Name: Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a estudar a modulação pós-transcricional de mRNA em células epiteliais alveolares primárias usando um sistema de expressão plasmídeo induzível com eletroporação por pipeta. Este método minimiza a disrupção da fisiologia celular.

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Francis Migneault foi apoiado por uma bolsa da Rede de Saúde Respiratória de Quebec e do programa de treinamento pulmonar do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR), um estudante da FRSQ e um aluno da Faculdade des Études Supérieures et Pós-doutorado, Université de Montréal. Este trabalho foi apoiado pela Cátedra Gosselin-Lamarre em pesquisa clínica e pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde [YBMOP-79544].

Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Conselho Canadense de Cuidados Com Animais e aprovados pelo Comitê de Cuidados Institucionais com Animais do Centro de Pesquisa do Centro Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM).
1. Projeto e geração do plasmídeo de resposta expressando o gene de interesse (GOI)
<ol><li>Use um vetor de tetraciclina-off induível, como o pTRE-Tight.</li>
	<li>Analisar a sequência do ID e o site de clonagem múltipla (MCS) do vetor para identificar os locais de restrição no MCS que não estão presentes internamente no GOI.</li>
	<li>Isolar células epiteliais alveolares primárias dos pulmões de rato sprague-dawley machos como descrito anteriormente19,20.</li>
	<li>Purifique o RNA total das células epiteliais aláscas por extração de RNA usando um método padrão, como extração de fenol/clorofórmio ou o uso de colunas de giro de RNA baseadas em sílica.</li>
	<li>Transcreve o mRNA em DNA complementar (cDNA) usando oligo(dT) e transcriptase reversa de alta fidelidade.</li>
	<li>Use polimerase Taq de alta fidelidade e técnicas padrão de PCR de sobreposição para flanquear o GOI com dois locais de reconhecimento de enzimas de restrição selecionados usando primers projetados.<ol>
<li>Que o primer dianteiro contenha um local de ligação ribossomos de consenso Kozak21 para melhorar os níveis de expressão para estudar a expressão proteica em paralelo com a estabilidade do mRNA. Uma seqüência que codifica o epítopo V5 a montante do GOI deve ser incluída para distinguir a expressão do GOI transfeccionado da expressão endógena(Tabela 1).</li>
		<li>Faça com que o primer reverso contenha um sinal de polianegação após o códon de parada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mutantes podem ser gerados por exclusão seqüencial para estudar os efeitos de diferentes regiões utr de 3' sobre a estabilidade do mRNA do GOI usando primers reversos codificando um site de polianegação que gradualmente exclui o final de 3' do Goi 3' UTR (Figura 6). Alternativamente, a mutagênese dirigida ao PCR pode ser usada para atingir uma região específica de interesse no UTR22de 3'' .</li>
	<li>Digerir o vetor indutor e a inserção com as enzimas de restrição previamente escolhidas na temperatura de incubação apropriada por 1h, seguido de tratamento com fosfatase durante a reação vetorial por 30 min para evitar a auto-ligadura.</li>
	<li>Separe os segmentos de vetor digerido e insira por eletroforese em um gel de agarose de 1-1,5% (concentração dependendo do tamanho da inserção).</li>
	<li>Usando uma lâmina e uma luz UV, colete os fragmentos de DNA contendo a inserção desejada e vetor a ser ligado. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	<li>Purifique os segmentos coletados do gel de agarose usando um kit de purificação pcr à base de sílica e meça a concentração por espectrofotometria a 260 nm.</li>
	<li>Ligao o GOI e o vetor induível com ligase de DNA T4 usando uma razão vetor:inserir molar de 1:3 para aumentar a probabilidade de ligadura. Incubar a reação à temperatura ambiente (RT) por 3 h.</li>
	<li>Transforme a reação de ligadura em E. coli competente (DH5α).<ol>
<li>Adicione 1-10 ng de vetor e gene a um tubo contendo 100 μL de células competentes. Incubar as células no gelo por 30 min e, em seguida, células de choque térmico a 42 °C para 45 s. Coloque o tubo no gelo por 2 min e adicione 900 μL de RT LB médio. Incubar as células por 1 h a 37 °C com agitação a 225 rpm.</li>
		<li>Espalhe 100 μL da reação em uma placa de ágar LB com um antibiótico adequado (por exemplo, ampicillin a 100 μg/mL para o vetor pTRE-Tight) para selecionar as bactérias transformadas. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.</li>
		<li>Selecione colônias individuais usando um laço de inoculação ou uma ponta de 20 μL e incubar durante a noite em meio de 5 mL LB contendo o antibiótico adequado a 37 °C com agitação. As bactérias transformadas podem ser armazenadas em estoques de glicerol a -80 °C a uma razão de 400:600 de LB médio para glicerol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrair o DNA plasmídeo usando colunas plasmáticas à base de sílica e medir a concentração por espectrofotometria a 260 nm. Confirmar a inserção do IGo por meio da análise de restrição e sua orientação e a ausência de mutações potencialmente introduzidas durante o TR-PCR por sequenciamento.</li>
</ol>2. Transfecção do plasmídeo de resposta expressando o gene de interesse (IGo) em células epiteliais alveolares primárias
<ol><li>Isole células epiteliais alveolar tipo II dos pulmões de ratos.</li>
	<li>Semeie as células a uma densidade de 1 x 106 células/cm2 em placas de Petri de 100 mm com meio essencial mínimo completo (MEM completo). MEM completo é suplementado com 10% de FBS, 0,08 mg/L tobramicina, Septra (3 μg/mL trimetoprim e 17 μg/mL sulfametoxazol), 0,2% NaHCO3, 0,01 M HEPES (pH = 7,3) e 2 mM L-glutamina. Cultura as células para 24h a 37 °C em 5% CO2 em uma incubadora umidificada.</li>
