Caracterizando Exon Pulando Eficiência em Amostras de Pacientes DMD em Ensaios Clínicos de Oligonucleotídeos Antisamescenos
7 de maio de 2020
Aqui, apresentamos a caracterização molecular da expressão distrofina 38 usando sequenciamento Sanger, RT-PCR e mancha ocidental no ensaio clínico.
Este protocolo fornece uma metodologia padronizada para o preparo e manuseio do tecido muscular em ambientes pré-clínicos e ensaios clínicos, o que é importante para obter resultados confiáveis no campo DMD. As técnicas são relevantes para testes de exon skipping para DMD. E a principal vantagem é que, eles são bem estabelecidos e reprodutíveis se realizados coletivamente.
Essas técnicas são focadas principalmente no exon skipping em DMD, mas com uma mudança de primers, as mesmas técnicas podem ser aplicadas a outras doenças tratadas com terapias de emenda. Esses métodos podem ser usados para alcançar a eficiência de exon skipping tanto quanto RNA e proteína. Para preparar uma amostra para análise, misture primeiro volumes iguais de goma e água até que a gengiva fique macia e pegajosa.
Coloque esta mistura em seringas de 25 mililitros e dispense 0,5 a um centímetro de goma em discos individuais de cortiça. Rotule os discos do lado oposto e coloque um recipiente de isopia em nitrogênio líquido até que parte do líquido congele. Coloque cada espécime na goma tragacanth nos discos com um eixo longitudinal de cada músculo perpendicular à rolha.
Coloque chiclete ao redor da parte inferior de cada músculo para ajudar a manter o músculo no lugar, e use pinças para congelar os espécimes na isopentane fria. Mova os espécimes continuamente por um minuto ou até que esteja completamente congelado antes de colocá-los temporariamente em gelo seco. Em seguida, coloque os espécimes em frascos de vidro para armazenamento de 80 graus Celsius.
Para seção do tecido muscular congelado para análise, defina um criostat para uma temperatura de trabalho de 25 graus Celsius, e para montar o bloco muscular no suporte. Corte o bloco de tecido até que as seções planas sejam alcançadas. Para análise de transcriptase reversa PCR e western blot, obtenha fatias de 10 micrômetros de espessura.
Para análise imunohistoquímica, obtenha fatias de seis a oito micrômetros de espessura, e para coloração de hematoxilina e eosina, obtenha fatias de 10 a 12 micrômetros de espessura. Após a aquisição, coloque as seções fatiadas em dois tubos mililitros. Armazene as amostras para PCR e manchas ocidentais a 80 graus Celsius.
Aqui, sistema de eletroforese de microchip, imagens em gel de reações de PCR de transcriptase reversa, e os resultados de sequenciamento da banda ignorada de dois pacientes antes e depois do tratamento com um oligonucleotídeo antissamparado em uma fase de escalonamento de dose fase um julgamento são mostrados. Ambos os pacientes abrigam exclusões. Como esperado, antes do tratamento, ambos os pacientes não mostraram falta e apenas uma banda não ignorada poderia ser visualizada.
Após 12 semanas de tratamento, uma faixa inferior clara foi visualizada para o segundo paciente, no entanto, ainda era difícil detectar qualquer produto ignorado para o primeiro paciente. Os resultados do sequenciamento mostraram uma concatenação dos exons 47 e 54 para o segundo paciente, e exons, 44 e 54 para o primeiro paciente. Para calcular a porcentagem ignorada, a concentração molar para a banda ignorada foi dividida pelas bandas puladas e não saltadas.
Como esperado, nenhuma banda de distrofina foi detectada pela mancha ocidental antes do tratamento. Após o tratamento, foi detectada uma faixa do segundo paciente com menor peso molecular em relação ao observado no controle saudável. O primeiro paciente, no entanto, não apresentou níveis detectáveis de distrofina após o tratamento.
É fundamental manusear o tecido muscular corretamente, e colocar cada espécime na gengiva tragacanth de forma consistente. As seções teciduais podem ser analisadas de várias maneiras diferentes, incluindo artificial para PCR, PCR digital, mancha ocidental, imunohistoquímica e com diferentes tipos de omics. Essas técnicas podem ser aceleradas, o desenvolvimento, exon adicional pulando drogas visando diferentes exons, e podem ser aplicadas ao desenvolvimento de baseados em virais e novamente na edição para DMD.
Visão Geral
Este estudo apresenta uma metodologia padronizada para o preparo e manipulação de tecido muscular em ensaios clínicos relacionados à Distrofia Muscular de Duchenne (DMD). O foco está nas técnicas de salto de éxon, que são cruciais para o desenvolvimento de terapias eficazes.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Ensaios Clínicos
Antecedentes
- A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença grave de desgaste muscular.
