Name: Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Aprenda a triagem de inibidores da pirofosfatase ligada à membrana de Thermotoga maritima usando a reação do azul de molibdênio em placas de 96 poços. Este método colorimétrico é econômico, simples e estável para pesquisa em bioquímica.

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Este trabalho contou com o apoio das subvenções da Fundação Jane e Aatos Erkko e do BBSRC (BB/M021610) a Adrian Goldman, a Academia da Finlândia (nº 308105) para Keni Vidilaseris (nº 310297) a Henri Xhaard, e (nº 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, e os Fundos de Helsínquia da Universidade de Pesquisa a Gustav Boije af Gennäs. Os autores agradecem a Bernadette Gehl por sua ajuda técnica durante o projeto.

1. Preparação de proteínas
NOTA: A expressão e purificação de TmPPase foi descrita em outros lugares13.
<ol><li>Prepare 10 mL da solução tampão de reativação contendo 20 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), e 0.05% dodecyl maltoside (DDM).</li>
	<li>Prepare 10 mL da mistura de reação contendo 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl2,333 mM KCl, e 67 mM NaCl. NOTA: Mg2+ é necessário para chelate o pirofosfato como o substrato de mPase, K+ é necessário para aumentar a atividade enzimática como TmPPase é um mPase dependente de potássio, e Na+ é necessário para a atividade enzimática durante a translocação de íons de sódio por TmPPase.</li>
	<li>Prepare 30 mg/mL lipossomos para reativação enzimática.<ol>
<li>Adicione 10 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8.0 com 1 mM DTT a 0.3 g de L-α-phosphatidylcholine de soja para 10 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8.0 com 1 mM DTT.</li>
		<li>Coloque o lipossoma no gelo, e sonicate com intervalo de pulso de 1 segundo por 1 minuto, faça uma pausa por 1 minuto, e repita até que a solução se torne amarelo transparente.</li>
		<li>Aliquot os lipossomos, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C até usado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reativar a enzima.<ol>
<li>Misture 40 μL da solução de lipossomos com 22,5 μL de 20% DDM.</li>
		<li>Aqueça a mistura em 55 °C por 15 min e deixe esfriar a temperatura ambiente.</li>
		<li>Adicione 36,5 μL da solução tampão de reativação, misture e adicione 1 μL de proteína concentrada (13 mg/mL) para fazer uma concentração total de 0,13 mg/mL. NOTA: A proteína é geralmente congelada em alíquotas de 10 μL após a purificação e descongelada no gelo antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tome 20 μL da enzima reativada e adicione a 1.480 μL da mistura de reação, em seguida, misture suavemente. NOTA: A adição da enzima reativada à mistura de reação deve ser realizada pouco antes de ser usada.</li>
</ol>2. Preparação composta
<ol><li>Dissolva os compostos em dimetil sulfoxida (DMSO) para fazer soluções de estoque de 25 a 100 mM em 50-200 μL, com base na disponibilidade dos compostos. NOTA: Todos os compostos usados aqui(Figura 2A)foram publicados anteriormente9. Se a solubilidade composta for baixa, a concentração de estoque pode ser ajustada em conformidade.</li>
	<li>Prepare três concentrações diferentes de cada composto na água. NOTA: As concentrações finais na mistura de reação serão 1, 5 e 50 micromolar ou 1, 5 e 20 micromolar para compostos solúveis e com moderação solúveis, respectivamente.<ol>
<li>Diluir a solução de estoque com água para 1 mL em microtubos para dar 2 μM, 10 μM e 100 μM para compostos solúveis, ou alternativamente 2 μM, 10 μM e 40 μM para compostos parparingly solúveis.</li>
		<li>Vortex a solução composta instantaneamente após a diluição da solução de estoque para a mistura adequada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verifique se há agregação composta usando um nefrômetro. NOTA: Este foi estudado como triplicados em três concentrações (1 μM, 5 μM e 20 μM) e normalizado ao espaço em branco em uma placa de 96 poços.<ol>
<li>Dispense 75 μL da mistura da reação em cada poço usando uma pipeta multichannel.</li>
		<li>Adicione 75 μL de cada composto (para o espaço em branco, use 75 μL de água em vez disso) e misture por pipetting cima e para baixo 5 ×.</li>
		<li>Medir cada poço em 300 V usando um nephelometer microplate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Reagentes para a preparação do ensaio
<ol><li>Prepare a solução arsenite-citrate.<ol>
<li>Pese 5 g de arsenita de sódio e 5 g de dihydrate de citrato trissódico. CUIDADO: O arsenite do sódio é tóxico, assim use o equipamento protetor apropriado e segure com cuidado especial. Como precaução, não segure antes que todas as precauções de segurança necessárias tenham sido lidas e compreendidas. Segure apenas em um capô de fumaça, a fim de não inalar poeira / vapores do composto ou sua solução (s). Se inalado, mova-se para o ar fresco e obtenha atendimento médico. Use óculos de segurança químicos adequados, luvas de proteção e roupas para evitar a ingestão e contato olho/pele. Se engolido, ligue imediatamente para um centro de intoxicação ou médico/médico. Se ele fica na pele ou no olho (s), lave com muita água e obter atenção médica.</li>
		<li>Dissolva-se em 100 mL de água.</li>
		<li>Adicione 5 mL de ácido acético glacial, misture e adicione água a 250 mL.</li>
		<li>Armazenar à temperatura ambiente protegido da luz. NOTA: A solução é estável por mais de um ano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a solução A e a solução B.<ol>
<li>Para solução A, adicione 10 mL de gelo frio 0,5 M HCl para 0,3 g de ácido ascórbico. Dissolva o ácido ascórbico por vórtice.</li>
