Name: Identificação de inibidores da interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio luciferase dividido (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Descubra um método de triagem para identificar inibidores da interação HBx-DDB1 usando ensaio de luciferase dividido. Esta abordagem permite detecção em tempo real sem lise celular, facilitando a descoberta de novos agentes antivirais contra HPV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado por Subvenções em Ajuda do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia, Japão (#19H03430 e #17K09405 para M.O., e #19J11829 para a K.S.), por um Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (#18H05024 a M.O.), pelo Programa de Pesquisa sobre Hepatite da Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico, AMED (para M.O., #JP19fk021005), por programa sobre o Desenvolvimento Inovador e a Aplicação de Novos Medicamentos para hepatite B #JP19fk0310102 (a K.K.) da AMED, por subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de subvenções de subvenções de subvenções de subvenções da AMED, por subvenções de a Fundação Japonesa para Enzimologia Aplicada e da Kobayashi Foundation for Cancer Research (para M.O.), da GSK Japan Research Grant 2018 (para a K.S.), e por uma doação da Miyakawa Memorial Research Foundation (para a K.S.).

NOTA:Uma representação esquemática do ensaio luciferase dividido é mostrada na Figura 1A,e o processo de ensaio é descrito na Figura 1B. A dinâmica de interação pode ser medida em tempo real sem lyse celular.
1. Preparação celular
<ol><li>Mantenha as células HEK293T cultivadas no meio modificado da Águia (DMEM) de Dulbecco complementadas com 10% v/v soro bovino fetal (FBS), 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C em 20% O2 e 5% CO2.</li>
	<li>Sementes 5 x 106 células em um prato de 100 mm com 10 mL de DMEM e incubar a 37 °C durante a noite.</li>
	<li>Transitoriamente transfect 1 μg de HBx e DDB1 com lúciferases divididos nas células de acordo com o seguinte método. NOTA:A quantidade do DNA plasmídeo transfecído pode depender do regente transfecção usado. A posição ideal da luciferase dividida fundida à proteína alvo deve ser determinada de antemão. Neste caso, a HBx fundida à LgBit no C-terminus de HBx (HBx-LgBit) e DDB1 fundida ao SmBit no N-terminus do DDB1 (SmBit-DDB1) forneceu os melhores resultados (ou seja, os sinais luciferase mais brilhantes). Este processo foi relatado anteriormente em detalhes7.<ol>
<li>Diluir 1 μg de HBx-LgBit expressando plasmid de DNA e 1 μg de SmBit-DDB1 expressando plasmid de DNA(Tabela de Materiais)em buffer de condensação de DNA(Tabela de Materiais)para um volume total de 300 μL.</li>
		<li>Adicione 16 μL de solução potenciador(Tabela de Materiais)e misture vórtice por 1 s.</li>
		<li>Incubar a amostra à temperatura ambiente por 3 min.</li>
		<li>Adicione 60 μL de reagente de transfecção(Tabela de Materiais)à amostra e misture vórtice por 10 s.</li>
		<li>Incubar a amostra à temperatura ambiente por 8 min.</li>
		<li>Durante a incubação, aspirar o meio de cultura do prato (preparado no passo 1.2), e lavar as células com 5 mL de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS). Remover PBS por aspiração e adicionar 7 mL de DMEM.</li>
		<li>Adicione 3 mL de DMEM ao tubo contendo os complexos de transfecção. Misture por pipetting e adicione os complexos de transfecção para a célula no prato de 10 cm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C em uma incubadora abaixo de 5% CO2 para 10 h.</li>
	<li>Reseed as pilhas em uma placa branca de 96 poços em 5 x 104 pilhas/bem em 50 μL do meio/poço de acordo com o seguinte método.<ol>
<li>Remova o meio gastado da cultura da pilha e lave pilhas com 5 mL de PBS.</li>
		<li>Remover PBS por aspiração, adicionar 1 mL de 0,25% trypsin-EDTA, e incubar a 37 ° C para 5 min para separar as células.</li>
		<li>Adicione 4 mL de DMEM e disperse o meio tubulação sobre a superfície da camada celular várias vezes. Transfira a suspensão celular para um tubo.</li>
		<li>Células centrífugas a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Descarte supernatant e resuspenda a pelota da pilha em 1 mL de PBS.</li>
		<li>Centrífuga a suspensão celular a 500 x g por 5 min à temperatura ambiente e descartar supernatant.</li>
		<li>Diluir a pelota celular com meio de cultura de células tamponadas(Tabela de Materiais)complementada com 10% FBS a uma densidade de semeadura de 1,0 x 106 células/mL.</li>