- A exclusão de éxons é uma abordagem terapêutica promissora para a DMD.
- O manuseio confiável de tecidos é essencial para resultados experimentais precisos.
- Métodos padronizados podem aumentar a reprodutibilidade na pesquisa.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um protocolo confiável para o preparo de tecido muscular.
- Facilitar ensaios de salto de éxons para a DMD.
- Fornecer uma estrutura aplicável a outras doenças tratadas com terapias de splicing.
Métodos Utilizados
- Preparação do tecido muscular utilizando goma-tragacanto e isopentano.
- Congelamento e corte de amostras musculares para análise.
- Transcriptase reversa PCR e Western blot para detecção da expressão de distrofina.
- Sequenciamento para analisar a eficiência da eliminação de éxons.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de bandas ausentes em pacientes tratados.
- Detecção de distrofina em um paciente após o tratamento.
- Variabilidade na resposta ao tratamento entre os pacientes.
- Ênfase na importância do manuseio consistente dos tecidos para resultados precisos.
Conclusões
- Métodos padronizados são essenciais para o avanço das terapias para a DMD.
- A exclusão de éxons mostra potencial, mas requer maior otimização.
- Estudos futuros podem se basear nesses métodos para aplicações mais amplas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo estabelece um fluxo de trabalho padronizado para avaliar a eficiência de pulo de éxon em amostras de pacientes com DMD, apoiando diretamente a validação de alvos no desenvolvimento de oligonucleotídeos antissenso. Ao permitir a medição quantitativa da restauração molecular, ele fornece uma desvinculação mecanicista para terapias de pulo do éxon 53, como o viltolarsen. A abordagem aumenta a confiança preditiva na tradução pré-clínica para clínica ao associar respostas bioquímicas ao mecanismo terapêutico.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar a hipótese terapêutica da exclusão de éxons mediada por oligonucleotídeos antissenso em amostras derivadas de pacientes.
- Valor Operacional: Fornece métodos reprodutíveis de sequenciamento Sanger, RT-PCR e Western blot para confirmar a atividade molecular no alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera razões quantitativas entre bandas saltadas e bandas totais para avaliação de resposta à dose na eficiência de salto de éxon.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de preparação e seccionamento de tecidos para garantir a reprodutibilidade do ensaio em conjuntos de amostras pré-clínicas e clínicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a análise de sistemas relevantes para doenças ao caracterizar a restauração da distrofina em biópsias musculares reais de pacientes.
- Valor Operacional: Permite a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, utilizando leituras moleculares consistentes em diferentes sistemas modelo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos líderes, fornecendo confirmação molecular do mecanismo antes dos testes de eficácia funcional.
- Biologia da Descoberta: Confirma a correção do splicing de éxon no alvo em amostras de pacientes, apoiando a validação da hipótese para oligonucleotídeos antissenso.
- Triagem: Fornece percentuais quantitativos de salto de éxon por meio de imagem eletroforética e sequenciamento, permitindo a comparação de compostos.
- Análises: Oferece quantificação de bandas saltadas com base em concentração molar para análise comparativa entre doses e pacientes.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o salto molecular de éxon com a detecção da proteína distrofina, conectando o mecanismo no nível de RNA ao resultado no nível proteico.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma estrutura reutilizável de manipulação e análise de tecidos aplicável a múltiplos alvos de éxons e terapias de splicing.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicistas por meio da visualização direta da eliminação de éxons e restauração da distrofina em tecido humano.
- Valor Operacional: O encapsulamento padronizado com goma-tragacanto e a criosseção garantem a consistência das amostras e reduzem a variabilidade.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção do desenvolvimento ao fornecer evidências moleculares do engajamento do alvo antes dos desfechos funcionais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de oligonucleotídeos antissenso com base na eficiência da eliminação de éxons em genótipos de pacientes relevantes.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em técnicas de biologia molecular, incluindo RT-PCR, Western blotting e sequenciamento de Sanger.
- Depende de equipamento de criostato para corte de tecidos e de nitrogênio líquido/isopentano para congelamento rápido.
- Necessita de protocolos padronizados de manipulação de tecidos para manter a integridade das amostras entre diferentes locais ou pontos temporais.
- Deve levar em conta a variabilidade de mutações específicas do paciente ao projetar primers para detecção de salto de éxon.
- Limitado pela natureza semi-quantitativa de métodos baseados em gel, na ausência de validação por PCR digital ou eletroforese capilar.