	<li>No dia seguinte, coloque 500 μL de MEM completo sem antibiótico em cada poço de uma nova placa de 12 poços e pré-aqueça a placa a 37 °C por 30 min. Durante esta etapa, é importante usar o soro bovino fetal livre de tetraciclinas contaminantes ou com um nível muito baixo para interferir na inducibilidade.</li>
	<li>Preparar tubos de 1,5 mL contendo o plasmídeo com o INDÁVEL (plasmídeo GOI) e o vetor regulatório (por exemplo, pTet-Off) adicionando 1 μg de plasmídeo GOI e 1 μg de vetor regulatório por poço na RT. Para experimentos de coexpressão com proteínas de ligação de RNA (RBP), 1 μg de um vetor constitutivo (por exemplo, pcDNA3) expressando o RPB de interesse é adicionado à mistura de DNA(Figura 7).</li>
	<li>Aspirar o meio e enxaguar suavemente as células com PBS (sem cálcio e magnésio) pré-aquecido a 37 °C.</li>
	<li>Adicione 5 mL de 0,05% de tripsina pré-aquecida a 37 °C e incubar as células até que as células estejam separadas (2-4 min). Neutralizar a tripsina adicionando 10 mL de MEM completo sem antibiótico.</li>
	<li>Recolher a suspensão celular em um tubo de 50 mL, lavar a placa de Petri com 4 mL de meio para coletar o maior número possível de células restantes e, em seguida, centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Aspirar suavemente e descartar o sobrenadante e resuspender a pelota em 1 mL de PBS. Conte e calcule o número de células usando um hemocímetro.</li>
	<li>Centrifugar as células a 300 x g por 5 min. Aspirar suavemente o sobrenadante e resuspender a pelota em tampão de resuspensão a uma concentração de 4 x 107 células/mL. Adicione as células do tubo de 1,5 mL preparados na etapa 2.4 a uma concentração de 400.000 células por poço e misture-as suavemente, pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Coloque o tubo no dispositivo de eletroporação e encha-o com 3,5 mL de tampão eletrolítico.</li>
	<li>Insira uma ponta de eletrodo banhada a ouro em uma pipeta pressionando completamente o pistão. Misture suavemente o conteúdo do tubo de 1,5 mL e apiratee cuidadosamente as células com a pipeta. Tenha cuidado para evitar que bolhas de ar entrem na ponta, pois isso causará arco elétrico durante a eletroporação e levará à diminuição da eficiência de transfecção.</li>
	<li>Insira a pipeta na estação de eletroporação até que haja um som de clique.</li>
	<li>Selecione o protocolo de eletroporação apropriado para células epiteliais alveolares, correspondente a uma tensão de pulso de 1.450 V e 2 pulsos com largura de 20 ms, e pressione Iniciar na tela sensível ao toque.</li>
	<li>Imediatamente após a transfecção, remova a pipeta e transfira as células para um poço previamente preenchido com MEM completo sem antibiótico que tenha sido pré-aquecido a 37 °C.</li>
	<li>Repita as etapas 2.11-2.14 para as demais amostras.</li>
	<li>Agite suavemente a placa para espalhar as células uniformemente sobre a superfície do poço. Incubar as células a 37 °C em 5% de CO2 em uma incubadora umidificada. Após 2 dias, substitua o meio por MEM completo por antibióticos.</li>
	<li>Confirme o sucesso da transfecção observando a expressão de eGFP um microscópio de fluorescência ou por citometria de fluxo usando um vetor de controle (Figura 1). NOTA: Esta etapa é opcional e requer uma etapa adicional de transfecção usando um eGFP de expressação plasmid diferente, como pcDNA3-EGFP.</li>
</ol>3. Indução da inibição de transcrição do GoI
NOTA: As células podem ser pré-tratadas com os tratamentos desejados antes da indução de doxiciclina para avaliar seu impacto na estabilidade do mRNA (Figura 5).
<ol><li>Prepare uma solução de estoque de doxiciclina de 1 mg/mL em água desionizada. Armazene a solução de estoque a -20 °C protegida da luz. A doxiciclina, uma derivada tetraciclina, é usada em vez de tetraciclina porque tem uma meia-vida mais longa (2x) do que a tetraciclina. Além disso, é necessária uma menor concentração de doxiciclina para a inativação completa do operon tet 23. NOTA: A doxiciclina pode afetar a expressão mRNA do GOI endógeno. Para verificar isso, o efeito de um tratamento de 24 h com doxiciclina em células alveolares deve ser testado para confirmar a ausência de alterações na expressão de GOI (Figura 2).</li>
	<li>Prepare uma solução de doxiciclina fresca de 1 μg/mL em completa pós-transfecção MEM 72 h e aqueça-a a 37 °C.</li>
	<li>Substitua o meio por 1 mL de MEM completo contendo 1 μg/mL de doxiciclina por poço para inibir a transcrição do GOI.</li>
	<li>Incubar múltiplos poços a 37 °C em 5% de CO2 para diferentes quantidades de tempo de 15 min-6 h para avaliar a meia-vida mRNA do GOI.</li>
	<li>No final do tratamento, lave as células com PBS frio e lyse--com um kit de extração de RNA fenol-clorofórmio comercialmente disponível adicionando 500 μL de tampão por poço e agitando a placa para homogeneizar as células.</li>
	<li>Isole o RNA de acordo com o protocolo do fabricante. Determine o rendimento e a pureza do RNA por espectrofotometria em 230, 260 e 280 nm. As amostras de RNA com 260:230 e 260:280 de 1,8 e 2,0, respectivamente, são consideradas puras. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
</ol>4. Determinando a estabilidade do mRNA do GOI
<ol><li>Tratamento de 1 μg de RNA total com DNAse I livre de RNAse (grau de amplificação) para remover qualquer traço de DNA plasmático que possa interferir com a amplificação subsequente do DNA.<ol>