		<li>Pipete 50 μL de suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços e devolver as células para a incubadora.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubate células a 37 °C abaixo de 5% CO2 para 10 h.</li>
</ol>2. Triagem composta
<ol><li>Durante a incubação, diluir os compostos de triagem(Tabela de Materiais)e solvente (dimetil sulfoxide [DMSO]) em 13,5 x concentração. Por exemplo, se o estoque for de 10 mM e a concentração de triagem for de 10 μM, adicione 1 μL de solução de estoque a 73,1 μL de meio de cultura de células tamponadas.</li>
	<li>Adicione 12,5 μL de substrato luminescente(Mesa de Materiais)a cada poço e incubar por 5 min à temperatura ambiente. NOTA:Como controles negativos, os poços em ambas as extremidades da placa (ou seja, colunas 1 e 12) não devem conter nenhum substrato luminescente.</li>
	<li>Medir a luminescência de base usando um luminometer(Tabela de Materiais).</li>
	<li>Imediatamente após a medida inicial, adicione 5 μL de compostos e controle DMSO diluído na etapa 2.1 para cada poço. NOTA:A concentração final será de 10 μM.</li>
	<li>Medir os valores de luminescência a cada 30 min por 2 h. NOTA:A placa deve ser incubada no escuro à temperatura ambiente.</li>
	<li>Calcule os efeitos inibitórios em comparação com o tratamento de DMSO de controle após a normalização dos sinais de base. NOTA:Triagem de cada composto em duplicado ou triplicado pode reduzir a variação.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+hepatitis+B+infection%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Chronic hepatitis B infection: a review.</a> The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+pathogenesis%3A+Fresh+insights+into+hepatitis+B+virus+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA.</a> World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).</li>
<li>Slagle, B. L., Bouchard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+and+regulation+of+viral+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).</li>
<li>Murphy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+Virus+X+Protein+Promotes+Degradation+of+SMC5%2F6+to+Enhance+HBV+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication.</a> Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).</li>
<li>Decorsière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+B+virus+X+protein+identifies+the+Smc5%2F6+complex+as+a+host+restriction+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor.</a> Nature. 531, 386-389 (2016).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Smc5%2F6+complex+restricts+HBV+when+localized+to+ND10+without+inducing+an+innate+immune+response+and+is+counteracted+by+the+HBV+X+protein+shortly+after+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection.</a> PLoS One. 12, e0169648(2017).</li>
<li>Sekiba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HBV+Transcription+From+cccDNA+With+Nitazoxanide+by+Targeting+the+HBx-DDB1+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).</li>
<li>Eggers, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).</li>
<li>Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+Methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics.+2014%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: Methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robotic+Platform+for+Quantitative+High-Throughput+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).</li>
<li>Skwarczynska, M., Ottmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions as drug targets.</a> Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).</li>
<li>de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-host+interactomics%3A+New+insights+and+opportunities+for+antiviral+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery.</a> Genome Medicine. 6, 115(2014).</li>
<li>Prasad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-Host+Interactions%3A+New+Insights+and+Advances+in+Drug+Development+Against+Viral+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens.</a> Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Desenvolvemos um método de triagem conveniente usando um ensaio lúciferase dividido para encontrar inibidores de ligação HBx-DDB1. A dinâmica de interação pode ser detectada em tempo real em células vivas sem a necessidade de lyse celular. A inibição da interação HBx-DDB1 leva à restauração do Smc5/6, o que resulta na supressão da transcrição viral, expressão proteica e produção de cccDNA7. Este novo mecanismo de ação antiviral pode superar as inadequações das terapias atuais de HBV.
<p class=...

