Name: Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas autólogas a partir de fibroblastos dérmicos humanos usando RNAs não modificados sem vetores virais. Este método não integrador oferece reprogramação eficiente e segura para aplicações em medicina regenerativa e modelagem de doenças.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Os autores não têm reconhecimentos.

Os espécimes do tecido humano foram coletados de acordo com a Declaração de Helsínquia, observando as diretrizes do Hospital Universitário Federico II. Todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram o consentimento escrito.
1. Preparação de Suprimentos e Cultura Mídia
<ol><li>Limpe e autoclave um grande par de tesouras cirúrgicas, dois conjuntos de fórceps finos, dois pares de tesouras microdissecting, 1 L garrafa estéril, 500 mL garrafa estéril, e uma garrafa estéril de 250 mL.</li>
	<li>Prepare placas de 100 mm, placas de 60 mm, placas de 35 mm, bisturis descartáveis, tubos estéreis de 50 mL, tubos estéreis de 15 mL e uma placa de vidro de 100 mm. Armazenar instrumentos em condições estéreis até que esteja pronto para uso.</li>
	<li>Limpe e esterilizar 22 mm x 22 mm óculos de tampa antes de usar. Para isso, coloque os óculos de cobertura em uma placa de vidro, cubra-os com 70% de etanol e espere por alguns segundos antes de aspirar o etanol. Deixe os copos de cobertura secar em um forno a 37 °C e, em seguida, autoclave-los.</li>
	<li>Prepare 1 L da solução de sal equilibrado de Hank (HBSS) no pH 7.4 dissolvendo sais pulverizados comercialmente disponíveis na água estéril dobro-destilada e adicionando 0.35 g do bicarbonato de sódio. Esterilizar por filtragem um capô estéril e armazenar a +4 °C até o uso.</li>
	<li>Prepare 500 mL de estéril 1x fosfato-buffered-salina (PBS) dissolvendo 0,1 g de fosfato de potássio monobasic, 0,1 g de cloreto de potássio, 4,0 g de cloreto de sódio e 0,575 g de fosfato de sódio dibasic em água estéril de destilado duplo. Verifique o valor do pH (7,4) e esterilizar um capô estéril por filtragem. Guarde a +4°C até o uso.</li>
	<li>Prepare 50 mL de solução de stop de trippsina (TSS), adicionando 5 mL de 10% de soro bovino fetal (FBS) a 45 mL de HBSS um capô estéril. Guarde a +4°C até o uso.</li>
	<li>Prepare o meio eagle modificado do Dulbecco para isolamento de fibroblasto (I-DMEM) usando 250 mL do meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% FBS e 0,5% penicilina e estreptomicina (caneta/estreptococo) um capuz estéril. Guarde a +4°C até o uso.</li>
	<li>Prepare o DMEM para sincronização de fibroblastos (S-DMEM) usando 250 mL de DMEM complementados com 0,1% FBS e 0,5% caneta/estreptococo um capô estéril. Guarde a +4°C até o uso.</li>
</ol>2. Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos
NOTA: Os passos 2.1 a 2.3 relatados abaixo devem ser realizados um capô estéril. Uma amostra cilíndrica medindo cerca de 0,8 cm de diâmetro produz 2 x 106 fibroblastos na passagem 1.
<ol><li>Lave a amostra recém-obtida de pele humana do abdômen em um prato de 100 mm com solução HBSS. Agite delicadamente para remover o sangue e outros fluidos biológicos. Repita a etapa três vezes, alterando a solução HBSS e a placa em cada lavagem.</li>
	<li>Coloque a amostra em uma placa de 100 mm, retire o cabelo e a gordura usando fórceps finos e tesouras, e disseque-a com um bisturi para obter fragmentos de 2 mm x 1 mm (para um total de 16 fragmentos) evitando cicatrizes, sujas (por exemplo, como resultado de desenhos com caneta dermográfica) ou áreas queimadas do tecido.</li>
	<li>Coloque 4 pequenos fragmentos em cada prato de 35 mm, cubra com um vidro de cobertura estéril de 22 mm x 22 mm. Ajuste por meio de fórceps finos. Adicionar 1,5 mL de I-DMEM.</li>
	<li>Incubar as placas a 37 °C em 5% DE CO2 por cerca de 15 dias ou até que as células atinjam 85% de confluência. Mude o meio de cultura a cada 3 dias e verifique a conseqüência das células usando um microscópio de contraste de fase invertido diariamente.</li>
</ol>3. Expansão dos fibroblastos da pele humana
NOTA: Os passos relatados abaixo devem ser realizados um capô estéril, exceto os passos realizados na incubadora.
<ol><li>Levante os óculos de capa com fórceps finos, coloque-os de cabeça para baixo em um prato de 100 mm e lave com PBS 1x estéril.</li>
	<li>Retire fragmentos das amostras e descartá-los, lavar placas com 1x PBS estéril.</li>
	<li>Retire 1x PBS e adicione 3 mL e 1 mL de trippsina-EDTA (ácido tetraáptico etilediamina) para cobrir copos colocados no prato de 100 mm e pratos de 35 mm, respectivamente. Incubar para 5 min em 37 °C com 5% CO2.</li>
	<li>Bloquear a trypsinização, adicionando 5 mL de TSS para o prato de 100 mm e 2 mL de TSS para cada prato de 35 mm. Colete a suspensão em tubos estéreis de 15 mL, centrífuga a 400 x g a 4 °C por 5 min.</li>
	<li>Ascute o supernatant e resuspenda a pelota em 12 mL de I-DMEM. Divida a suspensão celular em 3 mL aliquots para cada placa de 60 mm.</li>
	<li>Incubar a 37 °C com 5% CO2. Mude o meio diariamente. Mantenha as células na cultura até atingirem uma confluência de 75%.</li>
	<li>Aspirar o meio das placas e lavar rapidamente em 1x PBS.</li>
	<li>Repita a trypsinização (passos 3,3 e 3,4) três vezes para obter células na passagem 4. Use 1,5 mL de trypsin-EDTA e 3 mL de TSS em cada prato de 60 mm. Divida as celas 1:3.</li>
	<li>Sincroniza as células substituindo o I-DMEM por S-DMEM e incubar por 48 h a 37 °C com 5% de CO2.</li>
	<li>Prepare o seguinte (durante a sincronização celular).<ol>
<li>Prepare o meio de expansão do fibroblasto adicionando 5,0 mL de FBS e 0,5 mL de l-glutamina a 44,5 mL de DMEM avançado (A-DMEM), loja a +4 °C.</li>
		<li>Prepare o coquetel total de reprogramação nm-rna para reprogramação de fibroblastos, combinando o seguinte em cada um dos 9 tubos livres de RNase estéreis: 32 μL de OSKMNL NM-RNA, 24 μL de EKB NM-RNA, 5,6 μL de NM-microRNAs (61,6 μL volume final para 9 aliquots).</li>
