Protocolo de dosagem Stepwise para aumento do throughput em ensaios GPCR baseados em impedance sem rótulos

Este protocolo permite o registro de uma relação completa de resposta de concentração funcional do agonista GPCR de uma população celular e fornece caracterização agonista detalhada mesmo para números de amostras de células baixas. A principal vantagem da dosagem serial é o aumento da produtividade, uma vez que um único poço é suficiente para uma análise completa de resposta de concentração. Esta técnica é adequada para estudar transdução única em modelos biológicos raros e complexos, como formatos de órgãos em chip em recipientes microfluidos fechados.

O protocolo não é de difícil execução, desde que o equipamento adequado esteja disponível. Preparar as várias soluções de ligante GPCR na concentração certa é a chave para o sucesso. Michael Skiba, um estudante de pós-graduação, e Anne Mildner, uma estudante de graduação, do nosso laboratório demonstrarão o procedimento.

Para semeadura celular nas matrizes de eletrodos, adicione a concentração apropriada de células aos poços de cada matriz de eletrodos e permita que as células se acomodem homogêneamente nas partes inferiores do poço por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de pelo menos 36 horas em uma incubadora de cultura celular padrão a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, inspecione as camadas celulares por microscopia de contraste de fase para garantir uma cobertura completa de cada eletrodo com células. Em seguida, substitua o meio de cultura celular em cada poço pelo volume apropriado de meio pré-aquecido e sem soro.

Para iniciar uma gravação de impedância, coloque a matriz de eletrodo no suporte de matriz de conexão do analisador de impedância e confirme um contato adequado de baixa impedância entre os eletrodos e o analisador de impedância. Selecione o formato de eletrodo e/ou multi-bem na interface de usuário do software. Se os modos de aquisição de dados de frequência única e múltipla estiverem disponíveis e o número de poços a serem analisados for baixo ou a resolução de tempo não for crítico, selecione várias gravações de frequência.

Para garantir uma resolução de tempo máxima, selecione uma única frequência de monitoramento. Em seguida, inicie a aquisição dos dados do curso de tempo e selecione a pasta de dados para onde salvar os dados. As leituras de impedância serão registradas no número especificado de frequências para cada poço Para iniciar o protocolo de adição serial no modo agonista para uma matriz de oito poços, adicione 30 microliters da menor concentração do agonista de interesse para as células.

Em seguida, deixe as células responderem e equilibrarem-se durante o período de tempo predefinido antes de adicionar 30 microliters da próxima maior concentração até que cada diluição serial do agonista tenha sido adicionada. Para analisar os dados, subtrair a impedância do último ponto de dados antes da primeira adição da solução agonista, e definir o tempo de adição zero para normalizar os valores de impedância. Traçar o curso temporal de impedância normalizada e traçar os cursos de tempo individuais para identificar a máxima em impedância após cada etapa de adição.

Compor uma ficha técnica com esses valores e traçar os valores de máxima impedância em função da concentração agonista. Em seguida, use uma rotina de ajuste de dados para determinar as concentrações efetivas semi-máximas e a resposta máxima usando o modelo logístico de quatro parâmetros. Neste experimento representativo, 10 soluções com o aumento das concentrações de histamina foram adicionadas sequencialmente às células a cada 15 minutos, e a mudança de impedância foi medida em cada ponto de tempo.

As mudanças de impedância poderiam então ser traçadas em função da concentração de histamina e da função de transferência de um modelo logístico de quatro parâmetros instalado nos pontos de dados experimentais de sete poços. Para explicar a possível redução do receptor de histamina, dessensibilização celular ou superestimulação, o intervalo de dados para a análise pode ser reduzido, como mostrado para este único experimento de dosagem serial. A otimização de três parâmetros pode então ser aplicada aos dados, fornecendo uma concentração efetiva semi-máxima de 0,75 mais ou menos 0,12 micromolar para esta análise.

A adição do antagonista do receptor de histamina difenidramina 20 minutos antes da primeira histamina resulta em um aumento retardado de impedância dentro do esquema de dosagem serial, correspondendo à necessidade de um agonista mais alto para obter uma resposta celular. Na relação de resposta à dose, o efeito do antagonista é expresso como uma mudança para a direita das curvas, correspondendo a um aumento na concentração efetiva meia-máxima, desde que o antagonista seja um ligante competitivo em relação ao agonista. A aplicação bem-sucedida do esquema de dosagem serial é tecnicamente fácil, mas requer um planejamento atencioso, pois é desafiador executar todas as etapas com o tempo correto.

A dosagem serial abriu caminho para a realização de estudos de resposta à concentração com outros sistemas de leitura limitados em relação ao número de amostras monitoradas em paralelo. As vantagens particulares da dosagem serial permitem o estudo da transdução de sinal mediada por receptores com leituras completamente novas que são sensíveis a outras alterações fenotípicas, como a citomecânica. Por favor, use luvas e óculos ao preparar as soluções de estoque do agonista receptor, pois elas podem ser perigosas quando inaladas ou engolidas.