Name: Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a produzir partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto título usando glicoproteínas de envelope H5N1 e H7N9. Este método viabiliza estudos de infectividade viral em laboratório BSL-2.

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Este trabalho foi apoiado por subvenções do Plano Provincial de Medicina e Ciência e Tecnologia da Saúde de Zhejiang (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine and Health Science and Technology Plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Medical Science e Hangzhou Projeto chave de tecnologia (Grant Numbers, 2014Z11) e Hangzhou projeto municipal de aplicação autônoma de desenvolvimento social e pesquisa científica (Grant Numbers, 20191203B134).

1. Dia 1: Cultura celular e semeadura
<ol><li>Cultivar células embrionárias embrionárias humanas (HEK) 293T/17 em pratos de 60 mm com o meio essencial modificado (DMEM) de Dulbecco complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 100 U/mL penicilina-estreptomicina (DMEM Complete Medium, DCM) em uma incubadora de 37 °C, 5% de dióxido de carbono (CO2)até cerca de 80% de confluentes. NOTA: Hek 293T/17 células de passagem baixa são recomendadas.</li>
	<li>Lave cuidadosamente as células com 5 mL de sosteilo tampão de fosfato (PBS) 1x. NOTA: O manuseio manual das células HEK 293T/17 deve ser muito gentil, porque eles se separam facilmente.</li>
	<li>Remover PBS e dissociar as células com 1 mL de 0,25% trypsin-etileno diamina tetâtica solução (EDTA) solução. Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2 por não mais de 5 min até que as células sejam dissociadas.</li>
	<li>Desativar a trypsin adicionando 5 mL de DCM. Disperse as células em uma suspensão unicelular por pipetting cima e para baixo várias vezes.</li>
	<li>Transfira as suspensões celulares para um tubo de centrífuga pré-refrigerado de 15 mL. Colete as células por centrífuga a 250 x g por 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Decantar o máximo possível do supernatant. Resuspenda a pelota celular com 6 mL de dcm médio e contar as células. Diluir as células para 1 x 106 células/mL com dcm médio.</li>
	<li>Semeie as células em uma placa de 6 poços com 1 mL de suspensão celular por poço. Gentilmente pat a placa para distribuir uniformemente as células. Incubar a placa durante a noite (14-16 h) em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.</li>
</ol>2. Dia 2: Cotransfecção de quatro plasmídeos mediada por Lipofection
<ol><li>Verifique a morfologia celular e densidade um microscópio de luz invertida. Idealmente, as células devem ser aproximadamente 85% confluent na transfecção. Substitua o meio com 1 mL de dmem sem soro médio por poço, e depois coloque a placa de volta para a incubadora. NOTA: O manuseio manual das células HEK 293T/17 deve ser muito gentil, porque eles se separam facilmente.</li>
	<li>Para que cada poço de células cultivadas seja transinfectado, diluir 8 μL do reagente de transfecção a um volume de 150 μL com soro médio reduzido (tubo 1). Misture suavemente e incubar por 5 min à temperatura ambiente (RT, aproximadamente 20 °C). NOTA: Para cada amostra de transfecção, prepare dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, numerados 1 e 2.</li>
	<li>No tubo 2, diluir 2,5 μg de DNA plasmídeo em 150 μL de médio soro reduzido. NOTA: No tubo 2, diluir cada DNA plasmídeo, como mostrado na Tabela 1. Um plasmid codificando o vírus da estomatite vesicular (VSV) G glicoproteína (plasmídeo pLP-VSVG) foi usado como um controle positivo, porque VSV é capaz de infectar uma ampla gama de células. Partículas de controle negativo que não possuem glicoproteínas de envelope de gripe (Δenv pps) foram geradas usando plasmídeos pcDNA-Gag-Pol e pcDNA-GFP.</li>
	<li>Após uma incubação de 5 min, combine o DNA diluído com reagente de transfecção diluído. Misture suavemente e incubar por mais 15 min em RT.</li>
	<li>Adicione o complexo dna-lipídio ao poço correspondente contendo as células e o meio livre de soro. Misture suavemente balançando a placa para frente e para trás.</li>
	<li>Após a incubação de 4-6 h em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2, remover o meio e substituir por 2 mL de DMEM. Incubada por mais 36-48 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2. NOTA: Substitua o DMEM sem soro e sem anticorpos. Neste protocolo, dois HAs e dois NAs podem ser usados para gerar oito tipos de pps (mostrado na Tabela 1).</li>
</ol>3. Dia 3: Semeadura de células suscetíveis
<ol><li>Para o ensaio da infectividade, semente cada tipo de células suscetíveis em 1 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços. NOTA: Use dois tipos de célula-alvo para realizar o ensaio da infectividade neste artigo: uma linha de células humanas derivada de alveolar (células A549) e as células do Rim Canino Madin-Darby (MDCK). As células MDCK são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe e podem ser um bom controle. Este passo é flexível. Quaisquer outras linhas de células-alvo podem ser usadas de acordo com os requisitos de pesquisa.</li>