		<li>Divida cada tubo de 61,6 μL de coquetel total de reprogramação nm-rna para reprogramação de fibroblasto em quatro alíquos de uso único de 15,4 μL em tubos estéreis, livres de RNase e guarde a -80 °C (15,4 μL volume final para 36 alíquos).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Reprogramação de fibroblastos dérmicos para iPSCs
<ol><li>Dia 0: Semeadura celular NOTA: Os passos 4.1.1 a 4.1.3 e 4.1.8 a 4.1.9 devem ser realizados um capô estéril. Gémeos de matriz de membrana do porão (BMM) rapidamente à temperatura ambiente. Portanto, é fortemente recomendado descongelar BMM durante a noite no gelo em uma geladeira, diluí-lo com meio soro-frio-frio e usar pipetas pré-resfriados, pontas e tubos.<ol>
<li>Prepare uma placa de 24 poços revestindo cada poço com 100 μL de BMM e incubar por pelo menos 1 h a 37 °C antes de semear as células.</li>
		<li>Assaa o meio de placas com células na cultura e lave rapidamente em 1x PBS.</li>
		<li>Repita a trypsinização (passos 3.3 e 3.4) para obter células na passagem 5. Aspirar o supernatant e resuspender a pelota em um volume apropriado de fibroblastos de expansão média (ver passo 3.10).</li>
		<li>Prepare e limpe o hemocytometer com 70% de álcool.</li>
		<li>Prepare uma solução misturando suavemente 10 μl de trippan azul e 10 μL de suspensão celular em tubo de 1,5 mL, e incubar por 1-2 min à temperatura ambiente. Tenha cuidado para não incubar mais de 5 min.</li>
		<li>Pipeta 10 μL da solução para o hemocytometer colocá-lo no palco de um microscópio de contraste fase invertida para contar. Células não viáveis serão azuis, enquanto células viáveis serão desmanhadas.</li>
		<li>Conte as células em pelo menos 2 quadrados da câmara do hemocytometer. Aplique o seguinte cálculo para obter o número total de células: número total de células = (número total de células contadas/número quadrado) x 2 x 10 x volume total de suspensão celular
</li>
		<li>Realize uma diluição para obter uma densidade de 2,5 x 104 células por 500 μL de fibroblastos de médium de expansão, com base no número total de células contadas. Resuspenda a pelota em um volume apropriado de fibroblastos de expansão média.</li>
		<li>Pipette 500 μL da suspensão celular em cada poço da placa de 24 poços. Incubate células durante a noite em 37 °C e 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 1: Transfecção NOTA: Todas as superfícies de trabalho e suprimentos (por exemplo, luvas, garrafas, superfícies de capô estéril, pipettors) devem ser limpos com reagente de limpeza para remover RNase antes de iniciar o procedimento. Executar etapas 4.2.2, 4.2.4-4.2.8 uma capa estéril.<ol>
<li>Aqueça xeno-livre, soro-livre, fator de baixo crescimento humano ESC / iPSC cultura média (XF / FF cultura média) em um banho de água 37 ° C.</li>
		<li>Retire o velho meio de cada poço e substituí-lo por 500 μL de pré-aquecido XF / FF meio de cultura.</li>
		<li>Incubar a 37 °C abaixo de 5% CO2 para pelo menos 6 h.</li>
		<li>Descongele cinco alíquos de 15,4 μL do coquetel total de reprogramação nm-rna à temperatura ambiente e coloque-o no gelo.</li>
		<li>Adicione 234,6 μL de meio de soro reduzido a cada alíquota, delicadamente pipette 3-5 vezes e rotular cada um como TUBO A (RNA + meio de soro reduzido).</li>
		<li>Etiqueta 5 estéril, rnase-livre 0,5 mL tubos como tubo B e misturar 6 μL de sintético siRNA transfecção reagente com 244 μL de meio de soro reduzido (RNA-transfecção reagente + meio de soro reduzido).</li>
		<li>Adicione o conteúdo de cada TUBO B a um TUBO A dropwise (para obter 500 μL volume final de solução de transfecção NM-RNA complexo). Misture tocando no fundo do tubo. Incubar à temperatura ambiente por 15 min.</li>
		<li>Adicione 125 μL de solução complexa de transfecção NM-RNA de cada um dos cinco alíquos de 500 μL a 4 poços (para atingir um total de 20 poços), inclinando a placa e tubulação dropwise no meio. Misture balançando suavemente. Use os 4 poços restantes como referência.</li>
		<li>Incubar por 15 h a 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 2-4: Complete a transfecção
	<ol>
<li>Aspirar o meio. Repita o procedimento de transfecção como no dia 1 o capô estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Dia 5-10: Mudanças na mídia
	<ol>
<li>Assaa o meio e troque com o meio fresco, pré-aquecido da cultura de XF/FF uma capa estéril.</li>
		<li>Incubar durante a noite em 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Mantenha-se na cultura até observar a formação de colônias do iPSC monitorando diariamente por um microscópio de contraste de fase.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lo, B., Parham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+Issues+in+Stem+Cell+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ethical Issues in Stem Cell Research.</a> Endocrine Reviews. 30 (3), 204-213 (2009).</li>
<li>Wong, W. T., Sayed, N., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+How+They+Will+Change+the+Practice+of+Cardiovascular+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Methodist+Debakey+Cardiovasc+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells: How They Will Change the Practice of Cardiovascular Medicine.</a> Methodist Debakey Cardiovasc Journal. 9 (4), 206-209 (2013).</li>
<li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+applications+in+regenerative+medicine%2C+disease+modeling%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).</li>
<li>Zacharias, D. G., Nelson, T. J., Mueller, P. S., Hook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+and+ethics+of+induced+pluripotency%3A+what+will+become+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mayo+Clinic+Proceedings%22%5BJournal%5D)">The science and ethics of induced pluripotency: what will become of embryonic stem cells.</a> Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 634-640 (2011).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Yu, Y., Wang, X., Scott, L., Nyberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cell+Medicine%22%5BJournal%5D)">Application of Induced Pluripotent Stem Cells in Liver Diseases.</a> Journal Cell Medicine. 3 (3), 997-1017 (2014).</li>
<li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li>
