Name: Modelo de Dor da Osteoartrite Induzida pela Injeção Intra-Articular de Mono-Iodoacetato em Ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a criar um modelo de dor em ratos usando injeção intra-articular de mono-iodoacetato. Este método reprodutível permite avaliar comportamentos relacionados à dor e alterações histopatológicas em pesquisa de osteoartrite.

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Este estudo foi financiado pela Fundação Provincial de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Grant No: LY17H270016), pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant No: 81774331, 81873049 e 81673997) e pelo Zhejiang Provincial Science and Technology Project of Traditional Chinese Medicine of China (Grant No: 2013ZQ007 e 2016ZZ011).

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Normas Médicas e Ética da Universidade Médica Chinesa de Zhejiang e estão de acordo com a legislação da China sobre o uso e cuidado de animais de laboratório.
1. Injeção intra-articular de mono-iodoacetato no joelho
<ol><li>Após uma semana de aclimatação, divida aleatoriamente e igualmente 40 ratos Sprague-Dawley machos pesando 180-200 g (4-5 semanas de idade) em quatro grupos (n = 10 ratos / grupo). NOTA: Os ratos do grupo controle serão injetados intra-articularmente com 50 μL de solução salina, enquanto os ratos dos grupos experimentais serão tratados com 0,5, 1,5 ou 3 mg de MIA dissolvidos em 50 μL de solução salina, respectivamente.</li>
	<li>No dia da injeção, preparar recentemente a solução de MIA em solução salina estéril (NaCl a 0,9%) na concentração de 15, 30 e 60 mg/ml e solução de pentobarbital a 10% em solução salina estéril (NaCl a 0,9%). CUIDADO: MIA tem um efeito extremamente destrutivo sobre a membrana mucosa, o trato respiratório superior, o olho e a pele e outros tecidos. Portanto, máscara e luvas são recomendadas ao preparar uma solução.</li>
	<li>Anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de cetamina a 60 mg/kg e xilazina a 5 mg/kg (ambas preparadas em solução salina). Prenda suavemente os dedos dos pés do rato com uma pinça para confirmar a anestesia.</li>
	<li>Coloque o rato com as costas voltadas para baixo. Raspe o joelho e limpe a área ao redor da articulação do joelho com álcool.</li>
	<li>Mantenha o joelho em um ângulo de 90° e revele o tendão patelar branco abaixo da patela. Pressione o tendão patelar com a ponta do dedo para encontrar a lacuna abaixo da patela.</li>
	<li>Escolha a junção do espaço e do tendão patelar lateral como local de injeção. Em seguida, insira a agulha 26 G verticalmente no local cerca de 5 mm. Nenhuma resistência deve ser sentida quando a agulha está no espaço articular. NOTA: É importante manter a agulha perpendicular ao local da injeção.</li>
	<li>Injete 50 μL de solução salina ou MIA na cavidade articular. Puxe lentamente a agulha e enrole um pedaço de gaze ao redor do local da injeção para minimizar o refluxo e o vazamento. Após a recuperação da anestesia, remova a gaze.</li>
	<li>Teste o comportamento relacionado com a dor aos 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após as injeções, conforme descrito na secção 2.</li>
</ol>2. Avaliações comportamentais
<ol><li>Limiar de retirada mecânica (MWT) NOTA: O TCM foi medido pelo teste de von Frey13 e o observador ficou cego para as injeções que os animais haviam recebido.<ol><li>Coloque um rato em uma gaiola de plástico elevada (17 cm x 11 cm x 13 cm) com uma base de malha de arame suspensa 50 cm acima de uma mesa. Certifique-se de que o ambiente de teste seja silencioso e dê ao rato 30 minutos para se adaptar ao ambiente.</li>
		<li>Pressione a agulha de von Frey perpendicularmente na superfície plantar da pata traseira de cada rato. Aumente a pressão gradualmente (aproximadamente 20 g/s) e linearmente até que ocorra o levantamento da pata ou a lambida da pata.</li>
		<li>Use uma força inferior ao limite anterior para garantir que o limite seja a força mínima de retirada. Teste cada rato mais de três vezes, com pelo menos 3 a 5 minutos de intervalo.</li>
		<li>Registre a força mínima que provoca um reflexo de retirada da pata. Média dos dados como o TCM de ratos.</li>
	</ol></li>
	<li>Latência de retirada térmica (TWL) NOTA: A TWL foi medida utilizando-se o aparelho de teste plantar (Tabela de Materiais) e o observador foi cegado para as injeções que os animais haviam recebido.<ol><li>Coloque uma caixa de plexiglass (60 cm x 20 cm x 14 cm, dividida em 6 compartimentos) em uma placa de vidro de 3 mm de espessura e coloque ratos na caixa (um em cada compartimento). Certifique-se de que o ambiente esteja silencioso e que a temperatura ambiente seja constante.</li>
		<li>Dê aos ratos 30 minutos para se adaptarem ao ambiente de teste.</li>
		<li>Calibre o estímulo térmico através do radiômetro infravermelho. Defina a intensidade infravermelha desejada em 70 unidades.</li>
		<li>Coloque o emissor/detector infravermelho no recipiente diretamente sob o centro da pata que está sendo testada.</li>
		<li>Pressionando o botão START . O temporizador será iniciado automaticamente. O controlador desligará automaticamente a luz infravermelha e interromperá completamente o temporizador assim que o movimento da pata ocorrer.</li>
		<li>Registre o tempo de reação quando o aparecimento de retirada da pata e lamber a pata. NOTA: Uma resposta positiva para o teste é considerada como retirada da pata e lambida da pata. Se apenas a retirada da pata ocorrer, deve ser considerada como um movimento voluntário do rato, em vez de uma resposta positiva.</li>