<li>Em um tubo PCR de 0,2 mL, combine 1 μg de RNA total, 1 μL de 10x de tampão de reação DNase I, 1 μL de DNAse I (1 U/μL) e água sem RNAse para obter um volume total de 10 μL.</li>
		<li>Incubar a reação em RT por 20 min.</li>
		<li>Desativar o DNAse I adicionando 1 μL de 25 mM EDTA à mistura de reação de 10 μL e incubando a reação a 70 °C por 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcreve o RNA total esgotado de DNA em cDNA usando um kit de síntese de CDNA comercialmente disponível com uma mistura de oligo(dT) e primers hexamer aleatórios para melhorar a eficiência da transcrição reversa.<ol>
<li>Resumidamente, adicione 4 μL de mistura de reação de 5x, 1 μL de transcriptase reversa e 4 μL de água livre de RNAse a 11 μL da mistura total de RNA empobrecida por DNA para obter um volume de reação total de 20 μL. Misture bem a reação encanando-a para cima e para baixo.</li>
		<li>Incubar a reação por 5 min a 25 °C, seguido por 20 min a 46 °C, e depois inativar a reação incubando-a a 95 °C por 1 min. Cada reação produzirá 50 ng/μL de produto cDNA.</li>
		<li>Diluir a reação do CDNA a uma concentração de 5 ng/μL adicionando 180 μL de água de grau de biologia molecular à mistura de reação de 20 μL. Armazene os produtos de cDNA a -80 °C ou proceda imediatamente para realizar pcr quantitativo em tempo real (qPCR). NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.</li>
	</ol></li>
	<li>Projete primers qPCR reversos para frente e para trás específicos do GOI.<ol>
<li>Devido à expressão endógena do GOI nas células, os primers devem ser projetados para amplificar um amplicon de 100-150 bp do epítopo V5 acoplado ao GOI (Tabela 1).</li>
		<li>Primers de genes de referência interna também devem ser usados como controles de normalização. Normalmente, genes de limpeza, como os genes beta-actina e hipoxantina fosforibosyltransferase 1, são usados como genes de referência. No entanto, estes não podem ser utilizados com este sistema de indução devido à variação da eficiência da transfecção. Em vez disso, a expressão da transcrição tTA-Ad é avaliada para fins de normalização, pois sua expressão é constitutiva nas células devido à atividade do promotor do citomegalovírus. Qualquer variação em sua expressão medida pelo qPCR será representativa da eficiência de transfecção (primers: forward 5'-GCC TGA CGA CAA GGA AAC TC-3' e reverso 5'-AGT GGG TAT GAT GCC TGT CC-3; 129 bp amplicon) e permitirá a normalização da expressão dos clones transinfectados(Figura 3).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare cada reação qPCR em triplicado usando uma mistura de mestre de tine verde SYBR.<ol>
<li>Diluir a mistura de cDNA de 5 ng/μL para uma concentração de 1,25 ng/μL usando água de grau de biologia molecular.</li>
		<li>Combine 5 μL de mistura de mestre de tine verde SYBR (2x), 0,1 μL de água de grau de biologia molecular, 0,45 μL de 7,5 μM de primer dianteiro, 0,45 μL de primer reverso de 7,5 μM e 4 μL de 1,25 ng/μL cDNA para obter um volume de reação total de 10 μL. Misture bem, pipetando para cima e para baixo em uma placa PCR de 96 poços. Use filme adesivo óptico para garantir que a tampa da placa esteja selada e para evitar contaminação e evaporação.</li>
		<li>Gire a mistura de reação brevemente por centrifugação e coloque a placa em um termociclador qPCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Amplie os amplicons GOI e tTA-Ad com etiqueta V5 usando as seguintes condições qPCR: 95 °C para 10 min como etapa de desnaturação, seguido por 40 ciclos de 95 °C para 10 s, 58 °C para 15 s e 72 °C para 20 s. Uma curva de fusão de alta resolução deve ser gerada após a realização dos ciclos de amplificação para avaliar as temperaturas específicas de fusão dos amplicons desejados e para garantir a ausência de picos de ruído amplicon.<ol>
<li>Inclua controles negativos para o qRT-PCR realizando qPCR com RNA como modelo sem transcrição reversa para servir como um controle para contaminação potencial de DNA plasmídeo e qPCR sem cDNA adicionado à mistura qPCR para garantir a falta de dimers primer ou Contaminantes.</li>
		<li>A concentração ideal de CDNA, a eficiência do primer e a concentração devem ser otimizadas de acordo com o IDI por um ensaio de curva padrão. Para isso, realize uma diluição serial usando cDNA de células não tratadas (cultivadas sem doxiciclina). A curva padrão é gerada plotando os valores de Cq em relação ao registro do fator de diluição do cDNA, e a eficiência de amplificação (E) é calculada de acordo com a inclinação da curva padrão usando a seguinte fórmula: E = 10-1/inclinação NOTA: A eficiência de amplificação deve ser de aproximadamente 0,9 a 1,05. Caso contrário, os primers devem ser redesenhados.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisar os dados qPCR utilizando o método Cq comparativo normalizando os valores de expressão do IG à expressão do tTA-Ad para obter os níveis de expressão relativa do IDM e relatar sua expressão como percentual da expressão mRNA do GOI em células do mesmo animal no ponto de partida (t = 0) (Figura 4).</li>
	<li>A meia-vida é determinada a partir da constante de taxa (K) da curva de degradação de GOI mRNA usando a seguinte equação: t1/2 = em 2/K.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A baixa taxa de transfecção de células epiteliais alveolares na cultura primária tem sido uma séria limitação para o uso do sistema Tet-Off para avaliar a estabilidade do mRNA nessas células. No entanto, essa limitação foi superada pela eletroporação da pipeta, permitindo uma eficiência de transfecção de 25-30%(Figura 1 e Figura 3)26.
A medição da estabilidade da transcrição é fundamental para compreender a mod...

