Name: Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprenda a estabelecer um modelo de camundongo NOG humanizado para pesquisa pré-clínica do HIV usando transplante de células-tronco e exposição intravaginal. Este protocolo permite avaliar cepas virais e intervenções terapêuticas.

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Os autores gostariam de agradecer à equipe do Biomedicine Animal Facility da Universidade de Aarhus, particularmente pela Sra. Jani Kær pelos esforços de manutenção da colônia e pelo rastreamento de pesos dos ratos. Os autores gostariam de agradecer ao professor Florian Klein pelo desenvolvimento do cART padrão de cuidado e pela orientação. O seguinte reagente foi obtido através do Nih AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: pRHPA.c/2635 (cat# 11744) do Dr. John Kappes e Dr. Christina Ochsenbauer.

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<li>Veselinovic, M., Charlins, P., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+HIV-1+Mucosal+Transmission+and+Prevention+in+Humanized+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling HIV-1 Mucosal Transmission and Prevention in Humanized Mice.</a> Methods Mol Biol. , 203-220 (2016).</li>
<li>Neff, C. P., Kurisu, T., Ndolo, T., Fox, K., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+topical+microbicide+gel+formulation+of+CCR5+antagonist+maraviroc+prevents+HIV-1+vaginal+transmission+in+humanized+RAG-hu+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A topical microbicide gel formulation of CCR5 antagonist maraviroc prevents HIV-1 vaginal transmission in humanized RAG-hu mice.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20209(2011).</li>
<li>Neff, P. C., Ndolo, T., Tandon, A., Habu, Y., Akkina, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+pre-exposure+prophylaxis+by+anti-retrovirals+raltegravir+and+maraviroc+protects+against+HIV-1+vaginal+transmission+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Oral pre-exposure prophylaxis by anti-retrovirals raltegravir and maraviroc protects against HIV-1 vaginal transmission in a humanized mouse model.</a> PLoS ONE. 5 (12), 15257(2010).</li>
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<li>Akkina, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Rag1-%2F-%CE%B3c-%2F-+mice+support+multilineage+hematopoiesis+and+are+susceptible+to+HIV-1+infection+via+systemic+and+vaginal+routes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Humanized Rag1-/-γc-/- mice support multilineage hematopoiesis and are susceptible to HIV-1 infection via systemic and vaginal routes.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20169(2011).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+combinatorial+dsiRNAs+via+nanoparticles+efficiently+suppresses+HIV-1+infection+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of combinatorial dsiRNAs via nanoparticles efficiently suppresses HIV-1 infection in humanized mice.</a> Molecular Therapy. 19 (12), 2228-2238 (2011).</li>
<li>Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+routines+cause+animal+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Contemporary+Topics+in+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Laboratory routines cause animal stress.</a> Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43 (6), 42-51 (2004).</li>
<li>Trecarichi, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+protective+effect+of+CCR5-Delta+32+heterozygosity+in+a+cohort+of+heterosexual+Italian+HIV-1+exposed+uninfected+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Partial protective effect of CCR5-Delta 32 heterozygosity in a cohort of heterosexual Italian HIV-1 exposed uninfected individuals.</a> AIDS Research and Therapy. 3 (1), (2006).</li>
<li>Novembre, J., Galvani, A. P., Slatkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geographic+spread+of+the+CCR5+%CE%9432+HIV-resistance+allele%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">The geographic spread of the CCR5 Δ32 HIV-resistance allele.</a> PLoS Biology. 3 (11), 1954-1962 (2005).</li>
<li>Solloch, U. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequencies+of+gene+variant+CCR5-%CE%9432+in+87+countries+based+on+next-generation+sequencing+of+1.3+million+individuals+sampled+from+3+national+DKMS+donor+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Frequencies of gene variant CCR5-Δ32 in 87 countries based on next-generation sequencing of 1.3 million individuals sampled from 3 national DKMS donor centers.</a> Human Immunology. 78 (11-12), 710-717 (2017).</li>
<li>Ochsenbauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transmitted%2FFounder+HIV-1+Infectious+Molecular+Clones+and+Characterization+of+Their+Replication+Capacity+in+CD4+T+Lymphocytes+and+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of Transmitted/Founder HIV-1 Infectious Molecular Clones and Characterization of Their Replication Capacity in CD4 T Lymphocytes and Monocyte-Derived Macrophages.</a> Journal of Virology. 86 (5), 2715-2728 (2012).</li>
<li>Andersen, A. H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Acting%2C+Potent+Delivery+of+Combination+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Macro+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-Acting, Potent Delivery of Combination Antiretroviral Therapy.</a> ACS Macro Letters. 7 (5), 587-591 (2018).</li>
<li>Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+thermoregulatory+devices+used+during+anesthesia+of+C57BL%2F6+mice+and+correlations+between+body+temperature+and+physiologic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 52 (5), 577-583 (2013).</li>
<li>Gatlin, J., Padgett, A., Melkus, M. W., Kelly, P. F., Garcia, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+nonobese+diabetic%2Fsevere+combined+immunodeficient+mice+with+human+CD34%2B+cells+transduced+by+a+self-inactivating+human+immunodeficiency+virus+type+1+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of nonobese diabetic/severe combined immunodeficient mice with human CD34+ cells transduced by a self-inactivating human immunodeficiency virus type 1 vector.</a> Human Gene Therapy. 12 (9), 1079-1089 (2001).</li>
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<li>Satheesan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Replication+and+Latency+in+a+Humanized+NSG+Mouse+Model+during+Suppressive+Oral+Combinational+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">HIV Replication and Latency in a Humanized NSG Mouse Model during Suppressive Oral Combinational Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Virology. 92 (7), 02118(2018).</li>
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<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+T-cell+subsets+with+HLA-restricted+immune+responses+in+HLA+class+I+expressing+NOD%2FSCID%2FIL2r+null+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human T-cell subsets with HLA-restricted immune responses in HLA class I expressing NOD/SCID/IL2r null humanized mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (29), 13022-13027 (2010).</li>
<li>Willinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+IL-3%2FGM-CSF+knock-in+mice+support+human+alveolar+macrophage+development+and+human+immune+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Human IL-3/GM-CSF knock-in mice support human alveolar macrophage development and human immune responses in the lung.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (6), 2390-2395 (2011).</li>
<li>Hanazawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+immunosuppressive+myeloid+cell+populations+in+human+interleukin-6+transgenic+NOG+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Generation of human immunosuppressive myeloid cell populations in human interleukin-6 transgenic NOG mice.</a> Frontiers in Immunology. 9, FEB (2018).</li>
<li>Huntington, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+trans-presentation+promotes+human+NK+cell+development+and+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-15 trans-presentation promotes human NK cell development and differentiation in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 206 (1), 25-34 (2009).</li>
<li>Rongvaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+human+innate+immune+cells+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).</li>
</ol>

