol na área de trabalho do computador. Uma janela de mensagem aparece e pergunta se as configurações devem ser redefinidas ou não. Clique sim se o software for iniciado pela primeira vez naquele dia. Defina os valores para posição de slide e posição de raspador nos valores padrão. Clique em Não para manter os valores para posição de slide e posição de raspador ou o slide não está na posição inicial.</li>
	<li>Aparafusar um raspador de substâncias no tubo, que está localizado na abertura central da parte superior do gerador de aerossol. NOTA: Dependendo das características da prensa, podem ser utilizados tipos distintos de raspador de substâncias.</li>
	<li>Use o botão Modo de Localização se o raspador da substância não estiver na posição mais baixa.</li>
	<li>Coloque o recipiente da substância com o material de teste prensado de cabeça para baixo sobre o raspador da substância. Certifique-se de que o vidro do recipiente da substância enfrente a frente. Certifique-se de que os dois buracos no recipiente da substância cabem nos dois pinos da parte superior do gerador de aerossol. Coloque a placa de bloqueio no slot sobre o recipiente da substância e aperte o parafuso preto.</li>
	<li>Altere os valores para Alimentação (0,24 a 20 mm/h) e Rotação (1 a 800 rotações/h) para as configurações desejadas. A concentração de partículas pode ser modificada aumentando ou diminuindo o valor do Feed ou a taxa de fluxo de gás transportador.</li>
	<li>Use as setas para baixo para empurrar para baixo o deslizamento com o recipiente da substância até que o raspador da substância esteja perto da substância prensada.</li>
	<li>Abra o suprimento de ar comprimido para o gerador de aerossol com uma torneira do controlador de fluxo de massa e inicie a geração de aerossol clicando no botão Iniciar. Defina a taxa de alimentação para 15-20 mm/h para evitar longos tempos de espera.</li>
	<li>Controle a geração correta de partículas observando a nuvem de poeira fina com uma pequena lanterna (posicionada de baixo atrás do tubo de vidro do Elutriador). Altere o valor do Feed de volta às configurações desejadas quando o primeiro vapor aerossol atinge continuamente o Elutriator e clique no botão Pare.</li>
</ol>10. Experimentos de exposição
<ol><li>Inicie a oferta média com meio de exposição pré-aquecido e preencha os módulos de amostragem até que os downpipes estejam cobertos enquanto o módulo estiver aberto. Use a bomba média ou encha o médio manualmente (25 mL por câmara de exposição individual).</li>
	<li>Insira inserções de cultura celular cega (inserções sem células) no módulo de exposição. Bombeie o meio de exposição até que os canos de baixo sejam cobertos com médio e a parte inferior das pastilhas esteja em contato com o meio.</li>
	<li>Inicie o gerador de aerossol, feche o módulo de exposição e conecte o módulo de exposição à tomada do módulo de exposição do gerador de aerossol. Dê ao gerador de aerossol um tempo de chumbo de pelo menos 20-30 min antes que as exposições sejam iniciadas, a fim de permitir uma geração estável de partículas.</li>
	<li>Prepare as placas pós-incubação para os controles da incubadora e a cultura celular exposta insere durante o tempo de chumbo. Adicione 1,5 mL de crescimento médio por poço e incuba as placas da incubadora (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Após o tempo de chumbo, selar a tomada do módulo de exposição do Elutriator com um plugue de borracha e remover as pastilhas cegas. Recarregue o meio de exposição (usando a bomba ou manualmente) até que as tubulações de refogo sejam cobertas com médio. Agora, abra também a fonte de ar comprimida para o módulo de ar limpo com a torneira do controlador de fluxo de massa (3 L/min)</li>
	<li>Remova as pastilhas de cultura celular das placas de 6 poços com a ajuda de uma pinça. Despeje o meio de crescimento cuidadosamente da cultura celular insere derrubando as pastilhas e aspirando e descarte o líquido residual usando uma pipeta. Coloque as pastilhas nas câmaras de exposição de ambos os módulos, o módulo de exposição e ar limpo.</li>
	<li>Feche os módulos e inicie os experimentos de exposição conectando o módulo de exposição à tomada do módulo de exposição do gerador de aerossol e ao módulo de ar limpo ao fornecimento de gás transportador simultaneamente. NOTA:A concentração de partículas pode ser modificada aumentando/diminuindo o valor do Feed, a taxa de fluxo de gás transportador ou o tempo de exposição.</li>
	<li>Desconecte a exposição e os módulos de ar limpo após a conclusão do experimento e veda a saída do módulo de exposição.</li>
	<li>Pare o suprimento de ar comprimido e o gerador de aerossol clicando no botão Pare.</li>
	<li>Abra o módulo de exposição e ar limpo e transfira as pastilhas de cultura celular para as placas de pós-incubação preparadas usando uma pinça. Incubar as placas de 6 poços por 24 h (37 °C, 5% CO2) no ALI. NOTA: Repita as etapas 10.5 -10.10 se novos experimentos de exposição forem planejados.</li>
	<li>Levante as pastilhas de cultura celular, que são utilizadas como controles de incubadora para o ALI nas mesmas condições que a cultura celular exposta insere e incuba-as por 24 h (37 °C, 5% CO2) no ALI.</li>
	<li>Use o botão Modo de Homing para remover o recipiente da substância. Feche o software do gerador de aerossol clicando no X no canto superior direito e desligue o computador.</li>
	<li>Após a conclusão de todos os experimentos de exposição, limpe o gerador de aerossol e ambos os módulos de exposição. Feche o recipiente de substância com parafilme se a substância de ensaio for usada nos próximos dias.</li>
</ol>Dia 3.
11. Viabilidade celular
NOTA: A viabilidade celular foi determinada 24 h após o depoimento da partícula medindo a atividade mitocondrial usando o ensaio WST-1. O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. A viabilidade celular também pode ser determinada usando outros testes de viabilidade celular (por exemplo, XTT).
<ol><li>O meio de crescimento do temperamento em 37 °C e descongelar a solução WST-1 protegida da luz. Prepare um número apropriado de novas placas de 6 poços com 2,5 mL de crescimento médio por poço e incubar as placas da incubadora.</li>
	<li>Prepare a diluição wst-1 diluindo uma quantidade suficiente de WST-1 1:7 em meio de crescimento</li>
	<li>Insira as pastilhas de cultura celular 24h após a exposição nas novas placas preparadas de 6 poços. Adicione 1 mL da solução WST-1 recém-preparada a cada inserção da cultura celular. Balançar as placas cuidadosamente para distribuir a solução homogênea nas células. Incubar as placas de 6 poços com as pastilhas de cultura celular por 1 h (37 °C, 5% CO2).</li>
	<li>Transfira 100 μL do supernatante em triplicados de cada 6-well para uma placa de 96 poços. Meça a absorção em 450 nm com um comprimento de onda de referência de 650 nm usando um leitor de microplacas.</li>
</ol>12. Estatísticas
<ol><li>Normalize a viabilidade celular dos controles individuais da incubadora para 100%.</li>
	<li>Expresse a viabilidade das células expostas em relação aos controles individuais da incubadora. A citotoxicidade das substâncias de teste foi comparada aos respectivos controles da incubadora e utilizada como indicador de toxicidade.</li>
</ol>