Várias técnicas foram desenvolvidas para determinar a meia-vida dos mRNAs. A técnica de decaibilidade de perseguição de pulso, que utiliza mRNAs rotulados, permite a avaliação simultânea de uma grande piscina de mRNAs com perturbação celular mínima. No entanto, essa abordagem não permite uma estimativa direta da meia-vida de uma única transcrição genética e não pode ser implementada para estudar a modulação pós-transcricional de um mRNA após a estimulação com fatores de crescimento, ROS, alarminas ou inflamação1.
O uso de inibidores de transcrição, como actinomicina D e α-amanitina, é um método relativamente simples para medir a cinética da degradação do mRNA ao longo do tempo. Uma das principais vantagens dessa abordagem em relação à das técnicas anteriores, (ou seja, perseguição de pulso) depende da capacidade de estimar diretamente a meia-vida de uma determinada transcrição e comparar como diferentes tratamentos poderiam afetar sua cinética de degradação. No entanto, o impacto deletério significativo dos inibidores de transcrição na fisiologia celular representa uma grande desvantagem da abordagem2. De fato, a inibição de todo o transcriptome celular com essas drogas tem o efeito colateral negativo de perturbar a síntese de elementos-chave envolvidos na estabilidade do mRNA, como microRNAs (miRNAs), bem como a expressão e síntese de proteínas de ligação de RNA, que são importantes para a degradação e estabilidade do mRNA. A perturbação severa da transcrição genética por essas drogas poderia, portanto, modificar as curvas de degradação das transcrições.
O sistema de indução do promotor representa uma terceira abordagem para medir a meia-vida de um mRNA específico. Este método mede a degradação de um mRNA específico de forma semelhante aos métodos que utilizam inibidores de transcrição. Dois tipos de sistemas de indução são frequentemente utilizados: o promotor c-fos induzido pelo soro3 e o sistema induível Tet-Off4. Com o sistema c-fos, o uso de inibidores de transcrição que podem ser tóxicos para a célula não é necessário. No entanto, este método requer a sincronização do ciclo celular, o que impede a avaliação da estabilidade real de uma transcrição durante a interfase5. Em contraste, o sistema Tet-Off permite a forte expressão do gene de interesse (GOI) o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este sistema requer a presença de dois elementos que devem ser cotransfecdos na célula para serem funcionais. O primeiro plasmídeo (pTet-Off) expressa a proteína regulatória tTA-Adv, um fator híbrido de transcrição sintética composto pelo repressor procariótico TetR (de Escherichia coli) fundido a três domínios de transativação de transcrição da proteína viral HSV VP16. O GOI é clonado no plasmídeo pTRE-Tight o controle de um promotor sintético (PTight),compreendendo a seqüência mínima do promotor citomegalovírus (CMV) fundido a sete repetições da seqüência do operador tetO. A transcrição do gene a jusante de PTight depende da interação de TetR com tetO. Na presença de tetraciclina ou sua derivada, doxiciclina, o repressor TetR perde sua afinidade com o operador de tetO, levando a uma cessação da transcrição4. As características do sistema Tet-Off tornam-no um modelo ideal para o estudo da expressão específica do mRNA em células eucarióticas, evitando potenciais efeitos pleiotrópicos que são secundários à ausência de seqüências regulatórias procadroticas em células eucarióticas6. Normalmente, linhas de células Tet-Off duplamente estáveis (HEK 293, HeLa e PC12) são usadas com este sistema para integrar cópias do regulador e plasmídeos de resposta para acesso conveniente à expressão genética controlável7,8,9.
Vários modelos de células epiteliais aláslaras na cultura têm sido usados para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. Durante anos, os pesquisadores utilizaram extensivamente células primárias humanas ou roedores10,11, bem como linhas celulares imortalizadas, como células Humanas A549 ou RLE-6TN de rato12,13. Embora geralmente sejam menos proliferativas e mais difíceis de cultura e transfect, as células epiteliais aleláscas na cultura primária continuam sendo o padrão-ouro para o estudo da função e disfunção do epitélio alveolar em condições fisiológicas e patológicas. De fato, linhas celulares imortalizadas como as células A549 não exibem as características complexas e fenótipos das células primárias, enquanto as células epiteliais alveolares na cultura primária recapitulam as principais propriedades do epitélio alveolar, em particular a capacidade de formar uma barreira polarizada e apertada14,15. Infelizmente, essas células são muito resistentes às técnicas convencionais de transfecção, como aquelas que utilizam liposóis, tornando muito difícil o uso de um sistema induzido pelo promotor, como o Tet-Off.
A modulação pós-transcricional de mRNAs é um dos métodos mais eficazes para modular rapidamente a expressão genética de uma transcrição16. A região não traduzida do mRNA 3 'UTR' desempenha um papel importante nesse mecanismo. Foi demonstrado que, ao contrário do UTR de 5', há uma correlação exponencial entre o comprimento do UTR de 3' e as complexidades celular e morfológica de um organismo. Essa correlação sugere que o UTR de 3'', como as regiões de codificação mRNA, tem sido submetido à seleção natural para permitir uma modulação pós-transcricional cada vez mais complexa ao longo da evolução17. O UTR de 3' contém vários locais de ligação para proteínas e miRNAs que afetam a estabilidade e a tradução da transcrição.
No presente trabalho, desenvolvemos uma ferramenta para investigar o papel de domínios altamente conservados no UTR de 3' de um GOI para o controle da estabilidade da transcrição. Focamos no canal epitelial de sódio, subunidade alfa (αENaC), que desempenha um papel fundamental na fisiologia epitelial aveolar18. As células epiteliais alveolares na cultura primária foram transfecentes com sucesso com os dois componentes do sistema Tet-Off, o que permite o estudo do papel do UTR de 3' na estabilidade do mRNA com um sistema que afeta minimamente a fisiologia celular e o metabolismo em comparação com o uso de inibidores de transcrição com outros protocolos. Uma estratégia de clonagem foi desenvolvida para diferenciar a expressão do GoI da do gene endógeno utilizando um epítopo não totalmente expresso (V5). A resposta e os plasmídeos regulatórios foram então transferidos para células epiteliais aláscas usando uma técnica de eletroporação de pipeta. Posteriormente, a expressão da transcrição foi medida pela incubação das células com doxiciclina em diferentes intervalos de tempo. A meia-vida da transcrição foi avaliada por RT-qPCR com um método Cq modificado utilizando o produto transfeccionado tTA-Ad mRNA para normalização. Através do nosso protocolo, oferecemos uma maneira conveniente de estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em diferentes condições e definir o envolvimento das regiões não traduzidas com mais detalhes.