		<li>Repita o teste mais de três vezes. Média dos dados como o TWL de ratos. NOTA: Cada exposição de calor radiante não deve exceder 20 s. As estimulações infravermelhas na mesma pata traseira devem ter pelo menos 3 a 5 minutos de intervalo.</li>
	</ol></li>
	<li>Análise do padrão de marcha NOTA: As análises do padrão de marcha foram medidas por meio de um sistema de imagem (Tabela de Materiais) e o observador ficou cego para as injeções que os animais haviam recebido.<ol><li>Ajuste o comprimento do compartimento de caminhada usando os botões em ambas as extremidades do compartimento de caminhada para um comprimento adequado para ratos (por exemplo, 61 cm).</li>
		<li>Coloque um rato no compartimento de caminhada e treine ratos para fazer corridas ininterruptas por pelo menos 5 ciclos de passos a uma velocidade de 18 cm/s antes do experimento formal. NOTA: Quando um rato é colocado pela primeira vez no compartimento de caminhada, a velocidade pode ser ajustada para cerca de 20 cm / s e desligada ao correr em torno de 2 s. Em seguida, defina a velocidade para 18 cm/s. Bata suavemente na parte de trás do rato com a divisória, se o rato parar ou recuar durante a caminhada. Tente reduzir a velocidade gradualmente de 18 cm/s para 10 cm/s. Se o rato eventualmente não conseguir realizar o teste, é aceitável escolher outro rato para o teste.</li>
		<li>Aumente lentamente a velocidade da esteira até atingir a velocidade alvo (18 cm/s). Capture pelo menos 5 s de vídeo de movimento contínuo do rato com a câmera de vídeo digital de alta velocidade montada abaixo da correia transparente da esteira.</li>
		<li>Teste cada rato com pelo menos 5 minutos de intervalo para obter pelo menos três corridas ininterruptas.</li>
		<li>Desenhe uma "caixa delimitadora" para definir o limite da imagem de caminhada de animais no software de imagem e insira a velocidade de execução de cada vídeo. Selecione vídeos como um grupo e processe vídeos automaticamente pelo software. Após o processamento dos vídeos, o software produzirá várias planilhas para relatar índices de marcha, incluindo postura, balanço, frenagem, propulsão, cadência, sequência de passos, etc.</li>
		<li>Calcule a área total da pata (cm2), o comprimento médio da passada (cm) e o comprimento da passada unite. NOTA: A área total da pata é a média da área total de quatro patas de cada grupo de ratos e a área da pata é definida como a área máxima da pata em contato com a esteira durante a fase de postura do ciclo de passos. O comprimento da passada é a distância entre os contatos iniciais da mesma pata em uma passada completa. Comprimento unitário da passada = comprimento médio da passada (cm)/comprimento do corpo (cm).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análises histopatológicas e imuno-histoquímicas
<ol><li>Eutanasiar ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 150 mg/kg (preparado em solução salina). Ressecar as articulações do joelho imediatamente para as análises histológicas.</li>
	<li>Fixe as articulações em formalina a 10% por 24 h, descalcifique com EDTA a 10% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por 8 semanas e, em seguida, incorpore as articulações em parafina. CUIDADO: A formalina pode causar irritação nos olhos, pele e trato respiratório. Deve ser manuseado em um exaustor.</li>
	<li>Secção das juntas embutidas em parafina com um micrótomo de 3 mm de espessura e flutuar num banho-maria a 40 °C contendo água destilada.</li>
	<li>Transfira seções para lâminas de vidro. Seque as lâminas durante a noite e armazene as lâminas à temperatura ambiente (RT) para continuar a coloração seguinte.</li>
	<li>Coloque as lâminas em forno a 60 °C por 4 h para desparafinizar.</li>
	<li>Imergir as lâminas sucessivamente em xileno, xileno, 100% etanol, 100% etanol, 95% etanol, 80% etanol e 75% etanol por 5 min, respectivamente, no RT.</li>
	<li>Cortes de coloração com hematoxilina e eosina (H&E), safranina-O (SO) e hematoxilina azul de Alcian (ABH), bem como anticorpos contra colágeno tipo II de rato (Col2), colágeno tipo X (Col10) e metaloproteinase de matriz 13 (MMP13), conforme descrito nas etapas 3.8 a 3.12.</li>
	<li>Coloração H&E<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min. Lâminas de coloração com hematoxilina por 3 a 5 min.</li>
		<li>Enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça hematoxilina na superfície.</li>
		<li>Escorregas de coloração com eosina por 30 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça nenhuma eosina na superfície.</li>
		<li>Mergulhe slides em 0,1% de amônia por 10 a 20 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração SO<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min. Lâminas de coloração com hematoxilina por 3 a 5 min.</li>
		<li>Diferencie rapidamente em 1% de álcool ácido (cerca de 3 s). Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça hematoxilina na superfície.</li>
		<li>Lâminas de coloração com solução Fast Green (FCF) por 5 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Escorregas de coloração com SO por 1 a 2 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Enxaguar as lâminas com ácido acético a 1% por 1 a 2 min para remover o FCF residual. Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 1 min.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloração ABH<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min. Mergulhe as lâminas em álcool ácido a 1% por 30 s e escorra brevemente em um papel toalha (não enxágue).</li>