	<li>Incubar a placa durante a noite (14-16 h) em uma incubadora de 37 °C, 5% DE CO2.</li>
</ol>4. Dia 4: Pseudodigitado Coleção de Partículas Virais, Quantificação e Ensaio de Infectividade
<ol><li>Coleção de partículas virais pseudodigitadas<ol>
<li>Verifique a cor do meio. Idealmente, deve ser rosa claro ou ligeiramente laranja. Examine as células com um microscópio biológico fluorescente invertido 440-460 nm.</li>
		<li>Em 36-48 h pós-transfecção, colher os pps passando por um 0,45 μm policinadeno fluoreto (PVDF) filtro de membrana para eliminar detritos celulares.</li>
		<li>Divida os pps em alíquotas de pequeno volume.</li>
		<li>Armazenar os pps em -80 °C. NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. No entanto, isso não é incentivado, porque a infectividade dos pps vai diminuir drasticamente após o congelamento e descongelamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificação de partículas virais pseudodigitadas<ol>
<li>Transfira 20 μL de pps purificados para um tubo de microcentrífuga livre de 1,5 mL (RNase).</li>
		<li>Adicione 1 μL de 0,24 U/mL nuclease benzonase. Incubar a 37 °C para 1 h para eliminar qualquer contaminação por DNA e RNA. NOTA: O RNA alvo, citomegalovírus comumente downregulated (CMV)-GFP RNA, é embalado nos pps e pode evitar ser degradado por nuclease benzonase.</li>
		<li>Congele a amostra a -70 °C para inativar a nuclease benzonase.</li>
		<li>Adicione 2 μL de proteinase K. Incubate em 50 °C para 30 min para digerir as proteínas do envelope e liberar o RNA CMV-GFP. Inativar o proteinase K a 100 °C por 3 min.</li>
		<li>Quantificar os pps por transcrição reversa quantitativa em tempo real (qRT)-PCR com uma sonda universal um passo RT-qPCR Kit, usando a cartilha para a frente 5'-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTAA-3', a cartilha reversa 5'-GT GGCTCCTCATGAGTGAGGACTAC-3', e a sonda 5'-FAM-CCCCCAAATGAAGACCCCCGAG-TAM-3', em um termociclor PCR em tempo real. Normalize os pps para o número da cópia do RNA antes da infectividade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ensaio da infectividade<ol>
<li>Diluir cada tipo de pps em termos dos dados qRT-PCR para 4 x 105 cópias/mL (normalização pp).</li>
		<li>Adicione tosyl-fenilalanina clorometila-cetona (TPCK) trippsina a uma concentração final de 40 μg/mL em pps que abrigam H7N9 HA. Incubar a 37 °C para 1 h para formar suas subunidades funcionais HA1 e HA2. NOTA: Não há necessidade de tratar os pps que abrigam H5 com TPCK-trippsina, porque eles têm vários resíduos de arginina e lysina no local de clivagem HA1-HA2. Este local de clivagem multi-básico pode ser cloado por proteases celulares onipresentes.</li>
		<li>Misture pps normalizados com médio DMEM (livre de soro) em uma proporção de 1:1 (volume/volume).</li>
		<li>Traga a placa contendo células suscetíveis para o armário de biossegurança.</li>
		<li>Ascutu o supernatant e lave as pilhas uma vez com 0.1 mL de PBS prewarmed.</li>
		<li>Adicione 0,1 mL de mistura pps-DMEM a um poço. Triplica os testes de infectividade de cada tipo de pps para uma linha celular suscetível (visualizada na Figura 2).</li>
		<li>Incubar a placa de 96 poços para 4-6 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.</li>
		<li>Aspirar o supernatant e substituir por 0,1 mL de DCM.</li>
		<li>Incubar a placa de 96 poços para mais 24-36 h em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Dia 5 ou 6: Detecção de infectividade
<ol><li>Traga a placa de 96 poços para o armário de biossegurança.</li>
	<li>Ascutu o supernatant e lave as pilhas 1x com 0.2 mL de PBS prewarmed.</li>
	<li>Remover PBS e dissociar as células com 0,1 mL de 0,25% solução trypsin-EDTA.</li>
	<li>Coloque o prato em uma incubadora de 37 °C, 5% de CO2 por 3 min até que as células sejam dissociadas. NOTA: Evite incubar por mais de 5 min, porque isso levará à aglomeração celular.</li>
	<li>Desativar a trypsin adicionando 0.4 mL de DCM.</li>
	<li>Disperse as células em suspensão unicelular por tubulação para cima e para baixo várias vezes.</li>
	<li>Transfira as suspensões celulares para um tubo de microcentrífuga refrigerados de 1,5 mL.</li>
	<li>Determine as células positivas para repórter sgfp com triagem de células ativadas por fluorescência (FACS). NOTA: Para determinar a proporção de células-alvo positivas para repórters da GFP, defina portões de citometros de fluxo usando as amostras de controle (células A549 não tratadas ou células MDCK não tratadas) e, em seguida, conte as células positivas do repórter gfp de 10.000 células por amostra.</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+%286th%29%22">Fields Virology (6th)</a>. , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).</li>