		<li>Para solução B, adicione 1 mL de água gelada a 70 mg de tetrahidrato e vórtice de amônio heptamolybdate para dissolver. NOTA: Armazenar ambas as soluções no gelo até o uso. Para a consistência do resultado do ensaio, ambas as soluções podem ser armazenadas no gelo por um máximo de uma semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o padrão de fosfato (Pi)com a concentração de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM para calibração.<ol>
<li>Adicione 0 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL de 5 mM Na2HPO4 desidratar a quatro microtubos contendo 370 μL da mistura de reação.</li>
		<li>Cubra até 1 mL com água.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ensaio de atividade para uma placa de 96 poços
NOTA: Veja a Figura 1 para o fluxo de trabalho esquemático do ensaio.
<ol><li>Adicione 1 mL de solução B a 10 mL de solução A, misture vórtice e guarde a solução no gelo. NOTA: Esta solução deve ser transparente e amarela. Mantenha a solução A + B no gelo por pelo menos 30 minutos antes do uso. No entanto, use a solução dentro de 3 h, pois vai mal depois de armazenamento a longo prazo.</li>
	<li>Adicione 40 μL de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM Pi padrão para as tiras de tubo em triplicado usando uma pipeta multicanal. NOTA: A mistura de reação sem Pi adicionado será usado como um espaço em branco.</li>
	<li>Adicione 25 μL de solução composta para as tiras de tubo usando uma pipeta multicanal. NOTA: Cada composto tem três concentrações diferentes em triplicado, o que é suficiente para a estimativa inicial da concentração inibil máxima (IC50). Para uma determinação ic50 mais precisa, oito concentrações compostas diferentes podem ser usadas. Para a enzima desinibida, a solução composta é substituída por quantidade igual de água. Como controles positivos foram utilizados 2,5 μM, 25 μM e 250 μM de imidodifosfato (IDP).</li>
	<li>Adicione 15 μL de mistura de solução mPPase para as tiras de tubo (exceto para os tubos contendo Pi padrão) usando uma pipeta multicanal.</li>
	<li>Selar as tiras do tubo com uma folha de vedação adesiva. Corte a folha de vedação para separar cada tira de tubo.</li>
	<li>Pré-incubar as amostras para 5 min a 71 °C. Coloque as amostras no bloco de aquecimento com intervalo de 20 s entre cada tira, a fim de minimizar o consumo de tempo durante as etapas subsequentes.</li>
	<li>Para cada tira, abra a vedação adesiva. Adicione 10 μL de 2 mM pirofosfato de sódio dibasic usando uma pipeta multicanal e misture por pipetting cima e para baixo para 5 ×. Selar a tira de tubo novamente usando a mesma vedação. NOTA: Esta etapa pode inicialmente ser difícil de realizar em 20 s; no entanto, ele vai se tornar mais fácil depois de alguns ensaios.</li>
	<li>Incubar a 71 °C por 5 min.</li>
	<li>Coloque as amostras no aparelho de resfriamento com intervalo de 20 s entre cada tira. Deixe esfriar por 10 min, mas centrífuga cada tira brevemente após 5 min de resfriamento, para decantar gotas de água a folha de vedação, em seguida, colocá-lo de volta para o aparelho de resfriamento e remover o vedação. NOTA: O aparelho de refrigeração pode simplesmente ser feito colocando uma placa PCR de 96 poços em uma placa de Petri de poliestireno (tamanho 150 mm × 15 mm) cheia de água e congelada por pelo menos 1 h. O aparelho deve ser retirado do congelador cerca de 5 minutos antes do início do ensaio. Não tire o aparelho de resfriamento logo antes do resfriamento da amostra, pois congelará a mistura de reação e dificultará o desenvolvimento da cor.</li>
	<li>Após 10 min de resfriamento, adicione 60 μL de solução A + B, misture por pipetting para cima e para baixo para 5 × e manter as tiras de tubo no aparelho de refrigeração por 10 min.</li>
	<li>Adicione 90 μL da solução arsenite-citrato e mantenha em temperatura ambiente por pelo menos 30 min para produzir uma cor azul estável. CUIDADO: Devido à sua toxicidade todas as soluções que contenham arsenita de sódio devem ser tratadas com cuidado extra em todos os tempos. Assim, a adição de solução arsenite-citrato deve ser feita em um capô de fumaça.</li>
	<li>Dispense 180 μL de cada mistura de reação em uma clara microplaca de poliestireno de 96 poços.</li>
	<li>Medir a absorção de cada poço em 860 nm usando um espectrômetro microplaca.</li>
</ol>5. Análise de resultados
<ol><li>Média dos triplicados de cada amostra e dospp P i. Em seguida, subtraia com o espaço em branco para eliminar o sinal de fundo.</li>
	<li>Faça uma curva de calibração traçando a absorção (A860)valores contra a quantidade de Pi padrão (nmol) e realizar uma regressão linear para obter a função de linha de tendência usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ01a.jpg">
</li>
	<li>Calcule a quantidade de fosfato (nmol) liberada da reação enzimática com base na fórmula de regressão linear acima.</li>
	<li>Calcule a atividade específica usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ02a.jpg"> onde nPi é a quantidade de fosfato liberado da reação (nmol), t é o tempo de reação (min), e mTmPPase é a quantidade do TmPPase puro usado no ensaio (mg).</li>
	<li>Calcule a atividade percentual para cada concentração inibidora usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ03a.jpg"> onde SAiisa atividade específica de uma amostra com inibidor e SAun é a atividade específica da amostra desinibida.</li>
	<li>Calcule o logIC50 (estimativa) e IC50 (estimativa) com um ajuste de regressão não linear da curva de dose-resposta de quatro parâmetros usando a seguinte fórmula: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60619/60619equ04a.jpg"> onde X é registro de concentração (μM), Y é atividade (%), Top e Bottom são planaltos na mesma unidade que Y (100% e 0%, respectivamente), logIC50 tem as mesmas unidades de registro como X, e HillSlope = fator de inclinação ou encosta, que é unitless. NOTA: Software(Tabela de Materiais)é usado para a montagem. Use a concentração de 0,01 μM (em vez de 0,00 μM) para a amostra sem inibidor, pois o logarithm de zero não é definido.</li>
</ol>