<li>Gupta, S., Sharma, V., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+induced+pluripotent+stem+cell+%28ipsc%29+based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in induced pluripotent stem cell (ipsc) based therapeutics.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 3 (3), 263-270 (2017).</li>
<li>Andargie, A., Tadesse, F., Shibbiru, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+Cell+Reprogramming%3A+Methods+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicine%2C+Physiology+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Review on Cell Reprogramming: Methods and Applications.</a> Journal of Medicine, Physiology and Biophysics. 25, 2422(2016).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+using+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells using synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li>
<li>Malik, N., Rao, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+the+Methods+for+Human+iPSC+Derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Review of the Methods for Human iPSC Derivation.</a> Methods in Molecular Biology. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Poleganov, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Reprogramming+of+Human+Fibroblasts+and+Blood-Derived+Endothelial+Progenitor+Cells+Using+Nonmodified+RNA+for+Reprogramming+and+Immune+Evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient Reprogramming of Human Fibroblasts and Blood-Derived Endothelial Progenitor Cells Using Nonmodified RNA for Reprogramming and Immune Evasion.</a> Human Gene Therapy. 26 (11), 751-766 (2015).</li>
<li>Brouwer, M., Zhou, H., Kasri, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choices+for+Induction+of+Pluripotency%3A+Recent+Developments+in+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Reprogramming+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Choices for Induction of Pluripotency: Recent Developments in Human Induced Pluripotent Stem Cell Reprogramming Strategies.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12, 54-72 (2016).</li>
<li>Revilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+the+generation+of+human+iPS+cells%3A+implications+in+cell-based+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Current advances in the generation of human iPS cells: implications in cell-based regenerative medicine.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 10, 893-907 (2016).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Mediated+Ultra-Effective+Direct+Conversion+of+Human+Fibroblasts+into+Neural+Progenitor-like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Exosome-Mediated Ultra-Effective Direct Conversion of Human Fibroblasts into Neural Progenitor-like Cells.</a> ACS Nano. 12 (3), 2531-2538 (2018).</li>
<li>Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technological+overview+of+iPS+induction+from+human+adult+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells.</a> Current Gene Therapy. 13 (2), 73-92 (2013).</li>
<li>Sacco, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+dermal+fibroblasts+as+major+determinant+of+variability+in+cell+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (6), 4256-4268 (2019).</li>
<li>Shan, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+passages+accelerate+the+reprogramming+of+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Continuous passages accelerate the reprogramming of mouse induced pluripotent stem cells.</a> Cellular Reprogramming. 16 (1), 77-83 (2014).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Drews, K., Tavernier, G., Demeester, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+and+immunogenic+hurdles+associated+with+non-viral+mRNA-mediated+reprogramming+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic and immunogenic hurdles associated with non-viral mRNA-mediated reprogramming of human fibroblasts.</a> Biomaterials. 33, 4059-4068 (2012).</li>
<li>Beissert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+In+Vivo+Expression+of+Genes+Delivered+by+Self-Amplifying+RNA+Using+Vaccinia+Virus+Immune+Evasion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improvement of In Vivo Expression of Genes Delivered by Self-Amplifying RNA Using Vaccinia Virus Immune Evasion Proteins.</a> Human Gene Therapy. 28 (12), 1138-1146 (2017).</li>
<li>Mathieu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+re-entry+of+committed+cells+into+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces re-entry of committed cells into pluripotency.</a> Stem Cells. 31 (9), 1737-1748 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+Enhances+Direct+Reprogramming+of+Mouse+Fibroblasts+to+Cardiomyocyte-Like+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Hypoxia Enhances Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts to Cardiomyocyte-Like Cells.</a> Cellular Reprogramming. 18 (1), 1-7 (2016).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+buffalo+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+proliferation%2C+stemness%2C+and+reprogramming+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances buffalo adipose-derived mesenchymal stem cells proliferation, stemness, and reprogramming into induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 234 (10), 17254-17268 (2019).</li>
<li>Karagiannis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+and+Their+Use+in+Human+Models+of+Disease+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells and Their Use in Human Models of Disease and Development.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 79-114 (2019).</li>
<li>Maherali, N., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+techniques+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3 (6), 595-605 (2008).</li>
<li>Asprer, J. S., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+and+challenges+in+the+comprehensive+characterization+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Current methods and challenges in the comprehensive characterization of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 11 (2), 357-372 (2015).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