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<li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+CULTEX+Radial+Flow+System+for+the+assessment+of+the+acute+inhalation+toxicity+of+airborne+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+vitro%22%5BJournal%5D)">Validation of the CULTEX Radial Flow System for the assessment of the acute inhalation toxicity of airborne particles.</a> Toxicology In vitro. 58, 245-255 (2019).</li>
<li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+exposure+system+generating+nebulized+aerosol+of+sulfur+mustard+in+comparison+to+the+standard+submerse+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">A novel exposure system generating nebulized aerosol of sulfur mustard in comparison to the standard submerse exposure.</a> Chemico-Biological Interactions. 298, 121-128 (2019).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. , Johns Hopkins School of Public Health. http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (1959).</li>
<li>Tsoutsoulopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+CULTEX+radial+flow+system+for+in+vitro+investigation+of+lung+damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Optimization of the CULTEX radial flow system for in vitro investigation of lung damaging agents.</a> Toxicology Letters. 244, 28-34 (2016).</li>
<li>Osman, J. J., Birch, J., Varley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+GS-NS0+myeloma+cells+to+pH+shifts+and+pH+perturbations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">The response of GS-NS0 myeloma cells to pH shifts and pH perturbations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 75 (1), 63-73 (2001).</li>
<li>OECD. Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity – Acute Toxic Class Method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , OECD Publishing. Paris. (2018).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidance+Document+on+Inhalation+Toxicity+Studies%22">Guidance Document on Inhalation Toxicity Studies</a>. , OECD Publishing. Paris. (2018).</li>
</ol>