<table><tbody><tr><td>Actinomicina D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9415</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1593</td><td></td></tr><tr><td>Bright-LineHemacitômetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio - Grau de biologia molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>ClaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Microscópio invertido LED Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>DM IL com contraste de fase</td><td></td><td></td> Leica-DNase <td></td></tr><tr><td>I, grau de amplificação</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>hiclato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (D-PBS), sem cálcio e magnésio</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol - grau de biologia molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25 ConsoleIncubatorShaker</td><td>Eppendorf</td><td>1220G76</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HEPES pH 7.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026420</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Síntese de cDNA iScript</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol - Grau de biologia molecular</td><td>Caldo Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB com ágar (Lennox)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos dePseudomonas aeruginosa10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9143</td><td></td></tr><tr><td>MEM, pó</td><td>Gibco</td><td>61100103</td><td></td></tr><tr><td>Placa de reação óptica de 96 poços MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Filme adesivo óptico MicroAmp</td><td>Applied Biosystems</td><td>4360954</td><td></td></tr><tr><td>Armários de Segurança Biológica Classe II MSC-Advantage</td><td>Sistema</td><td>de</td> eletroforese Mupid-exU da 51025413 <td></td>Scientific,</tr><tr><td></td><td>Takara Bio</td><td>AD140</td><td></td></tr>, <tr><td>NanoDrop 2000c</td>, Sistema de Transfecção de Néon <td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr>, <tr><td>10 &micro; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System Starter Pack</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000S</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0131S</td><td></td></tr><tr><td>One Shot OmniMAX 2 T1RChemicamente CompetenteE. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C854003</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 vector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V790-20</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>PlatinumTaqDNA Polimerase Alta Fidelidade</td><td>Invitrogen</td><td>11304011</td><td></td></tr><tr><td>pTet-Off Vetor avançado</td><td>Takara Bio</td><td>631070</td><td></td></tr><tr><td>vetor pTRE-Tight</td><td>Takara Bio</td><td>631059</td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliais alveolares purificadas</td><td>n.a.n.a.QIAEX</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>II Kit de extração de gel</td><td>QIAGEN</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 e 7 Flex Real-Time PCR System Software</td><td>Applied Biosystems</td><td>n.a.QuantStudio</td><td></td></tr> <tr><td>6 Flex Real-Time PCR System, 96-well Fast</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Rata TNF-alfa Protein</td><td>R& AMP; D Systems</td><td>510-RT-010</td><td></td></tr><tr><td>Septra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2487</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase alcalina de camarão (rSAP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725270</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV Transcriptase reversa</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Tet System Aprovado FBS</td><td>Takara Bio</td><td>631367</td><td></td></tr><tr><td>Tobramicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr>Água <tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>, bioprodutos</td><td>809-115-EL</td><td></td> de <td>Wisent</td> da categoria da biologia molecular</tr></tbody></table>

sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mrna em células epiteliais alveolares primárias

Efficient Transcriptionally Controlled Plasmid Expression System for Investigation of the Stability of mRNA Transcripts in Primary Alveolar Epithelial Cells

Estudar a regulação pós-transcricional é fundamental para compreender a modulação de um determinado RNA mensageiro (mRNA) e seu impacto na homeostase celular e no metabolismo. De fato, flutuações na expressão da transcrição poderiam modificar a eficiência de tradução e, finalmente, a atividade celular de uma transcrição. Várias abordagens experimentais foram desenvolvidas para investigar a meia-vida do mRNA, embora alguns desses métodos tenham limitações que impedem o estudo adequado da modulação pós-transcricional. Um sistema de indução de promotores pode expressar um gene de interesse o controle de um promotor sintético regulado por tetraciclina. Este método permite a estimativa de meia-vida de um determinado mRNA qualquer condição experimental sem perturbar a homeostase celular. Uma grande desvantagem desse método é a necessidade de transfect as células, o que limita o uso dessa técnica em células primárias isoladas que são altamente resistentes às técnicas convencionais de transfecção. Células epiteliais alveolares na cultura primária têm sido usadas extensivamente para estudar a biologia celular e molecular do epitélio alveolar. As características únicas e o fenótipo das células alveolares primárias tornam essencial estudar as modulações pós-transcricionais de genes de interesse nessas células. Portanto, nosso objetivo era desenvolver uma nova ferramenta para investigar as modulações pós-transcricionais de mRNAs de interesse em células epiteliais aerarelaras na cultura primária. Projetamos um protocolo de transfecção transitória rápido e eficiente para inserir um sistema de expressão plasmídea controlada transcricionalmente em células epiteliais alveolarprimárias primárias. Essa estratégia de clonagem, utilizando um epítopo viral para marcar o construto, permite a fácil discriminação da expressão construtiva a partir da de mRNAs endógenas. Usando um método modificado de ciclo de quantificação ΔΔ (Cq), a expressão da transcrição pode então ser quantificada em diferentes intervalos de tempo para medir sua meia-vida. Nossos dados demonstram a eficiência dessa nova abordagem no estudo da regulação pós-transcricional em várias condições fisiopatológicas em células epiteliais alveolarprimárias primárias.

Este protocolo foi utilizado com sucesso para gerar um sistema de expressão plasmídea controlado transcriptalmente tet-Off para avaliar a importância de diferentes porções do ΑENaC 3' UTR na modulação da estabilidade da transcrição em células epiteliais alveolarprimárias primárias.
O primeiro passo na implementação desse sistema foi estabelecer uma técnica de transfecção rápida, fácil e eficiente para células epiteliais alelásar...

Aqui, apresentamos uma ferramenta que pode ser usada para estudar a modulação pós-transcricional de uma transcrição em células epiteliais alveolares primárias usando um sistema de expressão indutível acoplado a uma técnica de eletroporação de pipeta.

Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias

Studying posttranscriptional regulation is fundamental to understanding the modulation of a given messenger RNA (mRNA) and its impact on cell homeostasis ...