IPSCs estão emergindo rapidamente como o candidato celular mais promissor para aplicações de medicina regenerativa e como uma ferramenta tremendamente útil para modelagem de doenças e testes de drogas3,8. O protocolo apresentado aqui descreve a geração de iPSCs humanos de uma amostra com o tamanho de uma biópsia de perfuração de pele com um procedimento simples e eficiente que não requer nenhum equipamento específico ou experiência prévia com tecnologia de reprog...

A reprogramação celular representa uma nova tecnologia para transformar todas as células somáticas do corpo em uma célula-tronco pluripotente, conhecida como iPSC1. A possibilidade de reprogramar uma célula somática adulta de volta a um estado pluripotente e indiferenciado superou os limites impostos pela baixa disponibilidade e questões éticas relacionadas ao uso de células pluripotentes, anteriormente derivadas apenas de embriões humanos (células-tronco embrionárias ou ESC)2,3,4. Em 2006, Kazutoshi Takahashi e Shinya Yamanaka realizaram um estudo pioneiro alcançando a primeira conversão de células somáticas adultas da pele em células pluripotentes adicionando artificialmente quatro genes específicos (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)5. Um ano depois, o trabalho realizado no laboratório da Thomson levou à reprogramação bem-sucedida de células somáticas em iPSCs por transdução de uma combinação diferente de quatro genes (Oct4, Sox2, Nanog, Lin28)6.
Os iPSCs oferecem uma série de oportunidades para cientistas e pesquisadores de diferentes áreas, como medicina regenerativa e farmacologia, sendo uma excelente plataforma para estudar e tratar diferentes doenças, juntamente com um reflexo genotípico das características do paciente de que são derivados. O uso de iPSCs fornece várias vantagens, incluindo: o risco reduzido de resposta imune devido a uma origem completamente autóloga das células; a possibilidade de criar uma biblioteca celular, uma ferramenta importante para prever a resposta a novas drogas e seus efeitos colaterais, pois eles são capazes de se auto-renovar continuamente e gerar diferentes tipos de células; e a chance de desenvolver uma abordagem personalizada para a administração de medicamentos7,8,9.
Diversas técnicas são conhecidas no momento, para induzir a expressão dos fatores de reprogramação e estão incluídas em duas categorias principais: métodos não virais e virais baseados em vetores10,11,12,13. Métodos não virais incluem transfecção de mRNA, infecção/transfecção de miRNA, PiggyBac, vetores de minicírculos e plasmídeos episómicos e exossomos10,11,12,13. Métodos baseados em vírus incluem vírus não integradores, como Adenovírus, vírus Sendai e proteínas, e integração de vírus como Retrovírus e Lentivirus10,11,12,13.
De acordo com vários estudos, não foram observadas diferenças significativas entre esses métodos em termos de eficácia da reprogramação celular, portanto, a escolha do método adequado depende estritamente do tipo celular utilizado e das aplicações subsequentes dos iPSCs obtidos14,15. Todos os métodos mencionados mostram desvantagens, por exemplo, o vírus Sendai é eficaz em todos os tipos de células, mas requer um monte de passagens para obter iPSCs; reprogramação por epísmios é excelente para as células do sangue, mas precisa de modificação das condições culturais padrão para fibroblastos; o método PiggyBac poderia representar uma alternativa atraente, mas os estudos em células humanas ainda são limitados e fracos10,11,12,13. Exossomos são nano-vesículas fisiologicamente secretadas em todos os fluidos corporais por células. De acordo com estudos recentes, eles são responsáveis pela comunicação intercelular e podem ter um papel em importantes processos biológicos, como proliferação celular, migração e diferenciação. Exossomos podem transportar e transferir mRNA e miRNA para células receptoras com um mecanismo completamente natural, pois compartilham a mesma composição da membrana celular16. Portanto, exossomos são uma técnica promissora de nova geração para reprogramação, mas seu potencial para reprogramar células somáticas por seu conteúdo ainda está investigação. Métodos baseados em vetores virais usam vírus modificados para transmitir genes de reprogramação para as células receptoras. Esta técnica, apesar da alta eficiência da reprogramação, não é considerada segura, pois a integração do vírus dentro da célula pode ser responsável pela infecção, teratópodes e instabilidade genômica17.
O seguinte protocolo para gerar colônias de iPSCs combina o coquetel de reprogramação de Yamanaka e Thompson e é baseado no uso de um método que exige NM-RNAs e fatores de evasão imunológica com a possibilidade de realizá-lo em condições livres de xeno. A lógica por trás do uso deste método é se espalhar, dentro da comunidade científica, um protocolo que permite uma reprogramação rápida, simples e altamente eficaz de fibroblastos humanos adultos da pele abdominal para iPSCs18.
Os pontos fortes do método proposto são, de fato, a facilidade de desempenho e o curto espaço de tempo necessário para obter iPSCs. Além disso, o método evita mecanismos de defesa celular e o uso de vetores virais, responsáveis por questões relevantes.
Com relação ao protocolo padrão, foram feitas as seguintes modificações: (1) Os fibroblastos de confluentto foram sincronizados na passagem 4 ao colocar em 0,1% de soro por 48 h antes da trippsinização; (2) A densidade celular para a cultura e o volume de reagentes foram ajustados para a utilização em uma placa multi-poço de 24 poços em vez de uma placa de 6 poços; (3) O experimento de reprogramação foi realizado usando uma incubadora de 5% de CO2 em vez de uma incubadora com condições atmosféricas (21% O2)ou hipóxico (5% O2).