		<li>Mergulhe slides em ABH por 1 h. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada, até que não permaneça ABH na superfície.</li>
		<li>Diferencie rapidamente em 1% de álcool ácido (cerca de 3 s). Enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas em água de amônio a 0,5% por 15 s. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas em etanol a 95% por 1 min. Mergulhe as lâminas em solução de eosina/laranja G por 1,5 min.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
	</ol></li>
	<li>Examinar todas as lâminas ao microscópio e classificar estatisticamente em uma escala de 0−13 por observação duplo-cega, de acordo com o sistema de pontuação de Mankin14.</li>
	<li>Imuno-histoquímica<ol><li>Enxaguar as lâminas com H2O deionizado por 3 min.</li>
		<li>Imergir as lâminas em citrato de sódio 0,1 M e colocar as lâminas num forno a 60 °C durante 4 h para obter o antigénio.</li>
		<li>Mergulhe slides em Triton X-100 a 0,3% em PBS por 10 min. Em seguida, enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar seções em solução de H 2 O2a 3% em metanol em RT por 10 min para bloqueara atividade da peroxidase endógena. Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar seções com soro de cabra a 5% em PBS por 30 min no RT para bloquear qualquer ligação não específica. Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar cortes durante a noite a 4 °C com 100 μL de anticorpos primários diluídos em PBS (1:1.000) contra colágeno tipo II (Col2), colágeno tipo X (Col10) e metaloproteinase de matriz 13 (MMP13). Enxaguar as lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar seções com 100 μL de anticorpo secundário diluído em PBS (1:1.000) (cabra anti-camundongo secundário ou cabra anti-camundongo secundário) por 20 min no RT. Enxaguar lâminas com PBS 2x, 3 min cada.</li>
		<li>Incubar secções com 100 μL de solução de trabalho de 3,3′-diaminobenzidina (DAB). Monitore a reação à medida que a reação cromogênica torna os locais do epítopo marrons. CUIDADO: DAB é um carcinógeno. Sempre use luvas e trabalhe em um exaustor ao trabalhar com DAB. NOTA: O tempo de desenvolvimento de cores pode variar de alguns segundos a 10 minutos.</li>
		<li>Assim que uma cor marrom se desenvolver nas seções, enxágue as lâminas com H 2 O2xdeionizado, 3 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas em hematoxilina por 1 a 2 minutos para contra-manchar as lâminas. Em seguida, enxaguar as lâminas com H2O 3x deionizado, 1 min cada.</li>
		<li>Mergulhe as lâminas sucessivamente em etanol a 95%, etanol a 100%, xileno, xileno e xileno por 1 min, respectivamente.</li>
		<li>Deslize as lâminas por resina neutra.</li>
		<li>Observe a cor da coloração do anticorpo nas seções sob um microscópio.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hunter, D. J., Schofield, D., Callander, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+individual+and+socioeconomic+impact+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The individual and socioeconomic impact of osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 437-441 (2014).</li>
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<li>Piesla, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+gait%2C+due+to+inflammation+but+not+nerve+injury%2C+reflects+enhanced+nociception+in+preclinical+pain+models%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal gait, due to inflammation but not nerve injury, reflects enhanced nociception in preclinical pain models.</a> Brain Research. 1295, 89-98 (2009).</li>
<li>Udo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoiodoacetic+acid+induces+arthritis+and+synovitis+in+rats+in+a+dose-+and+time-dependent+manner%3A+proposed+model-specific+scoring+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Monoiodoacetic acid induces arthritis and synovitis in rats in a dose- and time-dependent manner: proposed model-specific scoring systems.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 24 (7), 1284-1291 (2016).</li>
<li>Guingamp, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mono-iodoacetate-induced+experimental+osteoarthritis%3A+a+dose-response+study+of+loss+of+mobility%2C+morphology%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Mono-iodoacetate-induced experimental osteoarthritis: a dose-response study of loss of mobility, morphology, and biochemistry.</a> Arthritis & Rheumatism. 40 (9), 1670-1679 (1997).</li>
<li>Jeong, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eupatilin+Exerts+Antinociceptive+and+Chondroprotective+Properties+in+a+Rat+Model+of+Osteoarthritis+by+Downregulating+Oxidative+Damage+and+Catabolic+Activity+in+Chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Eupatilin Exerts Antinociceptive and Chondroprotective Properties in a Rat Model of Osteoarthritis by Downregulating Oxidative Damage and Catabolic Activity in Chondrocytes.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0130882(2015).</li>
<li>Cook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+%26+Joint+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of cartilage repair.</a> Bone & Joint Research. 3 (4), 89-94 (2014).</li>
<li>Little, C. B., Zaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+constitutes+an+%22animal+model+of+osteoarthritis%22--the+need+for+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">What constitutes an "animal model of osteoarthritis"--the need for consensus.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (4), 261-267 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