<li>White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+mechanisms+of+viral+membrane+fusion+proteins%3A+multiple+variations+on+a+common+theme%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).</li>
<li>Bright, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-clade+protective+immune+responses+to+influenza+viruses+with+H5N1+HA+and+NA+elicited+by+an+influenza+virus-like+particle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle.</a> PLoS One. 3 (1), 1501(2008).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+pseudotyped+influenza+viral+particles+in+neutralizing+antibody+detection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection.</a> PLoS One. 9 (12), 113629(2014).</li>
<li>Wyatt, R., Sodroski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+envelope+glycoproteins%3A+fusogens%2C+antigens%2C+and+immunogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens.</a> Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).</li>
<li>Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transmembrane+domains+of+Sindbis+virus+envelope+glycoproteins+induce+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death.</a> Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).</li>
<li>Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+Glycoproteins+Are+Delivered+to+Virus+Assembly+Sites+Through+Dynamin-Dependent+Endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis.</a> Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).</li>
<li>Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotype+formation+between+enveloped+RNA+and+DNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses.</a> Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).</li>
<li>Rubin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Control+of+Cellular+Susceptibility+to+Pseudotypes+of+Rous+Sarcoma+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus.</a> Virology. 26, 270-276 (1965).</li>
<li>Steffen, I., Simmons, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudotyping+Viral+Vectors+With+Emerging+Virus+Envelope+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins.</a> Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).</li>
<li>Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+hepatitis+C+virus+pseudo-particles+containing+functional+E1-E2+envelope+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes.</a> Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).</li>
<li>Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCV+envelope+protein+function+is+dependent+on+the+peptides+preceding+the+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).</li>
<li>Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+potentially+important+elements+of+the+hepatitis+B+virus+large+envelope+protein+are+dispensable+for+the+infectivity+of+hepatitis+delta+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus.</a> Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).</li>
<li>Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-pseudotyped+retroviral+packaging+through+adenovirus-mediated+inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pseudoparticles+paired+with+hemagglutinin+and+neuraminidase+from+highly+pathogenic+H5N1+influenza+and+avian+influenza+A+%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses.</a> Virus Research. 253, 20-27 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+Pseudotyped+Particles+Pairing+Hemagglutinin+of+Highly+Pathogenic+Avian+Influenza+a+H5N1+Virus+with+Neuraminidases+of+The+2009+Pandemic+H1N1+and+a+Seasonal+H3N2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioterrorism+%26+Biodefense%22%5BJournal%5D)">Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2.</a> Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104(2011).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+neuraminidases+from+the+highly+pathogenic+avian+H5N1+and+2009+pandemic+H1N1+influenza+A+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses.</a> PLoS One. 5 (12), 15825(2010).</li>
<li>Nefkens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+pseudotyped+lentiviral+particles%3A+characterization+of+a+new+method+for+avian+H5N1+influenza+sero-diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis.</a> Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+and+neuraminidase+matching+patterns+of+two+influenza+A+virus+strains+related+to+the+1918+and+2009+global+pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oseltamivir+boosts+2009+H1N1+virus+infectivity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).</li>
<li>McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+M2+envelope+protein+augments+avian+influenza+hemagglutinin+pseudotyping+of+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors.</a> Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).</li>
<li>Pan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediates+avian+influenza+H5N1+pseudotyped+particle-induced+lung+inflammation+through+NF-kappaB+and+p38+MAPK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).</li>