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma grande preocupação de saúde pública em todo o mundo, com estimativas anuais de 240 milhões de pessoas cronicamente infectadas com HBV e 90.000 mortes devido a complicações da infecção, incluindo cirrose e carcinoma hepatocelular (HCC)1. Embora os atuais agentes terapêuticos anti-HBV, análogos nucleos (t)ide, inibem suficientemente a transcrição reversa viral, eles raramente conseguem a eliminação de proteínas virais, que é o objetivo clínico de longo prazo. Seu efeito pobre na eliminação viral da proteína é devido a sua falta do efeito direto na transcrição viral dos minicromossomos circulares covalently fechados do ADN (cccDNA) do episóros no núcleo do hepatocyte2.
A transcrição do HBV é ativada pela proteína X (HBx) reguladora do HBV3. Estudos recentes revelaram que o HBx degrada a manutenção estrutural dos cromossomos 5/6 (Smc5/6), um fator de restrição de hospedeiro que bloqueia a transcrição do HBV do cccDNA, através do sequestro de um complexo de onipresença DDB1-CUL4-ROC1 E34,5,6. Portanto, um passo crucial na promoção da transcrição viral do cccDNA é pensado para ser a interação HBx-DDB1. Compostos capazes de inibir a ligação entre HBx e DDB1 podem bloquear a transcrição viral, e de fato o nitazoxanida foi identificado como um inibidor da interação HBx-DDB1 através de um sistema de triagem desenvolvido em nosso laboratório7.
Aqui, apresentamos nosso conveniente sistema de triagem usado para identificar inibidores da interação HBx-DDB1, que utiliza um ensaio complementar lúciferase dividido7,8. As subunidades luciferase divididas são fundidas ao HBx e ao DDB1, e a interação HBx-DDB1 traz as subunidades para perto para formar uma enzima funcional que gera um sinal luminescente brilhante. Como a interação entre as subunidades é reversível, este sistema pode detectar proteínas HBx-DDB1 ràpida dissociando (Figura 1). Usando este sistema, uma grande biblioteca composta pode ser facilmente rastreada, o que pode resultar na descoberta de novos compostos capazes de inibir eficientemente a interação HBx-DDB1.

<table><tbody><tr><td>Microplaca de cultura celular, 96 poços, PS, F-BOTTOM</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Tocris Bioscience</td><td>3176</td><td></td></tr><tr><td>Reagente de transfecção Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301425</td><td>Inclui tampão de condensação de DNA, solução intensificadora e reagente de transfecção</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Nichirei</td><td></td><td></td>175012</tr><tr><td>GloMax 96 microplate luminometer</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>HBx&ndash; LgBit expressando plasmídeo de DNA</td><td>Nosso laboratório</td><td></td><td>Disponível mediante solicitação</td></tr><tr><td>HEK293T células</td><td>Coleção de cultura American Type</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>NanoBiT PPI starter systems</td><td>Promega</td><td>N2015</td><td>Inclui Nano-Glo Reagente de células vivas</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td>Descrito como "meio de cultura de células tamponadas" no manuscrito</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Takara</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Screen-Well Biblioteca de medicamentos aprovada pela FDA V2 versão 1.0</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-2841</td><td>Os compostos usados aqui foram os seguintes: mequinol, hidrato de mercaptopurina, mesna, mestranol, hemissulfato de metaproterenol, bitartarato de metaraminol, metaxalone, cloreto de metacolina, metazolamida, hipurato de metenamina, metocarbamol, metotrexato, metoxsaleno, brometo de metescopolamina, metsuximida, metitotiazida, aminolevulinato de metila e middot; HCl, maleato de metilergonovina, metolazona, metirapona, mexiletina&middot; HCl, micafungina, miconazol, midodrina&middot; HCl, miglitol, milnacipran&middot; HCl, mirtazapina, mitotano, moexipril e middot; HCl, furoato de mometasona, mupirocina, nadolol, nafcilina&middot; Na, naftifine&middot; HCl, naratriptano&middot; HCl, natamicina, nebivolol&middot; HCl, nelarabina, nepafenaco, nevirapina, niacina, nicotina, nilotinibe, nilutamida, nitazoxanida, nitisinona, nitrofurantoína, nizatidina, nortriptilina e middot; HCl, olsalazina&middot; Na, orlistat, oxaprozina, oxtrifilina, cloreto de oxibutinina, oxitetraciclina&middot; HCl, paliperidona, palonossetrom&middot; HCl, sulfato de paromomicina, pazopanibe&middot; HCl, pemetrexedo dissódico, pemirolaste de potássio, penicilamina, penicilina G de potássio, pentamidina isetionato, pentostatina, perindopril erbumina, permetrina, perfenazina, fenelzina sulfato, fenilefrina, fitonadiona, pimecrolimus, pitavastatina de cálcio e podofilox</td></tr><tr><td>SmBit&ndash; Plasmídeo de DNA expressando DDB1</td><td>Nosso laboratório</td><td></td><td>Disponível mediante solicitação</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

