Detecção de Espécies totais de oxigênio reativo em células aderentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining
23 de junho de 2020
Aqui, apresentamos um protocolo para detectar espécies totais de oxigênio reativa celular (ROS) usando diacetato de 2',7'-diclorodihifluoresceína (DCFH-DA). Este método pode visualizar a localização ros celular em células aderentes com um microscópio de fluorescência e quantificar a intensidade ros com um leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico.
Este método pode ser usado para analisar espécies de oxigênio reativa celular em células aderentes com apenas um microscópio de fluorescência, e quantificar a intensidade das espécies de oxigênio reativa com leitor de placas de fluorescência. Este protocolo é simples, eficiente e econômico. Comece semeando duas vezes 10 para o quinto HCT116 células cancerígenas colorretais em DMEM em cada poço de uma placa de 24 poços.
Incubar as células durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua o meio de cultura por 100 sulfato ferroso micromolar, ou 10 micromolars contendo doxorubicina, e incubar a placa por mais 24 horas. Prepare a solução DCFH-DA dissolvendo 4,85 miligramas de DCFH-DA em um mililitro de DMSO para fazer uma solução de estoque de 10 mililitros.
Logo antes de adicioná-lo aos poços, diluir o estoque com DMEM pré-aquecido para fazer uma solução de trabalho de 10 micromolar, e vórtice por 10 segundos. Para colorir as células, remova o meio contendo drogas e lave-as uma vez com DMEM. Adicione 500 microliters de solução de trabalho DCFH-DA em cada poço, e incubar a placa a 37 graus Celsius por 30 minutos.
Após a incubação, remova o DCFH-DA dos poços e lave-os duas vezes com DMEM e uma vez com PBS. Em seguida, adicione 500 microliters de PBS a cada poço. Use o canal de proteína fluorescente verde no microscópio de fluorescência para tirar imagens representativas das células.
Em seguida, remova o PBS e adicione 200 microliters de tampão de ensaio radioimune a cada poço. Incubar a placa no gelo por cinco minutos, e coletar os lises celulares em tubos de 1,5 mililitro. Centrifugar os tubos a 21, 130 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius.
Em seguida, transfira 100 microliters do supernante para uma placa preta de 96 poços. Use um leitor de microplaca em um comprimento de onda de excitação de 485 nanômetros, e um comprimento de onda de emissão de 530 nanômetros, para medir a fluorescência em cada poço. Em seguida, meça a concentração de proteína com o ensaio de Bradford transferindo um microliter do supernante para uma placa clara de 96 poços com 100 microliters de solução de ensaio proteico.
Use as concentrações proteicas para normalizar as intensidades de fluorescência. As células cancerígenas colorretais HCT116 foram tratadas com 100 sulfato ferroso micromolar, ou 10 doxorubicina micromolar, para induzir o estresse oxidativo. Como esperado, a fluorescência verde foi dramaticamente aumentada por ambos os tratamentos.
Para quantificar as alterações relativas de intensidade, as células foram lístidas e normalizadas com concentrações proteicas. A intensidade relativa da fluorescência foi significativamente aumentada por sulfato ferroso ou doxorubicina. Ao realizar este procedimento, é importante tornar a solução DCFH-DA fresca e evitar a exposição à luz, bem como minimizar a perturbação do estado celular e realizar uma extensa lavagem de PBS logo antes de tirar a imagem.
Além da detecção do ROS total por este protocolo, especificamente ros como peróxido pode ser realizado.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) totais em células, utilizando DCFH-DA. O método permite a visualização da localização de ROS em células aderentes e a quantificação da intensidade de ROS.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Análise de Espécies Reativas de Oxigênio
- Microscopia de Fluorescência
Antecedentes
- As espécies reativas de oxigênio desempenham um papel fundamental na sinalização celular.
- Compreender a localização das ERO pode fornecer informações sobre os processos celulares.
- Técnicas de fluorescência são comumente utilizadas para a detecção de ERO.
- Este protocolo foi desenvolvido para facilitar o uso e ser economicamente eficiente.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para detectar ESP em células aderentes.
- Permitir a visualização e quantificação de ESP utilizando microscopia de fluorescência.
- Simplificar o processo para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Plaquiação de células de câncer colorretal HCT116 em uma placa de 24 poços.
- Incubação das células com sulfato ferroso ou doxorrubicina.
- Preparação da solução de DCFH-DA para detecção de ERO.
- Uso de microscopia de fluorescência e leitor de placa para análise.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida da localização de ESP em células.
- A quantificação da intensidade de ESP demonstrou a eficácia do método.
- O protocolo mostrou-se simples e eficiente para pesquisadores.
- Abordagem economicamente viável para análise de ESP em estudos celulares.
Conclusões
- O protocolo fornece um método simples para a detecção de ESP.
- Ele pode ser aplicado a diversos tipos de células aderentes.
- Estudos futuros podem se basear neste método para obter insights mais profundos sobre mecanismos celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção quantitativa de espécies reativas de oxigênio (ROS) totais em células aderentes utilizando coloração com DCFH-DA fornece uma leitura padronizada do estresse oxidativo, um fator-chave em estudos de modelagem de doenças e resposta a fármacos. Este método permite uma avaliação robusta do estado redox celular após perturbações químicas ou genéticas, apoiando a desmistificação mecanicista e a validação de alvos no estágio inicial de descoberta. Sua eficiência de custo e escalabilidade tornam-no adequado para integração em triagens de alto rendimento e fluxos de trabalho translacionais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a análise quantitativa de vias de estresse oxidativo em modelos celulares relevantes para doenças.
- Apóia a validação funcional de alvos que modulam o equilíbrio redox celular.
- Facilita a desmistificação mecanicista ao associar intervenções com compostos ou alterações genéticas à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS).
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um ensaio reprodutível baseado em fluorescência para a quantificação de ESP em células aderentes.
- Permite a padronização e normalização do ensaio mediante medições de concentração proteica.
- Permite a avaliação confiável do estresse oxidativo induzido por compostos em campanhas de triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha leituras de estresse oxidativo com modelos de doenças para o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
- Apoia a continuidade da descoberta in vitro até a validação pré-clínica de agentes moduladores do estado redox.
- Oferece valor preditivo para a segurança e eficácia de compostos relacionados a mecanismos oxidativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de detecção de ERO baseado em DCFH-DA insere-se na transição entre a descoberta inicial e a identificação de compostos líderes, fornecendo uma leitura quantitativa da modulação do estresse oxidativo em sistemas celulares.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre alvos e vias relacionados ao estado redox.
- Triagem: Fornece medidas padronizadas e quantitativas de ERO para triagem de compostos.
- Análises: Integra a normalização da intensidade de fluorescência para comparação robusta de dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados de estresse oxidativo in vitro à validação em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um ensaio amplamente aplicável e economicamente eficiente para diversos tipos celulares e intervenções.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na biologia redox e na validação de alvos.
- Valor Operacional: Otimiza a quantificação de ERO com fluxos de trabalho escaláveis e reprodutíveis.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper ao associar intervenções aos resultados de estresse oxidativo.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de ativos que modulam o estado redox.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em microscopia de fluorescência e operação de leitor de placas.
- Necessita acesso à infraestrutura padrão de cultura celular e quantificação de proteínas.
- Exige manipulação cuidadosa do reagente DCFH-DA para evitar degradação induzida pela luz.
- A padronização das etapas de lavagem e normalização é essencial para a reprodutibilidade.
- O protocolo pode ser adaptado a diversas linhagens celulares aderentes, mas pode exigir otimização para modelos específicos.