<li>Szecsi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+neutralising+antibodies+by+virus-like+particles+harbouring+surface+proteins+from+highly+pathogenic+H5N1+and+H7N1+influenza+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses.</a> Virology Journal. 3, 70(2006).</li>
<li>Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+evaluation+of+an+influenza+A+%28H5%29+pseudotyped+lentiviral+particle-based+serological+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Virology%22%5BJournal%5D)">Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay.</a> Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).</li>
<li>Garcia, J. M., Lai, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+influenza+pseudotyped+lentiviral+particles+and+their+use+in+influenza+research+and+diagnosis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).</li>
<li>Haynes, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza-pseudotyped+Gag+virus-like+particle+vaccines+provide+broad+protection+against+highly+pathogenic+avian+influenza+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge.</a> Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).</li>
<li>Schmeisser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+mammalian+virus-like+particles+from+modified+vaccinia+virus+Ankara+vectors+expressing+influenza+H5N1+hemagglutinin+and+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase.</a> Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).</li>
<li>Liu, Y. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+severe+acute+respiratory+syndrome+coronavirus+%28SARS-CoV%29+S+glycoprotein+and+influenza+matrix+1+efficiently+form+virus-like+particles+%28VLPs%29+that+protect+mice+against+challenge+with+SARS-CoV%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV.</a> Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).</li>
<li>Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lyssavirus-Neutralizing+Antibodies+Using+Vesicular+Stomatitis+Virus+Pseudotype+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles.</a> Viruses. 8 (9), 254(2016).</li>
<li>Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SARS-CoV+Fusion+Peptide+Forms+an+Extended+Bipartite+Fusion+Platform+that+Perturbs+Membrane+Order+in+a+Calcium-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner.</a> Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle+East+respiratory+syndrome+coronavirus+infection+is+inhibited+by+griffithsin%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin.</a> Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).</li>
<li>Millet, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Pseudotyped+Particles+to+Study+Highly+Pathogenic+Coronaviruses+in+a+Biosafety+Level+2+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59010(2019).</li>
<li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+leukemia+virus+pseudotypes+of+La+Crosse+and+Hantaan+Bunyaviruses%3A+a+system+for+analysis+of+cell+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism.</a> Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).</li>
<li>Wool-Lewis, R. J., Bates, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebola+virus+entry+by+using+pseudotyped+viruses%3A+identification+of+receptor-deficient+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines.</a> Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).</li>
<li>Chen, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+design+of+more+effective+avian+replication-incompetent+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors.</a> Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).</li>
<li>Kaku, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+of+pseudotype-based+serum+neutralization+assay+for+Nipah+virus+antibodies%3A+sensitive+and+high-throughput+analysis+utilizing+secreted+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase.</a> Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).</li>
<li>Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+modeling+of+influenza+A+virus+replication+in+cell+cultures+predicts+infection+dynamics+for+highly+different+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions.</a> PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819(2019).</li>
<li>Petiot, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+viruses+production%3A+Evaluation+of+a+novel+avian+cell+line+DuckCelt%28R%29-T17%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17.</a> Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste protocolo, descrevemos um método para produzir partículas pseudodigitadas pelo vírus influenza (pp) em uma configuração BSL-2. O repórter plasmid pcDNA-GFP é incorporado aos pps e pode ser usado para quantificar pps pela FACS em um ensaio de infectividade. Escolhemos dois tipos de linhas celulares suscetíveis porque elas são amplamente utilizadas na pesquisa da gripe. As células MDCK forneceriam um bom controle para as células humanas imortalizadas variáveis usadas nesses estudos.
Este p...