<ol><li>Terstappen, G. C., Reggiani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+research+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">In silico research in drug discovery.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 22 (1), 23-26 (2001).</li>
<li>Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+the+exploitation+of+novel+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in the exploitation of novel drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).</li>
<li>Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+membrane+pyrophosphatases%3A+a+novel+drug+target+for+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens.</a> AIMS Biophysics. 3 (1), 171-194 (2016).</li>
<li>Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrophosphate-Fueled+Na%2B+and+H%2B+Transport+in+Prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77 (2), 267-276 (2013).</li>
<li>Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%2B-PPases%3A+yesterday%2C+today+and+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">H+-PPases: yesterday, today and tomorrow.</a> IUBMB Life. 59 (2), 76-83 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuolar-H%2B-pyrophosphatase+%28TgVP1%29+is+required+for+microneme+secretion%2C+host+cell+invasion%2C+and+extracellular+survival+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 93 (4), 698-712 (2014).</li>
<li>Lemercier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyrophosphatase+regulating+polyphosphate+metabolism+in+acidocalcisomes+is+essential+for+Trypanosoma+brucei+virulence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (5), 3420-3425 (2004).</li>
<li>Belogurov, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+pyrophosphatase+of+Thermotoga+maritima+requires+sodium+for+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity.</a> Biochemistry. 44 (6), 2088-2096 (2005).</li>
<li>Vidilaseris, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetry+in+catalysis+by+Thermotoga+maritima+membrane-bound+pyrophosphatase+demonstrated+by+a+nonphosphorus+allosteric+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor.</a> Science Advances. 5 (5), (2019).</li>
<li>Lin, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+membrane-embedded+H%2B-translocating+pyrophosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase.</a> Nature. 484 (7394), 399-403 (2012).</li>
<li>Fiske, C. H., Subbarow, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+colorimetric+determination+of+phosphorus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The colorimetric determination of phosphorus.</a> Journal of Biological Chemistry. 66 (2), 375-400 (1925).</li>
<li>Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molybdenum+blue+reaction+for+the+determination+of+orthophosphate+revisited%3A+Opening+the+black+box%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box.</a> Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).</li>
<li>Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+expression+and+purification+of+membrane-bound+pyrophosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases.</a> Protein Expression and Purification. 79 (1), 25-34 (2011).</li>
<li>Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+orthophosphate+determination+of+thermostable+membrane-bound+pyrophosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity.</a> Analytical Methods. 10 (6), 646-651 (2018).</li>
<li>He, Z. Q., Honeycutt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+molybdenum+blue+method+for+orthophosphate+determination+suitable+for+investigating+enzymatic+hydrolysis+of+organic+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+in+Soil+Science+and+Plant+Analysis%22%5BJournal%5D)">A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates.</a> Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36 (9-10), 1373-1383 (2005).</li>
<li>Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorinated+tyrosine+phosphates+to+probe+the+substrate+specificity+of+the+low+molecular+weight+phosphatase+activity+of+calcineurin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (28), 14932-14937 (1985).</li>
<li>Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+strategy+to+determine+the+dependence+of+membrane-bound+pyrophosphatases+on+K%2B+as+a+cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor.</a> Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem simples de inibidores para pirofosfatase ligada à membrana de T. maritima em um formato de placa de 96 poços baseado em Vidilaseris et al.14. Este protocolo é barato e baseado em ácido 12-fosphomolybdic, que é formado a partir de ortopofosfato e molibdênio em condições ácidas e reduzido a espécies de fosphomolybdenum com uma cor azul distinta12. Este método é preferido em relação a outros protocolos, como o ensaio ...