<table><tbody><tr><td>Pipeta serológica de 10 ml</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>Placas estéreis, poliestireno</td></tr><tr>de<td>100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Treated, placa de cultura de células estéreis</td></tr><tr><td>15 mL Tubos estéreis</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Centrifuge,</td></tr><tr><td>placas de polipropileno de 24 poços</td><td>Falcon</td><td><forte>353935</forte></td><td>Placa de cultura de células multipoços tratada de fundo plano transparente, com tampa,</td></tr><tr><td>pipeta serológica estéril de 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>Placas estéreis, de poliestireno</td></tr><tr>de<td>35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Treated (placa de cultura de células estéreis)</td></tr><tr>de<td>5 mL de pipeta serológica</td><td>Falcon</td><td>357543</ forte></td><td>Estéril, poliestireno</td></tr><tr><td>50 mL tubos estéreis</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Tubos estéreis de centrífuga, polipropileno</td></tr><tr><td>Advanced DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Gibco</td><td>12491-015</td><td>Armazene em 2-8 &deg; C; evitar a exposição à luz</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>Armazene em 2-8 &deg; C; evite a exposição à luz Soro</td></tr><tr><td>fetal bovino</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>Armazene a -20 °C. O soro deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores para evitar ciclos repetidos de congelamento / descongelamento</td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Hank</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>Powder</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Armazene a -20 °C. Deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores para evitar ciclos repetidos de congelamento / descongelamento</td></tr><tr><td>Reagente de transfecção de lipofectamina RNAiMAX</td><td>INVITROGEN</td><<td>strong>13778-030</td><td>Reagente de transfecção de siRNA sintético; armazenar a 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>CORNING</td><<td>strong>354234</td><td>Basement Membrane Matrix, armazene a -20 °C. Evite congelamentos e descongelamentos múltiplos.</td></tr><tr><td>Câmara Neubauer</td><td>VWR</td><<td>strong>631-1116</td><td>Hemocitômetro</td></tr><tr><td>NutriStem XF Meio de cultura</td><td>Biological Industries</td><td>05-100-1A-500ml</td><td>Xeno-free, sem soro, meio de cultura humano ESC/iPSC de baixo fator de crescimento. Armazene a -20 ° C. Após o descongelamento, o meio pode ser armazenado a 2-8 & C por 14 dias. A mídia deve ser aliquotada em volumes de trabalho menores para evitar ciclos repetidos de congelamento/descongelamento.</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-062-100ml</td><td>Reduced-Serum Medium; armazenar a 2-8 &graus; C; evite a exposição à luz</td></tr><tr><td>Penicilina e estreptomicina</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>Armazene a -20 ° C. A solução deve ser aliquotada em volumes de trabalho menores para evitar ciclos repetidos de congelamento / descongelamento</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P9333</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P5665</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Tubos de 0,5 mL sem RNase</td><td>Eppendorf</td><td>H0030124537</td><td>Tubos de microfuge estéreis sem RNase, polipropileno</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL sem RNase</td><td>Eppendorf</td><td>H0030120086</td><td>RNase-free estéril, tubos de microfugos, polipropileno</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>INVITROGEN</td><<td>strong>AM9780</td><td>Agente de limpeza para remoção de RNase</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S5761</td><td>Powder</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Powder Fosfato de sódio Dibasic</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td>Powder</td></tr><tr><td>StemRNA 3rd Gen Kit de reprogramação</td><td>Reprocell</td><td>00-0076</td><td>Kit de reprogramação baseado em NM-RNAs de terceira geração para reprogramação celular de fibroblastos, sangue e urina. Armazene a -70 °C ou menos.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>Armazene a -20 °C. Deve ser aliquotado em volumes de trabalho menores para evitar ciclos repetidos de congelamento / descongelamento</td></tr></tbody></table>

isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) poderiam ser consideradas, até o momento, uma fonte promissora de células pluripotentes para o manejo de doenças atualmente intratáveis, para a reconstituição e regeneração de tecidos feridos e para o desenvolvimento de novos medicamentos. Apesar de todas as vantagens relacionadas ao uso de iPSCs, como o baixo risco de rejeição, as questões éticas diminuídas e a possibilidade de obtê-las de pacientes jovens e idosos sem qualquer diferença em seu potencial de reprogramação, problemas para superar ainda são numerosos. Na verdade, a reprogramação celular realizada com vírus virais e integradores pode causar infecções e a introdução de genes necessários pode induzir uma instabilidade genômica da célula receptora, prejudicando seu uso na clínica. Em particular, há muitas preocupações sobre o uso do gene c-Myc, bem conhecido de vários estudos para a sua atividade indutora de mutação. Fibroblastos surgiram como a população celular adequada para reprogramação celular como eles são fáceis de isolar e cultura e são colhidas por uma biópsia de perfuração da pele minimamente invasiva. O protocolo aqui descrito fornece uma descrição detalhada passo a passo de todo o procedimento, desde o processamento de amostras até a obtenção de culturas celulares, escolha de reagentes e suprimentos, limpeza e preparação, até a reprogramação celular por meio de um comercial RNAs não modificados (NM-RNAs) kit de reprogramação baseada em RNAs. O kit de reprogramação escolhido permite uma reprogramação eficaz do fibroblasto dérmico humano para iPSCs e pequenas colônias pode ser visto tão cedo quanto 24 h após a primeira transfecção, mesmo com modificações no que diz respeito à folha de dados padrão. O procedimento de reprogramação utilizado neste protocolo oferece a vantagem de uma reprogramação segura, sem o risco de infecções causadas por métodos virais baseados em vetores, reduz os mecanismos de defesa celular e permite a geração de iPSCs livres de xeno, todos características críticas que são obrigatórias para novas aplicações clínicas.