A missão de uma partícula viral é transportar seu genoma de uma célula hospedeira infectada para uma célula hospedeira não infectada e entregá-la ao citoplasma ou ao núcleo em umaforma1 competente para replicação. Este processo é inicialmente desencadeado pela ligação aos receptores celulares hospedeiros, seguido pela fusão de virion e membranas celulares. Para vírus envolvidos, como os vírus da gripe, as glicoproteínas de pico são responsáveis pela ligação do receptor e fusão1,2. Glicoproteínas envelope viral (por exemplo, pirogênios, antígenos), estão envolvidos em muitas propriedades e eventos importantes, tais como iniciação do ciclo de vida do vírus (ligação e fusão), patogênese viral, imunogenicidade, apoptose celular hospedeira e tropismo celular, a via endocítica celular, bem como a transmissão e reassortmentinterespécies 1,3,4,5,6,7. Pesquisa sobre glicoproteínas envelope viral nos ajudará a entender muitos aspectos do processo de infecção viral. Partículas virais pseudodigitadas (pp), também denominadas pseudovirions ou pseudopartículas, podem ser geradas através de uma técnica de pseudotipagem8,9,10. Esta tecnologia tem sido utilizada para desenvolver partículas pseudodigitadas de muitos vírus, incluindo hepatite C11,12,hepatite B13,vírus da estomatite vesicular (VSV)14,15,e vírus da gripe16,17,18,19. Esta tecnologia é baseada na proteína Gag-Pol de lentivírus ou outros retrovírus.
Partículas virais pseudodigitadas podem ser obtidas usando um sistema de três plasmídeos cotransfecting um plasmid de expressão de glicoproteína envelope viral, uma embalagem retroviral plasmid faltando o gene env envelope, e um plasmid repórter separado em células produtores pp. O retrovírus é montado por sua proteína Gag, e buds de uma membrana celular infectada que expressa o vírus envelope proteína1. Portanto, é possível obter pps de gripe de alto titer usando a proteína gag retrovírus para produzir botões em uma membrana celular expressando influenza HA e NA. Em nossos estudos anteriores, has/nas em todas as combinações foram funcionais e capazes de executar suas funções correspondentes no ciclo de vida viral16,17,18,20,21. Estes pps são usados para investigar características biológicas da gripe, incluindo a hemaglutinação, a atividade da neuraminidase, o tropismo obrigatório do HA-receptor, e a infectividade. Como ha e NA são proteínas funcionais de superfície importantes no ciclo de vida viral, HAs e NAs incompatíveis derivados de diferentes cepas de gripe podem demonstrar parcialmente a ressortição entre eles. Aqui, geramos oito tipos de influenza pps, combinando dois HAs e dois NAs (derivados da cepa HPAI H5N1 e da mancha H7N9), usando um sistema de pseudotipagem de três plasmídeos. Estes oito tipos de pps incluem dois pps nativos, H5N1pp, H7N9pp; dois pps incompatíveis, (H5+N9)pp, (H7+N1)pp; e quatro pps que abrigam apenas uma única glicoproteína (HA ou NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. Estudos sobre o vírus influenza, como H5N1 e H7N9, são limitados por requisitos de biossegurança. Todos os estudos das cepas do vírus da gripe selvagem devem ser realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança (BSL-3). A tecnologia de partículas virais pseudodigitadas pode ser usada para empacotar um virion artificial em um ambiente de nível 2 de biossegurança (BSL-2). Portanto, pps representam uma ferramenta mais segura e útil para estudar os processos do vírus da gripe, dependendo de suas duas principais glicoproteínas: hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA).
Este protocolo descreve a geração desses pps com uma estratégia de cotransfecção de três plasmid (vista geral na Figura 1),como quantificar pps e detecção de infectividade. A produção pp envolve três tipos de plasmídeos (Figura 1). O gene gag-pol, que codifica a proteína Gag-Pol retrovírus, foi clonado de um kit de embalagem retrovírus e inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-Gag-Pol. O gene de proteína fluorescente verde melhorada (eGFP), que codifica a Proteína Fluorescente Verde, foi clonado do vetor pTRE-EGFP, inserido no plasmídeo pcDNA 3.1 e chamado pcDNA-GFP. Durante a clonagem, uma seqüência de sinal de embalagem () foi adicionada através de uma cartilha. Os genes HA e NA foram clonados em um plasmid pVRC, chamado pVRC-HA e pVRC-NA, respectivamente. O último plasmídeo codifica a proteína de fusão e pode ser substituído por qualquer outra proteína de fusão de interesse. Nossa plataforma de pseudotipagem inclui dois plasmídeos de expressão glicoproteína: pVRC-HA e pVRC-NA. Isso pode simplificar a pesquisa sobre a revariedadeção entre diferentes cepas de vírus em uma configuração BSL-2.