Aproximadamente 25% do total de proteínas celulares são proteínas da membrana e cerca de 60% delas são alvos de drogas1,2. Um dos alvos potenciais da droga3, pirofosfofases ligados à membrana (mPPases), são enzimas diméricas que bombeiam próton e/ou íon de sódio através da membrana por hidróforadede de pirofosfato em dois ortopofosfatos4. mPPases podem ser encontrados em vários organismos5, como bactérias, archaea, plantas e parasitas protistas, com exceção de seres humanos e animais4. Em parasitas protistas, por exemplo Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases são essenciais para a virulência parasita6 e nocaute desta expressão nos parasitas levam à incapacidade de manter pH intracelular após a exposição ao pH básico externo7. Devido à sua importância e falta de proteína homóloga presente nos vertebrados, os mPPases podem ser considerados como alvos potenciais de medicamentos para doenças protistais3.
A triagem in vitro dos inibidores de mPase neste trabalho é baseada em um sistema modelo TmPPase. TmPPase é um bombeamento de íons de sódio e mPase dependente de íons de potássio de T. maritima e tem sua atividade ideal em 71 °C8. Os benefícios desta enzima são, por exemplo, a sua facilidade na produção e purificação, boa estabilidade térmica e alta atividade específica. TmPPase mostra alta semelhança, além da conservação completa da posição, bem como a identidade de todos os resíduos catalíticos para os mPPases protista3,9 e para a estrutura resolvida de Vigna radiata10 mPPase. As estruturas disponíveis de TmPPase em diferentes conformações também são úteis para experimentos de design de drogas baseados em estrutura (como triagem virtual e design de novo).
Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem de inibidores de TmPPase em um formato de placa de 96 poços (Figura 1). O protocolo é baseado no método colorimétrico da reação azul molibdênio, que foi desenvolvida pela primeira vez por Fiske e Subbarow11. Este método envolve a formação de ácido 12-fosphomolídico de ortopofosfato e molibdênio condições ácidas, que é então reduzida para dar a espécie de fosphomolybdenum de cor azul característica12.