identificação de inibidores da interação hbx-ddb1 usando um sistema de ensaio luciferase dividido

Identifying Inhibitors of the HBx-DDB1 Interaction Using a Split Luciferase Assay System

Há uma necessidade urgente de novos agentes terapêuticos para a infecção pelo vírus da hepatite B (HBV). Embora os análogos de nucleos (t)ide atualmente disponíveis inibem potentemente a replicação viral, eles não têm efeito direto na expressão de proteínas virais transcritas de um DNA circular covalmente fechado viral (cccDNA). Como a alta carga de antígenos virais pode desempenhar um papel nessa carcinogênese crônica e relacionada ao HBV, o objetivo do tratamento com HBV é erradicar as proteínas virais. A proteína reguladora X (HBx) do HBV liga-se à proteína de ligação ao dano ao DNA do hospedeiro 1 (DDB1) proteína para degradar a manutenção estrutural dos cromossomos 5/6 (Smc5/6), resultando na ativação da transcrição viral do cccDNA. Aqui, usando um sistema de ensaio de complementação lúciferase dividido, apresentamos um sistema abrangente de triagem composta para identificar inibidores da interação HBx-DDB1. Nosso protocolo permite a fácil detecção da dinâmica de interação em tempo real dentro das células vivas. Esta técnica pode tornar-se um ensaio fundamental para descobrir novos agentes terapêuticos para o tratamento da infecção por HBV.

Os resultados representativos após o uso deste protocolo são mostrados na Figura 2A,B. A relação sinal/fundo foi superior a 80 e o fatorZ 9 (o índice de qualidade padrão-ouro para triagem de alta taxa de produção) foi superior a 0,5, indicando que esse sistema de ensaio era aceitável para triagem de alta taxa de produção. Com o limiar definido para &gt;40% inibição em comparação com o controle (DMSO apenas), identifica...

Aqui, apresentamos um método para triagem de agentes virais anti-hepatite B que inibem a interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio lúciferase dividido. Este sistema permite a fácil detecção de interações proteína-proteína e é adequado para identificar inibidores de tais interações.

Identificação de inibidores da interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio luciferase dividido

There is an urgent need for novel therapeutic agents for hepatitis B virus (HBV) infection. Although currently available nucleos(t)ide analogs potently ...