O modelo de OA de rato induzido por MIA é um modelo bem estabelecido e amplamente utilizado. A injeção intra-articular de AIM causa inicialmente inflamação grave e aguda, o que dá origem à fase mais longa e degenerativa da OA17,18. Nesta pesquisa, medimos a sensibilidade nociceptiva por TCM e TWL e avaliamos as alterações da marcha com um sistema de imagem. Relatos prévios constataram que a injeção de AIM poderia elevar a sensibilidade das fibras articulares afer...

A osteoartrite (OA) é a doença articular mais comum no mundo, afetando cerca de 10-12% da população em adultos1. A articulação mais geralmente envolvida é o joelho, e a OA tem maior incidência em idosos, especialmente mulheres2. Como doença crônica, a OA desenvolve-se progressivamente ao longo de décadas em falência articular com sintomas como perda de cartilagem, inflamação sinovial, osteofitose, diminuição da função e dor crônica3. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a OA é a quarta doença mais prevalente no sexo feminino e a oitava doença mais prevalente no sexo masculino. Até 2020, a OA pode se tornar a quarta doença mais incapacitante em humanos4. No entanto, as terapias atualmente disponíveis de OA abordam apenas os sintomas e estendem o tempo até a cirurgia de substituição articular5.
A OA espontânea em pacientes humanos muitas vezes leva muito tempo para produzir sintomas clínicos, como dor relacionada às articulações6. Nos estágios iniciais da OA, a dor geralmente é intermitente e torna-se mais frequente e grave à medida que a doença progride, tornando-se a queixa predominante dos pacientes7. Portanto, extensos modelos animais para a dor da OA foram desenvolvidos ao longo do último meio século para promover a terapia de alívio da dor. Os modelos de OA foram classicamente divididos em modelos espontâneos e induzidos. Os modelos espontâneos incluem modelos naturais e modelos geneticamente modificados, que podem simular mais de perto o curso da OA primária em humanos8. Os modelos induzidos geralmente podem ser divididos em duas categorias: 1) OA pós-traumática induzida por cirurgia ou outro trauma; ou 2) injeção intra-articular de substâncias condrotóxicas ou pró-inflamatórias3. Esses modelos estabelecem uma base para o estudo fisiopatológico da OA e contribuem muito para o desenvolvimento de drogas para reduzir a dor e aumentar a função.
Recentemente, o indutor mais utilizado para a modelagem da OA é o mono-iodoacetato (MIA). A AIM, inibidora da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, pode causar alterações na matriz cartilaginosa, degradação, perda de cartilagem, sinovite e outras alterações, que são semelhantes às alterações patológicas da osteoartrite humana9. Observou-se que a injeção intra-articular de AIM induziu dor contínua aos 28 dias após a administração da AIM, indicando que o modelo de AIM pode ser útil para investigar a dor nociceptiva crônica10,11,12. Neste estudo, ratos machos de Sprague-Dawley receberam injeções intra-articulares com 0,5, 1,5 ou 3 mg de MIA nas articulações do joelho. A gravidade da dor articular induzida por MIA foi medida pela avaliação da sensibilidade mecânica e térmica aos 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após as injeções. Com base nisso, 1,5 mg de AIM foi selecionado como concentração final para avaliar os padrões de marcha e as alterações histológicas aos 28 dias após as injeções.