<table><tbody><tr><td>Folha de vedação adesiva</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0558</td><td></td></tr><tr><td>Heptamolibdato de amônio tetrahidratado</td><td>Merck</td><td>F1412481 636</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95212-250G</td><td></td></tr><tr><td>BioLite 96Well Multidish Thermo</td><td>Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sulfóxido (DMSO)</td><td>Merck</td><td>1167431000</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de tubo de PCR de 8 poços 0,2 ml sem tampas (120)</td><td>Genética Nippon</td><td>FG-028</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil maltosídeo (DDM)</td><td>Melford</td><td>B2010-100G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1009901001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Merck</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidodifosfato de sódio sal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0631-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-&alfa;-Fosfatidilcolina de lecitina de soja</td><td>Sigma</td><td>429415-100GM</td><td></td></tr> Cloreto de magnésio Placas <tr><td>de PCR de 96 poços</td><td></td><td></td> 8147330500 Sigma-Aldrich Multiplate Bio-Rad MLL9651 <td></td></tr><tr><td>MultiSkan Go</td><td>Thermo Scientific</td><td>10680879</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Nepheloskan <td></td></tr><tr><td> Ascent (Tipo 750)</td><td>Labsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno (tamanho 150 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6 software</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QBT2 Bloco de aquecimento</td><td>Grant Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meta-arsenito de sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td>12897692</tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico (Pi)</td> <td>Sigma</td><td>S0876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato de sódio dibásico</td><td>Fluka</td><td>71501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado</td><td>Fluka</td><td>71404-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Pirofosfatases ligadas à membrana (mPPases) são enzimas diméricas que ocorrem em bactérias, arqueais, plantas e parasitas protistas. Estas proteínas acovardam o pirofosfato em duas moléculas de ortofosfato, que é acoplado com próton e / ou íon de sódio bombeamento através da membrana. Como não existem proteínas homólogas em animais e humanos, os mPPases são bons candidatos na concepção de potenciais alvos de drogas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a tela para inibidores de mPase utilizando a reação azul molibdênio em um sistema de placa de 96 poços. Usamos mPase da bactéria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como uma enzima modelo. Este protocolo é simples e barato, produzindo um resultado consistente e robusto. Leva apenas cerca de uma hora para concluir o protocolo de ensaio de atividade desde o início do ensaio até a medição de absorção. Uma vez que a cor azul produzida neste ensaio é estável por um longo período de tempo, ensaio (s) subseqüente pode ser realizado imediatamente após o lote anterior, e a absorção pode ser medida mais tarde para todos os lotes de uma só vez. A desvantagem deste protocolo é que ele é feito manualmente e, portanto, pode ser desgastante, bem como exigir boas habilidades de pipetting e tempo de manutenção. Além disso, a solução arsenite-citrate usada neste ensaio contém arsenita de sódio, que é tóxica e deve ser tratada com as precauções necessárias.

Neste protocolo, oito compostos (1-8) foram testados(Figura 2A)juntamente com o BID, inibidor comum de pirofosfatases, como controle positivo. Cada composto foi testado em três concentrações diferentes (1 μM, 5 μM e 20 μM) em triplicado. O fluxo de trabalho da triagem é representado na Figura 1,a partir da amostra e preparação do reagente até a medida de absorção em 860 nm.
Ao final deste protocolo, após a adição da solução A + B e ar...

Aqui apresentamos um método de triagem para inibidores de pirofosfatase ligado à membrana (da Thermotoga maritima)com base na reação azul molibdênio em um formato de placa de 96 poços.

Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Nosso protocolo funciona como uma ferramenta para encontrar compostos que inibem a des atividade da pirofosfatase ligada à membrana. E esses inibidores podem ser usados no tratamento de várias doenças parasitárias. Este protocolo é barato e simples produzindo cores estáveis por um longo tempo sem mostrar qualquer interferência na presença de alta concentração fosfolipídid necessária para a reativação da enzima.Prepare 10 mililitros da solução tampão de reativação, contendo 20 mililitros M-E-S em PH 6,5, 3,5% de volume de glicerol, dois milimões D-T-T e 0,05% D-D-M. Prepare 10 mililitros do misturador de reação, contendo 200 mililitros tris em PH oito. Oito cloreto de magnésio mililitro, 333 cloreto de potássio milimil, e 67 cloreto de sódio mililitro.Para preparar 30 miligramas por lipossomos mililitros para reativação enzimápica. Primeiro, adicione 10 mililitros de 20 mililamores de cloridrato tris em PH oito, com um mililitro D-T-T a 0,3 gramas de L alfa fosphatidylcolina de soja. Coloque o lipossomo no gelo e sonicato com um segundo pós-intervalos por um minuto.Pare por um minuto e repita até que a solução se torne amarela transparente. Alíquotar os lipossomos em 100 microliters, congelar o nitrogênio líquido e armazenar a 80 graus Celsius negativos até ser usado. Para reativar a enzima, descongele a solução lipossa à temperatura ambiente.Misture 40 microliters da solução liposso com 22,5 microliters de 20% D-D-M. Mantenha a mistura a 55 graus Celsius por 15 minutos. E deixe esfriar até a temperatura ambiente.Em seguida, adicione 36,5 microliters da solução de tampão de reativação. Misture. E adicione um microliter de proteína concentrada para fazer uma concentração total de 0,13 miligramas por mililitro. Em seguida, transfira 20 microliters da enzima reativada para 1480 microliters da mistura de reação.Misture suavemente e use imediatamente. Primeiro, dissolver os compostos em D-M-S-O para fazer soluções de estoque de 50 mililitros em 200 microliters. Para compostos solúveis diluem a solução de estoque com água para um mililitro em micro tubos, para dar dois, 10 e 100 micromolar.Para cada diluição, vórtice a solução composta para a mistura adequada. Depois disso, verifique se há divergências compostas e, usando um tubo multicanal, distribua 75 microliters da mistura de reação em cada poço em uma placa de 96 poços. Adicione 75 microliters de cada composto e água como controle em triplicado, e misture por pipetação para cima e para baixo cinco vezes.Meça cada poço a 300 volts usando um nefielômetro de microplaca. Para preparar a solução citrato de arsênico, peso cinco gramas de arsenita de sódio e cinco gramas de dihidrato de citrato de trissódio, dissolver ambos os compostos em 100 mililitros de água. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético glacial.Misture e adicione água a 250 mililitros, armazene à temperatura ambiente protegido da luz. Em seguida, prepare a solução A adicionando 10 mililitros de ácido clorídrico molar de 0,5 molar a 0,3 gramas de ácido ascórbico Dissolva o ácido ascórbico por vórtice. Prepare a solução B adicionando um mililitro de água gelada a 70 miligramas de tetrahidrat de amônio tetrahidrate, e vórtice para dissolver.Armazene a solução A e B no gelo. Para preparar o padrão fosfato com concentração de zero, 62,5, 250 e 500 micromolar para calibração. Adicione zero microliters, 12,5 microliters, 50 microliters e 100 microliters de 5 milimolars de dihidrato de fosfato de dissódio a quatro micro tubos contendo 370 microliters da mistura de reação.Cubra até um mililitro com água. Agora adicione um mililitro da solução B a 10 mililitros de solução A, misture à mão e armazene a solução no gelo. Usando um pipet multicanal, adicione 40 microlitadores de zero, 62,5, 250 e 500 padrão de fosfato micromolar aos scripts do tubo em triplicado.Em seguida, adicione 25 microliters de solução composta e 15 microliters de mistura de solução M-P-P-A de cada tubo. Exceto os tubos contendo padrão fosfato. Sele as tiras do tubo com uma folha de vedação adesiva.Corte a folha de vedação para separar cada tira do tubo. Em seguida, pré-incubar a amostra por cinco minutos a 71 graus Celsius. Coloque a amostra no bloco de aquecimento com intervalos de 20 segundos entre cada tira.Para cada tira, abra a vedação adesiva. Usando um pipet multicanal, adicione 100 microliters de dois difosic pirofosfato de sódio molar. E misture por pipetting para cima e para baixo por cinco vezes.Sele novamente a tira do tubo usando a mesma vedação. Incubar novamente a 71 graus Celsius por cinco minutos. Depois disso, coloque as amostras no aparelho de resfriamento com intervalo de 20 segundos entre cada tira.Deixe esfriar por cinco minutos e, em seguida, centrifugar cada tira brevemente para decantar as gotas de água sob a folha de vedação. Coloque a tira de volta no aparelho de resfriamento, remova a vedação e deixe esfriar por mais cinco minutos. Em seguida, adicione 60 microliters de solução A e B, misture por pipetação para cima e para baixo por cinco vezes, e mantenha as tiras do tubo no aparelho de resfriamento por mais 10 minutos.Em um capô de fumaça, adicione 90 microliters da solução citrato de arsenita e mantenha em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Para produzir uma cor azul estável. Distribua 180 microliters de cada mistura de reação em uma microplaca de poliestireno claro de 96 poços.Use um espectrômetro de microplape para medir a absorvência de cada poço a 860 nanômetros. Neste protocolo, oito compostos foram testados juntamente com o I-D-P, um inibidor comum de fosfatese piro como um controle positivo. Após a adição da solução A e B, e citrato de arsenita, uma cor azul em 30 minutos de incubação à temperatura ambiente.Todas as três concentrações de compostos não inibidores, apresentaram a mesma intensidade de cor azul. Assim como e-1 para E-3 sem qualquer inibidor. O enredo da atividade enzimática contra a concentração de cada composto testado, mostra que o composto com atividade de inibição formou um encaixe de curva não linear.O enredo do I-D-P como um controle positivo, mostra claramente uma diminuição da atividade em concentrações mais altas. A curva de inibição para compostos um, cinco, seis, sete e oito. Apresenta concentrações inibitórias semi-máximas em 1,7 micromolar, 21,4 micromolar, 58,8 micromolar, 239,0 micromolar e maior que 500 micromolar, respectivamente.Lembre-se de preparar a solução M-P-P-A. Pouco antes do início do ensaio.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Um método de evolução dirigida novo específico para o domínio da engenharia termoestabilidade foi desenvolvido e, consequentemente, para as enzimas bacteriolytic validado. Depois de apenas uma rodada de mutagénese ao acaso, uma enzima evoluiu bacteriolytic, PlyC 29C3, exibido duas vezes maior do que a actividade residual quando comparada com a proteína de tipo selvagem, após incubação a temperatura elevada.