A interação HBX-DDB1 é um passo crucial para promover a transcrição do HPV a partir do CCCDNA, de modo que este protocolo pode se tornar um ativo fundamental para descobrir novos agentes terapêuticos para a cura funcional do HPV. Nosso procedimento é simples e requer apenas um curto período de tempo para tela. A interação que misturo pode ser detectada em tempo real sem precisar de lise celular.Além disso, a qualidade de triagem é satisfatória com uma pontuação máxima Z. A inibição da interação HBX-DDB1 leva à restauração do Smc5/6, que resulta em supressão da transcrição do HPV, expressão proteica e produção de CCCDNA. Este novo mecanismo de ação antiviral pode superar as inadequações das terapias atuais do HPV.Interações proteína-proteína são importantes alvos de drogas. O ácido à base de luciferase dividido descrito aqui, que tem como alvo as interações entre proteínas virais e hass, pode fornecer uma nova estratégia para desenvolver curas para outras doenças infecciosas. Embora nosso protocolo seja simples e fácil de entender, alguns passos podem ser difíceis de reproduzir sem a demonstração visual.Assim, a demonstração visual será uma grande ajuda para entender nosso protocolo. Comece semeando cinco vezes 10 para as células HEK293T em um prato de 100 milímetros com 10 mililitros de DMEM, e incubando-as durante a noite a 37 graus celsius. No dia seguinte, diluir um micrograma cada um de HBx-LgBit e SmBit-DDB1 expressando plasmídeos de DNA e tampão de condensação de DNA para um volume total de 300 microliters.Adicione 16 microliters de solução melhoradora e misture os tubos por vórtice por um segundo. Incubar a amostra à temperatura ambiente por três minutos e, em seguida, adicionar 60 microliters de reagente de transfecção. Vórtice do tubo por 10 segundos, e incubar a amostra por mais oito minutos.Enquanto isso, aspire o meio do prato com as células e lave-os com cinco mililitros de PVS. Aspire o PVS e adicione sete mililitros de DMEM. Adicione três mililitros de DMEM ao tubo com os complexos de transfecção, pipeta para cima e para baixo para misturar, e adicione a mistura às células.Em seguida, incubar as células a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono por 10 horas. Após a incubação, remova o meio de cultura gasto e lave as células com cinco mililitros de PVS. Remova o PVS a um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA, e incuba as células a 37 graus celsius para desligá-las.Em seguida, adicione quatro mililitros de DMEM e disperse o meio ao escoria-lo sobre a superfície da camada celular várias vezes, e transfira a suspensão para um tubo. Centrifugar as células a 500 vezes G por cinco minutos, depois descartar o supernasce, e suspender novamente a pelota celular em um mililitro de PVS. Repita a cetrifugação e descarte o supernatante.Em seguida, suspenda novamente a pelota celular com meio de cultura celular tamponada complementada com 10% de FBS a uma densidade de semeadura de um milhão de células por mililitro. Pipeta 50 microliters da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços, e retornar as células para a incubadora de 37 graus celsius por 10 horas. Enquanto as células estão incubando, dilui os compostos de triagem e solvente para concentração de 13,5 X.Adicione 12,5 microliters de substrato luminescente a cada poço e incubar a placa por cinco minutos em temperatura ambiente. Meça a luminescência da linha de base com um luminômetro e adicione cinco microliters dos compostos e DMSO controlados a cada poço imediatamente depois. Meça a luminescência a cada 30 minutos durante duas horas e, em seguida, calcule os efeitos inibitórios dos compostos em comparação com o tratamento DMSO.Os sinais de luminescência da linha de base foram medidos, e a relação sinal-fundo foi calculada para ser superior a 80. O z prime foi superior a 0,5, indicando que este sistema de ensaio é aceitável para a triagem de alto rendimento. Ao definir o limiar para maior inibição de 40% em comparação com o controle somente do DMSO, o nitazoxanide foi identificado como uma droga candidata.Identificamos anteriormente o nitazoxanida como um inibidor da interação HBX-DDB1, rastreando uma biblioteca composta de pequena escala de reatividade com este método. Usando nitazoxanida, confirmamos essa inibição da interação HBX-DDB1, essa redução da transcrição viral e os níveis subsequentes do produto viral. A porção ideal da luciferase dividida fundida a uma proteína alvo deve ser determinada de antemão.Neste caso, o HPX fundido ao Large Bit no cupins C do HPX e DDB1 fundido ao Small Bit no final do DDB1 proporcionou os melhores resultados.