<table><tbody><tr><td>Anticorpo anti-colágeno II</td><td>Abcam (Reino Unido)</td> <td>34712</td><td>Anticorpo primário para imuno-histoquímica (IHC)</td></tr> <tr><td>Anticorpo anti-colágeno X (Col10)</td><td>Abcam (Reino Unido)</td> <td>49945</td><td>Anticorpo primário para IHC</td></tr><tr><td>DigiGait Imaging System</td><td>Mouse Specifics (Boston, MA, EUA)</td><td></td><td>Equipamento para análises de padrões de marcha</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861006</td><td>O corante para HE coloração</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td>O corante para coloração SO</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-camundongo de cabra</td><td>ZSGQ-BIO (Pequim, China)</td> <td>PV-9002</td><td>Anticorpo secundário para</td></tr><tr><td>anticorpo anti-coelho de cabra</td><td>IHC ZSGQ-BIO (Pequim, China)</td> <td>PV-9001</td><td>Anticorpo secundário para IHC</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3163</td><td>O corante para coloração HE</td></tr><tr><td>MIA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>pó</td></tr><tr><td>MMP13</td><td>Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EUA)</td><td>69926</td><td>Anticorpo primário para IHC</td></tr><tr><td>Centro modular de incorporação de tecidos</td><td>Thermo Fisher Scientific (EUA)</td><td>EC 350</td><td>Produzir blocos de parafina.</td></tr><tr><td>Aparelho de teste plantar</td><td>UgoBasile (Itália)</td><td>37370</td><td>Equipamento para ensaio TWL</td></tr><tr><td>Kit de reagentes PrimeScript RT (Perfect Real Time)</td><td>TaKaRa Biotechnology Co. Ltd. (Dalian, China)</td><td>RR037A</td><td>Extrai o RNA total das células cultivadas</td></tr><tr><td>Micrótomos rotativos e deslizantes</td><td>Thermo Fisher Scientific (EUA)</td><td>HM325</td><td>Seções precisas de parafina.</td></tr><tr><td>Safranin-O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2255</td><td>O corante para coloração SO</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 5 Jr</td><td>Sakura (Japão)</td><td></td><td>Processador de infiltração a vácuo</td></tr></tbody></table>