Os autores AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT e DS não têm nada para divulgar. A empresa Cultex Technology GmbH (antiga Cultex Laboratories GmbH) produz instrumentos (por exemplo, CULTEX RFS, CULTEX DG) utilizados neste artigo. NM foi funcionário da Cultex Laboratories GmbH durante este estudo. OK é um funcionário da Cultex Technology GmbH (anteriormente Cultex Laboratories GmbH). A patente PCT/EP2009/007054 para o dispositivo é de propriedade do fundador da Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (anteriormente Cultex Laboratories GmbH).

Muitos modelos de teste de toxicidade de inalação não animal foram desenvolvidos nos últimos anos, a fim de obter informações sobre o risco de inalação aguda de partículas inaginadas e reduzir e substituir experimentos animais de acordo com o princípio3R 25.
Em termos de modelos de cultura celular, a exposição de células pode ser feita em condições submersas ou no ALI. Expor células condições submersas pode afetar as propriedades físico-químicas e, portanto, as propried...

A inalação de partículas tóxicas no ar é uma preocupação de saúde pública, levando a uma infinidade de riscos à saúde em todo o mundo e muitos milhões de mortes anualmente1,2. As mudanças climáticas, o desenvolvimento industrial em curso e a crescente demanda por energia, produtos agrícolas e de consumo têm contribuído para o aumento de doenças pulmonares nos últimos anos3,4,5,6. O conhecimento e avaliação de substâncias inaleáveis sobre sua toxicidade aguda de inalação fornecem a base para avaliação de riscos e gerenciamento de riscos, mas essas informações ainda faltam para uma ampla gama dessas substâncias7,8. Desde 2006, a legislação química da UE REACH (Registro, Avaliação, Autorização e Restrição de Produtos Químicos) exige que os produtos já existentes e recém-introduzidos sejam submetidos a uma caracterização toxicológica, incluindo a rota de inalação antes de serem colocados no mercado. Portanto, a REACH se concentra em métodos alternativos e livres de animais, na implementação do princípio "3R" (Substituição, Refinamento e Redução de experimentos animais) e no uso de modelos in vitro adequados9. Nos últimos anos, muitos modelos diferentes e adequados de teste de toxicidade de inalação não animal (por exemplo, culturas celulares in vitro, modelos lung-on-a-chip, fatias pulmonares cortadas de precisão (PCLS)) foram desenvolvidos para avaliar a toxicidade aguda de inalação de partículas aéreas5,7,10,11. Em termos de modelos de cultura celular in vitro, as células cultivadas podem ser expostas condições submersas ou no ALI (Figura 1). No entanto, a validade dos estudos de exposição submersa limita-se à avaliação da toxicidade dos compostos aéreos, especialmente as partículas. Técnicas de exposição submersas não correspondem ao humano em situação de vida; o meio de cultura celular que cobre as células pode afetar as propriedades físico-químicas e, portanto, as propriedades tóxicas de uma substância de teste12,13. Os modelos de inalação in vitro ali permitem a exposição direta das células às substâncias de teste sem interferência do meio de cultura celular com partículas de teste, imitando assim a exposição humana com maior similaridade fisiológica e biológica do que as exposições submersas12,14.
Para processos regulatórios como o REACH, no entanto, apenas modelos animais estão disponíveis no campo da toxicologia de inalação aguda, uma vez que nenhum método in vitro alternativo foi suficientemente validado e oficialmente aceito até agora14. Para isso, os modelos de teste devem ser validados de acordo com os requisitos do Laboratório de Referência da União Europeia para Alternativas ao Teste Animal (EURL-ECVAM) sobre a validade do teste15.