<table><tbody><tr><td>Benzonase Nuclease</td><td>Millipore</td><td>70664</td><td>Redução eficaz da viscosidade e remoção de ácidos nucleicos de soluções proteicas</td></tr><tr><td>Microplacas tratadas com TC de poliestireno de fundo plano transparente (96 poços)</td> <td>Corning</td><td>3599</td><td>Tratadas para fixação celular ideal Esterilizadas por radiação gama e certificadas não pirogênicas Códigos alfanuméricos individuais para identificação</td></tr> <tr><td>de poçosPlacas de Poços Múltiplos Tratadas com TC Transparente (6 poços)</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>Códigos alfanuméricos individuais para identificação de poços Tratado para fixação celular ótima Esterilizado por irradiação gama</td></tr><tr><td>Meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>Um meio basal amplamente utilizado para apoiar o crescimento de muitas células de mamíferos diferentes</td></tr><tr><td>Soro fetal</td><td>bovino Excell</td><td>FND500</td><td>soros bovinos fetais que podem oferecer excelente valor para cultura de células básicas, pesquisa especializada e ensaios específicos</td></tr><tr><td>Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS)</td><td>Beckman coulter</td><td>cytoflex</td><td></td></tr><tr><td>Células A549 de adenocarcinoma alveolar humano</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Rim embrionário humano (HEK) Células HEK-293T/17 ATCC</td><td></td><td>CRL-11268</td><td>Um reagente de transfecção versátil que demonstrou transfectar eficazmente a mais ampla variedade de linhas celulares aderentes e em suspensão</td></tr><tr><td>Microscópio biológico fluorescente invertido</td><td>Olympus</td><td>BX51-32P01-FLB3</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de luz invertida</td><td>Olympus</td><td>CKX31-12PHP</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reagente de transfecção</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>Detecção e quantificação rápidas, sensíveis e precisas de qPCR baseadas em sonda de alvos de RNA alvo.</td></tr><tr><td>Sonda Universal Luna Kit RT-qPCR de Um Passo</td><td>NEB</td><td>E3006L</td><td>Suportará até 14.000 RCF Células de</td></tr><tr><td>Rim Canino Madin-Darby</td> Não Pirogênicas Não Pirogênicas (MDCK) <td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Microcentrífuga MaxyClear Snaplock (1.5 mL)</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>33 mm,</td></tr><tr><td>Unidade de Filtro de Seringa Millex-HV esterilizada por gama, 0.45 &micro; m, PVDF</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td>um meio essencial mínimo (MEM) aprimorado que permite uma redução da suplementação de soro fetal bovino em pelo menos 50% sem alteração na taxa de crescimento celular ou morfologia. O meio Opti-MEM I também é recomendado para uso com reagentes de transfecção lipídica catiônica, como o reagente de lipofectamina.</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Meio Sérico Reduzido</td><td>Gibco</td><td>11058021</td><td>Os antibióticos penicilina e estreptomicina são usados para prevenir a contaminação bacteriana de culturas de células devido à sua ação combinada eficaz contra bactérias gram-positivas e gram-negativas.</td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>RCF máximo é de 12.500 xg Faixa de temperatura de -80 & C a 120 & C Tubos de centrífuga PP estéreis sem RNase-/DNase </td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>uma serina protease estável e altamente reativa</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Beyotime</td><td>ST532</td><td>Tratada para fixação celular ideal Esterilizada por radiação gama e certificada não pirogênica</td></tr><tr><td>Placa de cultura tratada com TC (60mm)</td><td>Corning</td><td>430166</td><td>Tripsina do pâncreas bovino TPCK Cuidado, essencialmente sem sal, pó liofilizado, &ge; 10.000 unidades BAEE/mg de proteína</td></tr><tr><td>TPCK-tripsina</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td>Esta formulação líquida de tripsina contém EDTA e vermelho de fenol. Gibco Tripsina-EDTA é feito de tripsina em pó, uma mistura irradiada de proteases derivadas do pâncreas suíno. Devido à sua força digestiva, a tripsina é amplamente utilizada para dissociação celular, passagem de cultura celular de rotina e dissociação de tecido primário. A concentração de tripsina necessária para a dissociação varia de acordo com o tipo de célula e os requisitos experimentais.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus h5n1 e h7n9 altamente patogênicos