Assim, nosso modelo permite o estudo da modulação pós-transcricional de uma transcrição específica em células epiteliais alveolares na cultura primária e suas condições fisiológicas e fisioterícias. Assim, a transfecção transitória das células epiteliais alveolares primárias tem efeito mínimo sobre a fisiologia celular e metabolismos, o que representa uma clara vantagem sobre protocolos clássicos usando inibidores de transcrição. Para a geração de uma resposta plasmid expressando um gene de interesse, a sequência do gene e os múltiplos locais de clonagem do vetor indutível devem ser analisados para identificar as sequências de reconhecimento nos múltiplos locais de clonagem que não estão presentes internamente no gene.Usando técnicas de polimerase taq de alta fidelidade e técnicas de PCR de sobreposição padrão, flanqueie o gene de interesse com dois sites de reconhecimento de enzimas de restrição selecionadas usando primers de designer. Uma sequência na codificação do epítope V5 a montante do gene de interesse deve ser incluída para distinguir a expressão do gene transfectado da expressão endógena. Mutantes podem ser gerados por exclusão sequencial para estudar os efeitos de diferentes três regiões não traduzidas na estabilidade do mRNA do gene usando primers reversos codificando um local de poliadenilação que gradualmente exclui as três extremidades principais da região não traduzida.Em última análise, a inserção do gene de interesse pode ser confirmada pela análise de restrição. A orientação genética e a ausência de mutações potencialmente introduzidas durante o RTR podem ser confirmadas por sequenciamento. Para a transfecção do pulmão primário do pulmão de rato tipo duas células epiteliais alveolares, semeou as células em uma única vez 10 para a sexta células por centímetro quadrado em placas de Petri de 100 milímetros na presença de meio essencial mínimo completo.Cultura por 24 horas a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono com umidade. No dia seguinte, adicione 500 microliters de meio completo sem antibiótico a cada poço de uma nova placa de 12 poços e pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos. Durante esta incubação, adicione um micrograma do plasmídeo de resposta e um micrograma de vetor regulatório a um tubo de 1,5 mililitro por poço.Lave as células epiteliais alveolares com 10 mililitros por poço de 37 graus Celsius PBS sem cálcio ou magnésio e trate as células com cinco mililitros por poço de 37 graus Celsius 0,05% trypsin por dois a quatro minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células se separarem, neutralize a trippsina com 10 mililitros por poço de meio completo sem antibiótico e colete as células em um novo tubo de 50 mililitros. Lave o prato com quatro mililitros de meio fresco para coletar quaisquer células restantes e sedimentar as células por centrifugação.Resuspend a pelota em um mililitro de PBS para contar e centrifugar as células novamente. Resuspense a pelota a uma densidade de quatro vezes 10 a sete células por mililitro de tampão de resuspensão e adicione quatro vezes 10 às quintas células a cada tubo de plasmídeo e vetor com mistura suave. Coloque um tubo no dispositivo de eletroporação e encha o tubo com 3,5 mililitros de tampão eletrolítico.Deprimir completamente o pistão para inserir uma ponta de eletrodo banhado a ouro em uma pipeta e misturar suavemente o conteúdo do tubo. Aspire cuidadosamente as células com uma pipeta e insira a pipeta na estação de eletroporação até que um som de clique seja ouvido. Selecione o protocolo de eletroporação apropriado para células epiteliais alveolares e pressione Iniciar na tela sensível ao toque.Imediatamente após a transfecção, remova a pipeta e transfira as células para um poço da placa pré-aquecida de 12 poços. Quando todas as células tiverem sido eletroporadas e banhadas, coloque a placa na incubadora de cultura celular, substituindo o supernaente em cada poço por meio completo por antibióticos após dois dias. O sucesso da transfecção pode ser confirmado pela expressão de EGFP, como observado pela microscopia de fluorescência ou citometria de fluxo usando um vetor de controle.Para inibir a transcrição do gene de interesse, 72 horas após a transfecção substituem o supernatante por um mililitro por poço de meio completo suplementado com um micrograma por mililitro de adoxiciclina recém-preparada. Para avaliar a meia-vida mRNA do gene de interesse, devolva a placa à incubadora de cultura celular de 15 minutos a seis horas. Lavar um poço com um mililitro de PBS gelado antes de lise as células com 500 microliters de tampão de lise de um kit de extração de RNA fenol phenol disponível comercialmente e agitação suave em cada ponto de tempo experimental.Em seguida, isole o RNA de acordo com as instruções do kit e determine o rendimento e pureza do RNA por espectrofotometria em 230, 260 e 280 nanômetros. Para determinar a estabilidade do RNA isolado, primeiro trate um micrograma do RNA total de cada amostra com DNase livre de RNase para remover quaisquer traços de DNA plasmídeos. Use um kit de síntese cDNA comercialmente disponível com uma mistura de oligo dT e primers hexomer aleatórios para melhorar a eficiência de transcrição reversa para reverter transcrever o RNA total esgotado de DNA em cDNA de acordo com as instruções do fabricante.Adicione 180 microliters de água de grau de biologia molecular aos 20 microliters da mistura de reação para diluir a reação de CDNA a um nanograma de cinco nanogramas por concentração de microliter e diluir imediatamente a mistura de cDNA com água de grau de biologia molecular fresca para atingir um nanograma de 1,25 nanograma por concentração de microliter. Combine cinco microliters de mistura mestre de corante verde cibernético com 0,1 microlitr de água de grau de biologia molecular, 0,45 microliters de 7,5 micromolars para a frente, 0,45 microlitres de 7,5 micromolar reverso primer, e quatro microliters de 1,25 nanograma por microlitra de cDNA para obter um volume total de reação de 10 microliters. Coloque as amostras em um termociclador qPCR e amplify o gene de interesse da tag V5 e os amplificadores de avanço do transactivador de tetroclina utilizando as condições qPCR conforme indicado e gere uma curva de fusão de alta resolução para avaliar as temperaturas específicas de fusão dos amplicons desejados e garantir a ausência de picos de amplicon de ruído.Esta técnica de eletroporação pipeta facilita uma taxa de eficiência de transfecção de 25 a 30%, conforme observado pelas razões das células EGFP detectadas por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. O tratamento de células epiteliais alveolares com um micrograma por mililitro de doxiciclina não tem impacto significativo na expressão do endogênio alfa ENaC mRNA a qualquer momento durante o período de tratamento. Usando um sistema de expressão plasmídeo controlado transcricionalmente, como demonstrado, o sinal V5 alfa ENaC poderia ser normalizado de acordo com o sinal avançado do transactivador de tetraciclina para determinar a eficiência da transfecção usando o método de ciclo de quantificação delta duplo.A meia-vida do alfa ENaC mRNA é até sete vezes menor na presença da tetraciclina fora do sistema do que na presença de actinomicina D, confirmando que a actinomicina D leva a uma estabilização artefato alfa ENaC mRNA. Além disso, o tratamento alfa do fator ciclohexamida e necrose tumoral diminuiu significativamente a estabilidade da transcrição, enquanto lipopólises não. Mudanças significativas na modulação da estabilidade do ENaC alfa V5 podem ser induzidas dependendo das regiões excluídas e incluídas das três principais regiões não traduzidas.Além disso, a expressão sobre de proteínas específicas de ligação de RNA diminui a estabilidade de 5 alfa ENaC mRNA em comparação com a transfecção com um pcDNA vazio três plasmídeos. Esta ferramenta será útil para consultar novas percepções sobre a regulação pós-transcrição dos genes-chave envolvidos na função do epitélio alveolar e suas condições fisiológicas ou patológicas.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Cinética de RNA polimerase II transcricional são medidos em genes específicos em células vivas. mRNAs transcritos do gene de interesse são fluorescente etiquetado e usando a Recuperação de Fluorescência Após Fotodegradação (FRAP) o vivo na cinética de alongamento transcricional são obtidos.