Um antigo estudo de pré-validação e um estudo de validação recentemente concluído demonstraram com sucesso a área de aplicação do sistema de exposição CULTEX RFS e sua transferibilidade, estabilidade e reprodutibilidade13. Este sistema de exposição é um sistema de exposição à base de células in vitro que permite a exposição homogênea das células a gases, partículas ou atmosferas complexas (por exemplo, fumaça de cigarro) no ALI devido ao seu conceito de distribuição de aerossol radial e à condução do aerossol de teste em um fluxo contínuo sobre as células16. O módulo básico deste sistema de fluxo radial consiste no adaptador de entrada, o módulo de guia aerossol com distribuição aerossol radial, o módulo de amostragem e soquete e um módulo de travamento com uma roda de mão(Figura 2). As partículas geradas atingem as células através do adaptador de entrada e do módulo de orientação aerossol e são depositadas nas pastilhas de cultura celular, que estão localizadas nas três câmaras de exposição organizadas radialmente do módulo de amostragem. O módulo de guia de aerossol, bem como o módulo de amostragem podem ser aquecidos conectando-se a um banho de água externo17.
No quadro de ambos os estudos, as células A549 foram utilizadas para todos os experimentos de exposição. A linha celular A549 é uma linha celular epitelial imortalizada humana que é muito bem caracterizada e tem sido usada como modelo in vitro para células epiteliais alveolar tipo II em inúmeros estudos toxicológicos. As células são caracterizadas por corpos lamelares, produção de surfactante e uma série de fatores relevantes para inflamação18. Eles também mostram propriedades de células epiteliais brônquicas devido à sua produção de muco19. Além disso, eles podem ser cultivados no ALI. Embora esta linha celular seja deficiente na construção de contatos celulares, o cultivo dessas células é muito mais conveniente, menos caro e os resultados derivados dela são independentes de doadores em comparação com as células primárias20.
As células A549 foram semeadas em pastilhas de cultura celular de 6 poços (membrana PET, 4,67 cm2, tamanho 0,4 mm) com densidade de 3,0 x 105 células por inserção e cultivadas por 24 h em condições submersas. As células foram então expostas em três laboratórios independentes para limpar o ar e três doses de exposição diferentes (25, 50 e 100 μg/cm2) de 20 substâncias de teste no ALI. A dose de exposição está correlacionada com o tempo de deposição, resultando em uma taxa constante de partículas de 25 μg/cm2,50 μg/cm2 e 100 μg/cm2 nas células após 15, 30 ou 60 min, respectivamente. As partículas depositadas, no entanto, não foram lavadas após o depoimento, mas permaneceram nas células por 24 h. Os tempos de depoimento das partículas foram, portanto, 15, 30 e 60 min, mas a exposição das células durou 24 h no total. A taxa de deposição das substâncias de teste foi determinada em experimentos preliminares de acordo com métodos anteriores17.
A viabilidade celular como indicador de toxicidade foi avaliada 24h após o depoimento da partícula usando um ensaio de viabilidade celular. Foi focado especial na qualidade dos controles de ar limpo, na otimização e refinamento do protocolo de exposição, na reprodutibilidade intra e interlaboratorial e no estabelecimento de um modelo de previsão (PM). Substâncias que levaram à diminuição da viabilidade celular abaixo de 50% (PM 50%) ou 75% (PM 75%) em qualquer uma das três doses de exposição foram consideradas para exercer um risco de inalação aguda. Os resultados foram então comparados com os dados existentes no vivo (com base em pelo menos um estudo confiável de acordo com a diretriz de teste da OCDE (TG) 403 ou TG 43621,22), levando a uma concordância global de 85%, com especificidade de 83% e uma sensibilidade de 88%23.
Além da medição da viabilidade celular, outros pontos finais como liberação de citocinas, exame do lisato celular ou integridade da membrana via ensaio LDH podem ser avaliados, mas não foram necessários para o estudo de validação. Assim, o sistema de exposição (por exemplo, CULTEX RFS) foi comprovado como um sistema de triagem preditivo para a avaliação qualitativa da toxicidade da inalação aguda das partículas aéreas testadas, representando um método alternativo promissor para os testes em animais. O protocolo a seguir é recomendado para experimentos de exposição a partículas transmitidas pelo ar usando este sistema de exposição.