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

A transmissão direta ocasional do vírus altamente patogênico da gripe aviária A H5N1 (HPAI H5N1) e H7N9 aos seres humanos e sua letalidade são graves problemas de saúde pública e sugerem a possibilidade de uma epidemia. No entanto, nossa compreensão molecular do vírus é rudimentar, e é necessário estudar as propriedades biológicas de suas proteínas envelope como alvos terapêuticos e desenvolver estratégias para controlar a infecção. Desenvolvemos uma plataforma de partículas pseudodigitadas virais sólidas (pp) para estudar o vírus da gripe aviária, incluindo a análise funcional de sua hemaglutinina (HA) e glicoproteínas envelope de neuraminidase (NA), as características de ressortamento dos HAs e NAs, receptores, troposmas, anticorpos neutralizantes, diagnóstico, infectividade, para fins de desenvolvimento de medicamentos e projeto de vacinas. Aqui, descrevemos um procedimento experimental para estabelecer pps com o envelope glicoproteínas (HA, NA) a partir de duas cepas de gripe A (HAPI H5N1 e 2013 aviário H7N9). Sua geração é baseada na capacidade de alguns vírus, como o vírus da leucemia murina (MLV), para incorporar glicoproteínas envelope em um pp. Além disso, também detalhamos como esses pps são quantificados com RT-qPCR, e a detecção de infectividade de pps vírus nativos e incompatíveis, dependendo da origem dos HAs e NAs. Este sistema é altamente flexível e adaptável e pode ser usado para estabelecer pps virais com glicoproteínas envelope que podem ser incorporados em qualquer outro tipo de vírus envolto. Assim, esta plataforma de partículas virais pode ser usada para estudar vírus selvagens em muitas investigações de pesquisa.

Dependendo do procedimento geral descrito acima, geramos 10 tipos de pps combinando dois has/nas de grupo ou glicoproteína VSV-G ou glicoproteínas sem envelope (mostrados na Tabela 1). Sete deles são infecciosos. Os pps que abrigam glicoproteína sem envelope ou apenas porto NA não mostrou qualquer infectividade aqui. O procedimento de produção de influenza pp é visto de forma geral na Figura 1. Micrografias eletrônicas de transmissão de pps (por exemplo, H5N1pp) são mostrada...

Este protocolo descreve um processo experimental para produzir partículas pseudodigitadas virais infecciosas de alto titer (pp) com glicoproteínas envelope de duas cepas de gripe A e como determinar sua infectividade. Este protocolo é altamente adaptável para desenvolver pps de qualquer outro tipo de vírus envolvidos com glicoproteínas envelope diferentes.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Essa técnica de produção de influenza viral PP e determinação de sua infectividade pode simplificar a pesquisa do vírus da gripe em uma cidade BSL-2. Normalizamos o PPS para as infecções com base em dados qRT-PCR do PPS. Duas expressãos de glicoproteína plasmídeos são codificados, o que pode simplificar a pesquisa sobre a reassortação do vírus.Um dia após a semeadura celular, verifique a morfologia celular e a densidade sob um microscópio de luz invertida. O ideal é que a célula seja aproximadamente 85% confluente na transfecção. Substitua o meio por um mililitro de DMEM sem soro por poço, e coloque a placa de volta na incubadora.Para cada poço de células a serem transfeccionadas, diluir oito microliters do reagente de transfecção a um volume de 150 microliters com meio soro reduzido. Misture a solução suavemente e deixe-a sentada à temperatura ambiente por cinco minutos. Enquanto isso, diluem 2,5 microgramas de DNA plasmídeo em 158 microliters de meio soro reduzido.Após a incubação de cinco minutos, combine o DNA diluído com reagente de transfecção diluído, misture suavemente a solução e deixe-a em temperatura ambiente por 15 minutos. Adicione o complexo lipídedo de DNA aos poços correspondentes com as células em meio livre de soro. Em seguida, misture a placa suavemente balançando para frente e para trás.Incubar a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por quatro a seis horas. Após a incubação, remova o meio e substitua-o por dois mililitros de DMEM por poço. Em