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Fonte: Vidilaseris, K., et al. Triagem para inibidores de pirofosfatase ligados à membrana de Thermotoga maritima . J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra um ensaio colorimétrico para rastrear inibidores da pirofosfatase ligada à membrana bacteriana (mPPase) quantificando a liberação de ortofosfato. O método permite a identificação de compostos que inibem a mPPase de Thermotoga maritima, um potencial alvo de drogas antimicrobianas.

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Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

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Apresentamos um plano estratégico e protocolo para identificar variantes genéticas não codificantes que afetam a ligação ao DNA do fator de transcrição (TF). Um protocolo experimental detalhado é fornecido para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) e análise de ensaio de precipitação de afinidade de DNA (DAPA) da ligação ao DNA TF dependente do genótipo.

Triagem para Funcional não-codificante variantes genéticas Usando eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA) e DNA afinidade Precipitation Assay (DAPA)

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Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

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Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

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Um Protocolo Baseado em Fluorescência para Triagem Preliminar de Inibidores de Síntese de Proteínas de Fontes Naturais

Aprenda a triagem de inibidores da pirofosfatase ligada à membrana de Thermotoga maritima usando a reação do azul de molibdênio em placas de 96 poços. Este método colorimétrico é econômico, simples e estável para pesquisa em bioquímica.

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