<table><tbody><tr><td><forte>Células</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td><forte>Meio de cultura celular e suprimentos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom, Berlim, Alemanha</td><td>FG 0415</td><td>usado como meio de crescimento</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Alemanha</td><td>22320</td><td>usado como meio de exposição</td></tr><tr><td>FBS superior</td><td>Biochrom, Berlim, Alemanha</td><td>S 0615</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (10mg/mL)</td><td>Biochrom, Berlim, Alemanha</td><td>A 2710</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Th. Geyer, Renningen, Alemanha</td><td>L 0180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom, Berlim, Alemanha</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (0,05%/0,02%)</td><td>Biochrom, Berlim, Alemanha</td><td>L 2143</td><td></td></tr><tr><td>Material de cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY Cups</td><td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemanha</td><td>REF 05651794</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células</td><td>Corning, Wiesbaden, Alemanha</td><td>3516</td><td>Placas de 6 poços</td></tr><tr><td>Corning Transwell Pastilhas de cultura de células</td><td>Corning, Wiesbaden, Alemanha</td><td>3450</td><td>Inserções de 24 mm; 6-&tímido; placas de poço; 0,4 &micro; m</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASYton</td><td>Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemanha</td><td>REF 05651808001</td><td></td></tr><tr><td>Ar Comprimido (DIN EN 12021)</td><td>Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschlei&szlig; heim, Alemanha</td><td>2290152</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Abcam, Cambridge, Reino Unido</td><td>ab155902</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos + equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CASY Contador de Células</td><td>Sch&auml; rfe System GmbH, Reutlingen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termostato de circulação</td><td>LAUDA, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemanha</td><td>Ecoline RE 100</td><td></td></tr><tr><td>CULTEX HyP - Prensa Hidráulica</td><td>Cultex&reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manga de inserção CULTEX</td><td>Cultex&reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - Sistema de Fluxo Radial Tipo 2 (módulo para exposição de partículas)</td><td>Cultex&reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CULTEX RFS - Sistema de Fluxo Radial Tipo 2 (módulo para exposição ao ar limpo)</td><td>Cultex&reg; Technology GmbH, Hannover, Gemany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fornecimento CULTEX Controlador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de fluxo 0-30 ml/min (IQ-Flow)</td><td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Controlador de fluxo 0-1,5 l/min (EL-Flow)</td><td>Bronkhorst Deutschland Nord GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtros (grandes)</td><td>Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, Alemanha</td><td>LP-050</td><td>Filtro Estéril Munktell; Eficiência de retenção de partículas > 99,999%</td></tr><tr><td>Filtros (pequenos)</td><td>Parker Hannifin Corporation, Mainz, Alemanha</td><td>9933-05-DQ</td><td>Filtro descartável Balston</td></tr><tr><td>Bomba média</td><td>Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Alemanha</td><td>Ismatec IPC High Precision Multichannel Dispenser</td><td>bomba peristáltica digital</td></tr><tr><td>Microplate Reader Infinite M200 Pro</td><td>Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba Vakuum</td><td>KNF, Freiburg, Alemanha</td><td>N86 KT.18</td><td></td></tr><tr><td>V&ouml; controlador de fluxo de massa gtlin 0,2-10 l/min</td><td>TrigasFI GmbH</td><td>V&ouml; regulador compacto gtlin red-y, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>LAUDA, Lauda-K&ouml; nigshofen, Alemanha</td><td>Ecoline Staredition RE 104</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na interface ar-líquido