seguida, incuba-lo por mais 36 a 48 horas.Semente cada tipo de célula suscetível a 10.000 células por poço e uma placa de 96 poços. Em seguida, deixe a placa durante a noite em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia após a transfecção, verifique a cor do meio que deve iluminar rosa ou ligeiramente laranja e examine as células com um microscópio biológico florescente invertido sob 440 a 460 nanômetros de comprimento de onda.Em 38 a 48 horas após a transfecção, colde as partículas de pseuotipadas ou PPS passando-as através de um filtro de membrana de fluoreto de polivinida de 0,45 micrômetro para eliminar detritos celulares, em seguida, divida-as em alíquotas de pequeno volume e armazene-as a menos 80 graus Celsius. Para quantificar o PPS, transfira 30 microlitadores das partículas virais purificadas para um tubo 1,5 microliter RNase sem dna e adicione um microliter de Benzonase Nuclease. Incubar o tubo a 37 graus Celsius por uma hora para eliminar qualquer contaminação de DNA e RNA.Após a incubação, congele a amostra a menos 70 graus Celsius para ativo a nuclease e adicione dois microliters de Proteinase K.Incubar a mistura por 30 minutos para digerir as proteínas do envelope e liberar o RNA CMV-GFP. Em seguida, inativo o Proteinase K a 100 graus Celsius por três minutos. Quantifique o PPS com transcrição reversa quantitativa RTPCR usando o Kit RT-qPCR Universal Probe One-Step nos primers e sondas especificados no manuscrito do texto.Normalize o PPS para quatro vezes 10 a quinto RNA cópias por mililitro. Em seguida, adicione tpck-trypsin a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro no PPS que abriga hemaglutina H7N9. Incubar o PPS a 37 graus Celsius durante uma hora para formar as subunidades funcionais HA1 e HA2.Misture o PPS normalizado com o meio DMEM em uma proporção de um para um, em seguida, leve a placa contendo células suscetíveis ao armário de biossegurança. Aspire o supernascer e lave as células uma vez com 100 microliters de PBS pré-aquecido. Adicione 100 microliters de mistura PPS-DMEM em cada poço, triplicando os testes de infectividade de cada tipo de PPS a uma linha celular suscetível.Incubar a placa por quatro a seis horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, aspire o supernascer e substitua-o por 100 microliters de DCM Incubar a placa por mais 24 a 36 horas antes da detecção de infectividade. Nossos resultados são pps são considerados agora infecciosos para as pessoas.Assim, os procedimentos necessários de guarda segura são recomendados para tomar, como usar uma máscara e realizar os ensaios de infectividade em um armário de biossegurança. Este protocolo foi gerado para gerar 10 tipos de partículas pseudotipadas ou PPS com duas hemaglutinina agrupadas e estomatite vesicular de neuraminidase vírus G glicoproteína ou sem glicoproteínas envelope. O PPS foi imageado com microscopia eletrônica de transmissão e sua infectividade foi avaliada em duas linhas celulares, A549 e MDCK.No grupo PPS que abriga h5, a infectividade de H5N1, H5 mais N9 e H5 foi de aproximadamente 90%18% e 10% para a linha celular A549 e 40%5% e 5% para MDCK, respectivamente. No grupo PPS que abriga h7, a infectividade de H7N9, H7 mais N1 e H7 foi de aproximadamente 10%7% e 1% para a linha celular A549 e 8%4% e 1% para MDCK, respectivamente. A infectividade do vírus da estomatite vesicular G glicoproteína PP foi de cerca de 21% para células A549 e 16% para MDCK.Enquanto o envelope delta glicoproteins PP não mostrou infectividade. É fundamental lembrar que as células HEK-293T/17 do produtor de PP constituem a base deste procedimento. Assim, o crescimento ideal nos ensina células HEK-293T/17 é o mais importante.Após este procedimento ou algum outro teste, como o recept L2, o ensaio delimitante pode ser realizado. Este ensaio pode quase livrar-se das peculiaridades biológicas da preferência do receptor e o padrão revelará o tropismo do PPS. Desde que tomaram as glicoproteínas do vírus da gripe são clonadas em duas mais máximas.As proteínas HA e NA podem ser estudadas separadamente, por isso nos reassortamos entre elas. Os mutantes e os efeitos maduros podem ser explorados.

production-high-titer-infectious-influenza-pseudotyped-particles-with

Research

JoVE Journal

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