modelo de dor da osteoartrite induzida pela injeção intra-articular de mono-iodoacetato em ratos

Osteoarthritis Pain Model Induced by Intra-Articular Injection of Mono-Iodoacetate in Rats

Os modelos animais atuais de osteoartrite (OA) podem ser divididos em modelos espontâneos e modelos induzidos, ambos com o objetivo de simular as alterações fisiopatológicas da OA humana. No entanto, como principal sintoma na fase tardia da OA, a dor afeta a vida diária dos pacientes, não havendo muitos modelos disponíveis. O modelo induzido por monoiodoacetato (MIA) é o modelo de dor de OA mais utilizado, utilizado principalmente em roedores. A AIM é um inibidor da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, que causa morte por condrócitos, degeneração da cartilagem, osteófito e alterações mensuráveis no comportamento animal. Além disso, alterações de expressão da metaloproteinase da matriz (MMP) e citocinas pró-inflamatórias (IL1 β e TNF α) podem ser detectadas no modelo induzido por MIA. Essas alterações são consistentes com as condições fisiopatológicas da OA em humanos, indicando que a AIM pode induzir um modelo de dor da OA mensurável e bem-sucedido. Este estudo tem como objetivo descrever a metodologia de injeção intra-articular de MIA em ratos e discutir os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas.

Com essa metodologia, estabelecemos um modelo de dor da OA no rato e detectamos as alterações resultantes. O TCM e a TWL refletiram alodinia mecânica e hiperalgesia térmica, respectivamente. Como mostra a Figura 1, a AIM induziu alodinia mecânica e hiperalgesia térmica presentes de forma dose-dependente. Notavelmente, a diminuição do TCM atingiu um pico de 21 dias para 28 dias, e depois se recuperou, sugerindo que o reparo articular pode ocorrer nesta fase, mas o TCM do grupo MIA de 3 mg ain...

Este estudo descreve o método de injeção intra-articular de mono-iodoacetato em ratos e discute os comportamentos relacionados à dor resultantes e as alterações histopatológicas, que fornecem referências para futuras aplicações.

Modelo de Dor da Osteoartrite Induzida pela Injeção Intra-Articular de Mono-Iodoacetato em Ratos

The current animal models of osteoarthritis (OA) can be divided into spontaneous models and induced models, both of which aim to simulate the ...