Assessment of the Acute Inhalation Toxicity of Airborne Particles by Exposing Cultivated Human Lung Cells at the Air-Liquid Interface

Aqui, apresentamos um sistema de exposição in vitro modular especialmente projetado que permite a exposição homogênea de células pulmonares humanas cultivadas no ALI a gases, partículas ou atmosferas complexas (por exemplo, fumaça de cigarro), fornecendo assim fisiofilógico realista exposição da superfície apical da região aleolar humana ao ar. Em contraste com modelos de exposição sequencial com orientação linear de aerossol, o design modular do sistema de fluxo radial atende a todos os requisitos para a geração contínua e o transporte da atmosfera de teste para as células, distribuição homogênea e deposição de as partículas e a remoção contínua da atmosfera. Este método de exposição é projetado principalmente para a exposição de células a partículas aéreas, mas pode ser adaptado à exposição de aerossóis líquidos e gases altamente tóxicos e agressivos, dependendo do método de geração de aerossóis e do material dos módulos de exposição .
Dentro do quadro de um estudo de validação recém-concluído, este sistema de exposição foi comprovado como um método de triagem transferível, reprodutível e preditivo para a avaliação qualitativa da citotoxicidade pulmonar aguda das partículas transmitidas pelo ar, assim potencialmente reduzindo ou substituindo experimentos animais que normalmente forneceriam essa avaliação toxicológica.

O CULTEX RFS é um sistema de exposição modular especialmente projetado in vitro que permite a exposição direta e homogênea das células no ALI. Dentro de um antigo estudo de pré-validação, a aplicabilidade geral desse sistema de exposição e sua transferibilidade, estabilidade e reprodutibilidade foram demonstradas com sucesso. Em um recente projeto de pesquisa financiado pelo Ministério da Educação e Pesquisa da Alemanha, o sistema de exposição foi validado com sucesso e estabelecido como ...

Apresentamos um sistema robusto, transferível e preditivo de exposição in vitro para a triagem e monitoramento de partículas transmitidas pelo ar sobre sua citotoxicidade pulmonar aguda, expondo células pulmonares humanas cultivadas na interface ar-líquido (ALI).

Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido

Here, we present a specially designed modular in vitro exposure system that enables the homogenous exposure of cultivated human lung cells at the ALI to ...

A triagem de partículas transmitidas pelo ar sobre a citotoxicidade pulmonar aguda expondo células pulmonares humanas cultivadas no ALI usando este sistema de exposição in vitro pode ajudar a reduzir experimentos em animais. A principal vantagem deste sistema de exposição é o conceito de distribuição de aerossol radial que leva a uma distribuição homogênea e à posição das partículas sobre as células. Antes de semear as células, adicione 2,5 mililitros de meio de crescimento temperado a cada poço de uma placa de seis poços.Coloque as pastilhas de cultura celular sem células cuidadosamente dentro dos poços e adicione um mililitro de meio de crescimento a cada inserção de cultura celular. Incubar as placas por 30 minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Após a experimentação das células, diluir 100 microliters da suspensão da cultura celular em um copo cheio de 10 mililitros de solução isotônica.Incline o copo lentamente sem tremer. Em um contador celular, determine o número de células viáveis por mililitro e viabilidade celular com base nos parâmetros de medição específicos da célula das células A549. Após o tempero da placa, aspire o meio dentro das inserções da cultur

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este protocolo destina-se a demonstrar o método de exposição de culturas de células a produtos químicos tóxicos inalados. Exposição de diferenciado interface ar-líquido (LPA) culturas de células epiteliais das vias aéreas oferece um modelo único de exposição das vias aéreas de gases tóxicos como o cloro. Nesse artigo, descrevem efeito de exposição ao cloro em culturas de interface ar-líquido de células epiteliais e de cultura submersa de cardiomiócitos. Em sistemas de exposição in vitro...