O objetivo do protocolo foi reprogramar fibroblastos dérmicos isolados da pele abdominal, utilizando método de reprogramação não integrador com base em RNAs Para induzir a expressão de fatores específicos. Para atingir esse objetivo, os fibroblastos dérmicos humanos foram isolados de amostras de pele de pacientes submetidos a cirurgia de abdominoplastia e iPSCs foram gerados introduzindo outubro4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog, Fatores de reprogramação Lin28 e e3, K3, B18 fatores de evasão imunológica por um kit de reprogramaç...

A reprogramação celular requer a introdução de genes-chave, que regulam e mantêm o estado celular pluripotente. O protocolo descrito permite a formação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) colônias de fibroblastos dérmicos humanos sem métodos virais/integradores, mas usando RNAs não modificados (NM-RNAs) combinados com fatores de evasão imunológica reduzindo os mecanismos de defesa celular.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

O protocolo a seguir fornece instruções para gerar células-tronco pluripotentes autoólogas induzidas pelo homem através da rápida e eficiente reprogramação de fibroblastos dérmicos humanos isolados de uma biópsia de socos na pele. Os procedimentos podem ser realizados por pesquisadores com pouca ou nenhuma experiência em reprogramação celular e com ajuste adequado, permite o produto de células-tronco pluripotentes induzidas livres de xenoenvolvidas. Células IPS autólogas podem ser usadas para aplicações de medicamentos regenerativos e para modelar doenças como distúrbios genéticos ou câncer para investigar mecanismos moleculares subjacentes e desenvolver terapias mais específicas.A carga de trabalho é alta. É extremamente útil estudar o protocolo antes de planejar cuidadosamente o experimento, incluindo as etapas durante as quais os reagentes e materiais devem ser preparados. A demonstração visual do procedimento ajuda as pesquisas com pouca ou nenhuma experiência a realizar o isolamento celular e a reprogramação, evitando erros comuns relacionados a possíveis contaminações microbianas e de RNA.Sob um capô estéril, lave a amostra recém-obtida da pele humana do abdômen em um prato d

isolation-adult-human-dermal-fibroblasts-from-abdominal-skin

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.