A injeção intra-articular de IM causa mudanças mensuráveis no comportamento relacionado à dor, o que desempenha um papel importante na avaliação do sucesso da modelagem O procedimento é reprodutível e eficiente em termos de tempo. Além disso, a dose acelerada são contra-rótulo cai pequenos e mamíferos leves. E demonstrando o procedimento estará Zuxiang Chen, um estudante de pós-graduação do nosso laboratório.Coloque o rato anestesiado em decúbito dorsal e remova o pelo de um joelho. Desinfete a pele exposta com álcool e posicione o joelho em um ângulo de 90 graus para revelar o tendão branco da patela abaixo da patela. Aplique pressão no tendão patelar com a ponta do dedo para encontrar a lacuna abaixo da patela.E segurando a agulha perpendicular à articulação, insira uma agulha de calibre 26 na junção da lacuna e do tendão patelar lateral. Quando a agulha estiver no lugar, injete 50 microlitros de solução MIA na cavidade articular antes de retrair lentamente a agulha. Em seguida, enrole um pedaço de gaze ao redor do local da injeção para minimizar o refluxo e o vazamento.Aos 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a injeção, coloque um rato injetado em um plástico elevado de 17 por 11 por 13 centímetros com uma base de malha de arame suspensa 50 centímetros acima de uma mesa, em um ambiente silencioso Dê ao rato 30 minutos para se adaptar ao ambiente antes de pressionar uma agulha de von Frey perpendicular na superfície do plantador de uma pata traseira. Aumentando a pressão gradualmente e linearmente até que ocorra o levantamento ou lambida das patas. Quando ocorrer a retirada da pata, use uma força menor que o limite anterior para garantir que o limite seja a força mínima de retirada.Quando cada rato tiver sido testado pelo menos quatro vezes, com pelo menos três a cinco minutos de intervalo, registre a força mínima que provoca um reflexo de retirada da pata e calcule a média dos dados como o MWT dos ratos. Para testar o TWL, coloque um rato injetado em cada compartimento de uma caixa de plexiglass de 60 por 20 por 14 centímetros. Coloque uma placa de vidro de três milímetros de espessura em uma sala silenciosa com temperatura constante e dê aos ratos 30 minutos para se adaptarem ao ambiente de teste.No final do período de orientação, calibre o estímulo térmico por meio de um radiômetro infravermelho e defina a intensidade infravermelha desejada para 70 unidades. Coloque o detector de emissor infravermelho no recipiente diretamente sob o centro da pata que está sendo testada e pressione iniciar. O cronômetro será iniciado automaticamente.Assim que ocorrer o movimento da pata, o controlador desligará automaticamente a luz infravermelha e interromperá o cronômetro. Registre o tempo de reação quando a retirada e a lambida das patas forem observadas. Depois de repetir o teste pelo menos quatro vezes para cada rato, calcule a média dos dados como o TWL dos ratos.Para avaliar o padrão de portão dos ratos tratados com MIA, primeiro use os botões em ambas as extremidades de um compartimento de caminhada para ajustar o comprimento do compartimento para 61 centímetros. Em seguida, coloque um rato no compartimento de caminhada e treine-o para fazer corridas ininterruptas por pelo menos cinco ciclos de passos a uma velocidade de 18 centímetros por segundo. Quando o rato tiver sido treinado, capture vídeos de pelo menos cinco segundos do movimento contínuo de cada rato com uma câmera de vídeo digital de alta velocidade montada abaixo da esteira transparente.Depois de capturar pelo menos três corridas ininterruptas com cinco minutos de intervalo, desenhe uma caixa delimitadora para definir o limite da imagem do animal andando no software de imagem e insira a velocidade de execução para cada vídeo. Em seguida, inicie a análise automática pelo software. Após o processamento, o software produzirá várias planilhas relatando os índices do portão, incluindo postura, balanço, frenagem, propulsão, cadência e sequência de passos.A MIA induz alodinia mecânica e hiperalgesia térmica de maneira dose-dependente. Notavelmente, a diminuição do MWT atinge um pico de 21 dias a 28 dias antes do rebote, sugerindo que o reparo articular pode ocorrer nesta fase. Observe que o MWT do grupo MIA de três miligramas ainda está em um nível baixo nesses momentos.A mudança do TWL é aproximadamente consistente com a observada para o MWT. Com 1,5 miligramas de MIA, os níveis dos parâmetros da marcha, incluindo a área total da pata e o comprimento da passada unitária, são significativamente reduzidos no grupo MIA. Após 28 dias, sugerindo que o MIA induz dor articular relacionada à osteoartrite em ratos.A análise histopatológica por Makin Scoring revela clara degeneração da cartilagem, ruptura do colágeno e desorganização da matriz no grupo MIA. Além disso, o tratamento com 1,5 miligramas de MIA induz uma regulação positiva significativa de MMP 13 e colágeno tipo 10 e regulação negativa significativa do colágeno tipo dois. É importante encontrar a junção certa.Nenhuma resistência deve ser preenchida quando a agulha atinge o espaço atricular. Essa técnica facilitou a produção de um modelo de dor OA estável e reprodutível, dando uma importante contribuição para o desenvolvimento de medicamentos para redução da dor e aumento da função. Outro lado do IM tem um efeito extremamente objetivo na membrana de granizo e lá para máscara e as luvas devem sempre ser usadas ao preparar esta solução.

osteoarthritis-pain-model-induced-intra-articular-injection-mono

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

A osteoartrite (OA), ou doença degenerativa das articulações, é uma condição debilitante associada a dor que permanece apenas parcialmente controlada por analgésicos disponíveis. Os modelos animais estão sendo desenvolvidos para melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da dor relacionada com a OA. Aqui nós descrevemos a metodologia para o modelo monoiodoacetate de dor OA no mouse.