A cultura in vitro modelo celular para Toxic Chemical Testing Inhaled

O objetivo deste protocolo é expor modelos organotípicos de tecido brônquico e nasal 3D humanos à fumaça de cigarro convencional (CS) na interface ar-líquido. O impacto do CS nos tecidos é então investigado usando um ensaio de atividade do citocromo P450, uma medição de batimento de cílios e uma abordagem de biologia de sistemas.

Avaliação do Impacto da exposição repetida de Organotípicas 3D brônquica e cultura nasal Tissue Models para Whole fumo do cigarro

Tendo em conta o princípio dos 3R, modelos respiratórios como alternativas para estudos animais estão evoluindo. Especialmente para a avaliação dos riscos das substâncias respiratórias, há uma falta de ensaios adequados. Aqui, descrevemos o uso de fatias de pulmão humano de precisão de corte para a avaliação de substâncias no ar.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Aqui, apresentamos um protocolo para realizar exposições de aerossol de celular portátil e medir a resposta celular. O método utiliza células, crescidas na interface ar-líquido, imitando a fisiologia na vivo . Observou-se resposta celular de aerossóis de nanopartículas de cobre como estresse oxidativo através da geração de espécies reativas de oxigênio e citotoxicidade como liberação de lactato desidrogenase.

Um novo portátil em Vitro Cassette exposição para amostragem de aerossol

Apresentado aqui é um protocolo para isolamento do monócito sanguíneo humano primário, bem como sua diferenciação em macrófagos e células dendríticas e montagem com células epiteliais em um modelo pulmonar humano multicelular. Respostas biológicas de coculturas compostas de células imunes diferenciadas de monócitos recém-isolados ou descongelados, após exposição a estímulos proinflamatórios, são comparadas.

Modelo Alveolar Humano Multicelular Composto por Células Epiteliais e Células Imunes Primárias para Avaliação de Riscos

Descrito é o método de cultura celular e exposição de um modelo brônquico in vitro para exposição realista e repetida de inalação a partículas para testes de toxicidade.

Um modelo epitelial de interface ar-líquido para exposição de inalação realista e repetida a partículas aéreas para testes de toxicidade

O presente protocolo descreve células pluripotentes pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tipo 2 (iAT2s). Essas células podem ser cultivadas como esferas de auto-renovação na cultura 3D ou adaptadas à cultura de interface ar-líquido (ALI).

Gerando esferas 3D e culturas de interface ar-líquido 2D de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem

Estabelecemos um modelo in vitro padronizado para estudar a exposição ao vapor de cannabis na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma abordagem sistemática para examinar os impactos da cannabis vaporizada, abordando o crescente interesse em vaporizadores de cannabis como uma alternativa ao fumo.

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Células epiteliais pulmonares podem ser isolados do trato respiratório de camundongos e cultivadas em ar-líquido interface como um modelo de epitélio respiratório diferenciado. Um protocolo é descrito para o isolamento, cultura e expondo essas células à fumaça de cigarro mainstream, a fim de estudar as respostas moleculares para esta toxina ambiental.

Isolamento de rato células epiteliais respiratórias e exposição à fumaça de cigarro Experimental da Air interface líquido

O objetivo deste protocolo é para isolar as células endoteliais que revestem os vasos linfáticos humanos quisto-como malformação linfática e foreskins usando células activadas por fluorescência (FACS). Cultura de células subsequente e expansão destas células permite um novo nível de sofisticação experimental para estudos genéticos, proteomic, funcionais e diferenciação celular.

Isolamento de linfático humano endotelial por multi-parâmetro activadas por fluorescência celular

Aprenda a avaliar a toxicidade pulmonar aguda de partículas inaláveis usando células A549 cultivadas na interface ar-líquido. Este método in vitro reduz a necessidade de testes em animais e oferece distribuição homogênea de aerossóis.

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Avaliação da toxicidade da inalação aguda de partículas transmitidas por expor células pulmonares humanas cultivadas na Interface Ar-Líquido

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