Medição da Cinética de Transcrição mRNA em células Living Single

Este vídeo descreve o método de regulação da expressão gênica em células cultivadas por transfecção com um plasmídeo contendo um gene de interesse e um plasmídeo regulador. A expressão deste plasmídeo pode ser controlada pela tetraciclina ou seus análogos sintéticos, tornando este sistema um modelo útil para estudar a expressão gênica regulável.

Sistema Regulado Tet-Off Induzível: Um Método In Vitro para Modular a Expressão Gênica em Células Cultivadas Usando o Sistema Tetraciclina-Off

Os ratinhos transgénicos ou vectores virais têm sido utilizados para aumentar a expressão de proteína dentro do pulmão. No entanto, estas técnicas são demoradas e tecnicamente desafiante e têm efeitos fora do alvo, que pode confundir os resultados. O protocolo de transfecção de proteínas utiliza um reagente de transfecção à base de lipidos e uma microsprayer ultrafina para entregar uniformemente proteína activa a células do pulmão.

A transfecção de proteína de rato Lung

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

As células epiteliais brônquicas humanas primárias são difíceis de transduzir. Este protocolo descreve a produção de lentivírus e sua concentração, bem como as condições ideais de cultura necessárias para obter transduções altamente eficientes nessas células durante a diferenciação para um epitélio pseudoestratificado.

Optimal Lentivírus produção e cultura celular condições para sucesso pilhas transdução primária brônquicas humanas epiteliais

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Macrófagos, especialmente macrófagos primários, são um desafio para transfect como eles se especializam na detecção de moléculas de não-origem auto. Descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos.

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

Apresentamos aqui um método reprodutível, acessível e robusto para o isolamento e expansão de células epiteliais brônquicas primárias para biobanco de longo prazo e geração de células epiteliais diferenciadas por cultura na interface ar-líquido.

Isolando Células Epiteliais Brônquicas de Tecido Pulmonar Ressecado para Biobanco e Estabelecendo Culturas de Interface Ar-Líquido Bem Diferenciadas

Este protocolo apresenta um método baseado em citometria de fluxo para isolar células epiteliais alveolares tipo II (AECII) viáveis de pulmões neonatais, juvenis ou adultos de muros (infectados ou não infectados). Essa abordagem permite que estudos moleculares e/ou funcionais posteriores do AECII identifiquem seus papéis durante a inflamação e infecção pulmonar.

Isolamento de Células Epiteliais Alveolares Tipo II de Pulmões Neonatais, Juvenis e Adultos Múrios Adaptáveis a Ambientes Experimentais Infecciosos

Aprenda a estudar a modulação pós-transcricional de mRNA em células epiteliais alveolares primárias usando um sistema de expressão plasmídeo induzível com eletroporação por pipeta. Este método minimiza a disrupção da fisiologia celular.

Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias (Vídeo) | JoVE Journal

Sistema de expressão plasmídeamente controlado transcricionalmente para investigação da estabilidade das transcrições de mRNA em células epiteliais alveolares primárias

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