identifying-inhibitors-hbx-ddb1-interaction-using-split-luciferase

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

Este vídeo demonstra o ensaio de complementação de luciferase dividida para detectar interações proteína-proteína. Neste ensaio, as proteínas de interesse são marcadas em pequenos e grandes fragmentos da enzima luciferase. Quando as proteínas interagem, os fragmentos grandes e pequenos se combinam para formar um complexo enzimático ativo, que na presença de um substrato específico, libera luminescência brilhante que pode ser medida.

Ensaio de complementação de luciferase dividida para identificar interações proteína-proteína específicas

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

As interações entre proteínas são fundamentais para todos os processos celulares. Usando bioluminescência Transferência de Energia de Ressonância, a interacção entre um par de proteínas podem ser monitoradas em células vivas e em tempo real. Além disso, os efeitos das mutações potencialmente patogénicos pode ser avaliada.

Investigando interações proteína-proteína em células vivas usando a transferência de Bioluminescência Resonance Energy

As proteínas interagem entre si e essas interações determinam em grande parte suas funções. Os parceiros de interação proteica podem ser identificados em alto rendimento in vivo usando um ensaio de aptidão de levedura baseado no ensaio de complementação de fragmentos de proteína diidrofolato redutase (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

Nós fornecemos um protocolo passo a passo para dividir-BioID, um ensaio de fragmentos-complementação de proteínas com base na técnica de criação de etiquetas de proximidade BioID. Ativado na interação das duas proteínas determinadas, permite a análise proteômica de contexto-dependente da proteína em seu ambiente nativo do celular. O método é simples e econômica e só requer equipamentos de laboratório padrão.

Split-BioID — Proteomic análise de complexos de proteínas específicas do contexto em seu ambiente nativo do celular

Aqui nós apresentamos um biossensor baseado em luciferase para quantificar a atividade da quinase do supressor do tumor grande (LATS)-uma quinase central no Hippo via de sinalização. Este biosensor tem diversas aplicações na pesquisa básica e translacional, visa investigar hipopótamo via reguladores in vitro e em vivo.

Monitoramento de hipopótamo, sinalizando o Pathway atividade usando um Tumor grande baseado em Luciferase supressor (LATS) Biosensor

Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

Neste artigo, nós apresentamos um jogo de métodos práticos e viáveis para caracterizar mutantes doença-relacionados de kinases da família do RAF, que incluem o ensaio in vitro da quinase, o ensaio da coativação do RAF, e o ensaio rachado complementar do luciferase.

Caracterizar Mutants relacionados à doença da família da RAF kinases usando um conjunto de métodos práticos e viáveis

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a interação eIF4E-eIF4G em células vivas que permitiria ao usuário avaliar a perturbação induzida por drogas da dinâmica complexa eIF4F em formatos de triagem.

Monitorando o conjunto eIF4F medindo a interação eIF4E-eIF4G em células vivas

Estabelecemos um ensaio de remontagem de luciferase dividida para monitorar os contatos retículo-mitocôndria endoplasmática em células vivas. Usando este ensaio, descrevemos um protocolo para medir quantitativamente o nível desses acoplamentos inter-organelas em HEK293T células, sob a condição de tratamento químico.

Ensaio de remontagem de luciferase dividida para medir contatos de retículo endoplasmático-mitocôndrias em células vivas

Descubra um método de triagem para identificar inibidores da interação HBx-DDB1 usando ensaio de luciferase dividido. Esta abordagem permite detecção em tempo real sem lise celular, facilitando a descoberta de novos agentes antivirais contra HPV.

Identificação de inibidores da interação HBx-DDB1 usando um sistema de ensaio luciferase dividido

Explorar mais vídeos