Isolamento e Cultura de Células-Tronco Adultas epitelial da pele humana

Nós apresentamos um protocolo para a reprogramação eficiente de células somáticas humanas em células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC) usando vetores retrovirais codificando OCT3 / 4, Sox2, KLF4 e c-myc (OSKM) e identificação de hiPSC corretamente reprogramado pela coloração ao vivo com tradi- 1-81 anticorpo.

Seleção e isolamento de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos adultos reprogramado

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar células progenitoras neurais induzidas (iNPCs) derivadas de fibroblastos humanos adultos. Ele descreve as etapas envolvidas no isolamento das colônias de iNPC e na cultura delas em poços de placas de vários poços revestidos com laminina na presença de meios de cultura adequados que facilitam a proliferação e expansão contínuas da população de iNPC.

Isolando colônias de células progenitoras neurais induzidas derivadas de fibroblastos humanos adultos

Apresentamos um método para isolar as células multipotentes ingênuos precursoras da pele derivada (SKP) de culturas de fibroblastos humanos primários. Mostra-se que estas SKPs derivados a partir de culturas de fibroblastos de células estaminais partilham propriedades semelhantes às derivadas directamente a partir de biópsias de pele humana. Estas células expressam o marcador da crista neural, nestina, para além dos marcadores, tais como OCT4 multipotentes e Nanog.

Naïve Adult Stem Cells isolamento de culturas primárias de fibroblastos humanos

Geração de células estaminais pluripotentes induzidas proporciona perspectivas fascinantes para a derivação de transplantes autólogos. No entanto, a progressão através de um estado pluripotente e trabalhoso re-diferenciação ainda dificulta a tradução clínica. Aqui nós descrevemos a derivação de fibroblastos humanos adultos ea sua conversão direta em células progenitoras neurais induzidos ea subsequente diferenciação em linhagens neuronais.

Derivação de adultos fibroblastos humanos e sua conversão direta em Expansível Neural células progenitoras

Este manuscrito fornece um procedimento passo a passo para a derivação e manutenção de queratinócitos humanos a partir de cabelos arrancados e subsequente geração de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos livres de integração (hiPSCs) por vetores epissómicos.

Geração de Integração Induced-livre Human células estaminais pluripotentes usando o cabelo derivado queratinócitos

Este protocolo descreve um método detalhado para a geração eficiente de iPSCs livres de integração a partir de células sanguíneas periféricas adultas humanas. Com o uso de quatro vetores epissómicos baseados em oriP/EBNA para expressar os fatores de reprogramação, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 e SOX2, milhares de colônias de iPSC podem ser obtidas a partir de 1 mL de sangue periférico.

Geração de Integração-livres induzidas células-tronco pluripotentes a partir de células mononucleares de sangue periférico humano Usando epissï¿½ica Vectors

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Aqui nós descrevemos um método clinicamente relevante, alta eficiência, livre de alimentador para reprogramar fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas usando modificados mRNAs codificação fatores reprogramação e imita o microRNA madura-367/302. Também está incluídos métodos para avaliar a eficiência de reprogramação, expanda iPSC clonal colônias e confirmar a expressão do marcador pluripotência TRA-1-60.

Baseado em RNA reprogramação de fibroblastos humanos primários em células-tronco pluripotentes induzidas

Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

Este manuscrito descreve um protocolo FACS-baseado para a isolação de fibroblasto Papillary e reticular da pele humana. Contorna a cultura in vitro que era inevitável com o protocolo comumente usado da isolação através das culturas do explante. Os subconjuntos emanando do fibroblasto são funcionalmente distintos e indicam a expressão e a localização diferenciais do gene dentro da derma.

Isolamento de fibroblastos papilares e reticular da pele humana por triagem celular ativada por fluorescência

Aprenda a gerar células-tronco pluripotentes induzidas autólogas a partir de fibroblastos dérmicos humanos usando RNAs não modificados sem vetores virais. Este método não integrador oferece reprogramação eficiente e segura para aplicações em medicina regenerativa e modelagem de doenças.

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento de fibroblastos dérmicos humanos adultos da pele abdominal e geração de células-tronco pluripotentes induzidas usando um método não integrador

Explorar mais vídeos