O Modelo Monoiodoacetate da osteoartrite Dor no mouse

Desenvolvemos uma medida evocada da dor da artrite e, juntamente com um método padronizado para medir a dor espontânea em diferentes modelos de murino de artrite induzida quimicamente. Estas medidas são sensíveis e reprodutíveis para diferentes tipos de dor nas articulações.

Espontâneas e evocadas medidas de dor em modelos murino de dor no joelho monoarticulares

Nesse protocolo, um modelo de osteoartrite de joelho foi elaborado pelo método de Videman modificado, e os procedimentos operatórios e precauções da acupotomia são detalhados. A eficácia da acupotomia tem sido demonstrada testando-se as propriedades mecânicas do quadríceps femoral e tendíneo e as propriedades mecânicas e morfológicas da cartilagem.

Aplicação de Acupotomia em Modelo de Osteoartrite de Joelho em Coelhos

Este protocolo descreve os métodos de intervenção de Tuina em modelo de osteoartrite de joelho (KOA) induzido por injeção de monoiodoacetato de sódio em ratos, que fornece uma referência para a aplicação de Tuina em modelos animais de OA. Este protocolo também estuda o mecanismo efetivo de Tuina para KOA, e os resultados ajudarão a promover sua aplicação.

Intervenção Tuina em Modelo de Osteoartrite de Joelho Induzida por Injeção de Monoiodoacetato de Sódio em Rato

Este protocolo descreve como a medição da força de mordida e do limiar de retirada da cabeça pode capturar o comportamento da dor na dor inflamatória da articulação temporomandibular (ATM) induzida por adjuvante de Freund completo (CFA).

Medição da dor na articulação temporomandibular por força de mordida e ensaios de filamento de von Frey em camundongos

O protocolo descreve como medir a hiperalgesia do joelho em camundongos. Mostramos exemplos em modelos de camundongos de dor aguda no joelho, bem como em modelos de osteoartrite (OA).

Avaliação da hiperalgesia do joelho em camundongos usando medição de aplicação de pressão

Devido à simplicidade da cirurgia e os resultados robusto comportamental, constrição crónica do nervo ciático é um dos modelos pré-eminentes animais de dor neuropática. Dentro de 24 horas após a cirurgia, hipersensibilidade à dor é estabelecido e pode ser medida quantitativamente utilizando um von Frey aesthesiometer (teste mecânico) e medidor de analgesia plantar (teste térmico).

Constrição crônica do nervo ciático e Teste de Hipersensibilidade dor em ratos

Criação de descolamento de retina experimentais com uma altura reprodutível e sustentada de desapego, e sem hemorragia sub-retiniana, é importante para o estudo da fisiopatologia da perda de células fotorreceptoras da retina na doença e avaliar intervenções terapêuticas potenciais. Relatamos tal método em detalhes.

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Apresentamos um método para induzir pressão intraocular elevada (PIO), injetando microesferas magnéticas no olho do rato, para modelar o glaucoma. Isso leva a fortes aumentos de pressão e morte neuronal extensa. Este protocolo é fácil de executar, não requer injeções repetidas e produz aumentos estáveis de PIO de longa duração.

Experimental Glaucoma induzida pela injeção de microesferas magnéticas Ocular

Hipertensão ocular crônica é induzida pela aplicação de uma sutura de circumlimbal em ratos e camundongos, levando à deterioração funcional e estrutural das células ganglionares da retina consistentes com glaucoma.

Um modelo de Glaucoma induzido por sutura Circumlimbal em ratos e camundongos

Aprenda a criar um modelo de dor em ratos usando injeção intra-articular de mono-iodoacetato. Este método reprodutível permite avaliar comportamentos relacionados à dor e alterações histopatológicas em pesquisa de osteoartrite.

Modelo de Dor da Osteoartrite Induzida pela Injeção Intra-Articular de Mono-Iodoacetato em Ratos

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