Os autores não declaram conflitos de interesses.

A tensão severamente imunocomprometida do mouse NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) é extremamente adequado para transplante de células e tecidos humanos. Tanto as vias imunes inatas quanto adaptativas nesses camundongos estão comprometidas. Os ratos NOG e NSG abrigam uma mutaçãoprkdc scid que resulta na função de células T e B defeituosas. Além disso, esses camundongos não possuem um receptor funcional de entrelaçana-2 (cadeia gama comum, IL2rg) ...

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é uma infecção crônica com mais de 37 milhões de indivíduos infectados em todo o mundo1. A terapia antiviral combinada (cART) é uma terapia que salva vidas, mas uma cura ainda é justificada. Assim, há a necessidade de modelos animais que espelham o sistema imunológico humano e suas respostas para facilitar a continuação da pesquisa no HIV. Múltiplos tipos de camundongos humanizados que são capazes de suportar o enenxerto celular e tecidual foram desenvolvidos transplantando células humanas em camundongos severamente imunodeficientes2. Esses camundongos humanizados são suscetíveis à infecção pelo HIV e fornecem uma alternativa importante aos modelos de vírus da imunodeficiência símia de primatas não humanos, pois são mais baratos e simples de usar do que primatas não humanos. Camundongos humanizados têm facilitado a pesquisa em transmissão viral do HIV, patopatismo, prevenção e tratamento3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Apresentamos um sistema de modelohumanizado flexível para pesquisa sobre HIV desenvolvido por transplantar células-tronco humanas derivadas do sangue do cordão umbilical em camundongos do ACENO. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (NOG) de fundo. Além de ser de origem não fetal, a bioengenharia prática desses camundongos é menos exigente tecnicamente em comparação com os procedimentos microcirúrgicos envolvidos no transplante da construção hepática-timo hemobiana (TBL).
Mostramos como estabelecer a infecção pelo HIV através da transmissão intravaginal e como monitorar a carga viral plasmática com uma configuração digital de gota sensível (ddPCR). Posteriormente, descrevemos o estabelecimento do cART padrão dado como parte da dieta diária do camundongo. O objetivo desses métodos combinados é reduzir o estresse aos animais e facilitar experimentos em larga escala onde o tempo gasto manuseando cada animal é limitadoem 12.
Em humanos, um genótipo CCR5Δ32/wt ou CCR5Δ32/ Δ32 causa redução da suscetibilidade à infecção pelo HIV com vírus transmissor/fundador13, e algumas precauções devem ser tomadas quando a bioengenharia humanizou camundongos com células-tronco para fins de estudos de HIV. Isso é especialmente verdade em nossa região porque variantes de ocorrência natural no gene CCR5, particularmente as exclusões de Δ32, são mais prevalentes em populações nativas escandinavas e bálticas em comparação com o resto do mundo14,15. Assim, nosso protocolo inclui um ensaio fácil e de alto nível para triagem de células-tronco hematopoiéticas para variantes CCR5 antes do transplante.
Para a exposição intravaginal escolhemos o vírus transmissor/fundador R5 RHPA4259, isolado de uma mulher em um estágio inicial de infecção que foi infectada intravaginalmente16. Nós expôs os camundongos a uma dose viral que foi suficiente para produzir transmissão bem sucedida na maioria dos camundongos, mas abaixo de uma taxa de transmissão de 100%. A escolha dessa dose permite uma faixa dinâmica suficiente na taxa de transmissão, de forma que os efeitos antivirais de um candidato a medicamentos possam resultar em animais protegidos em experimentos de prevenção do HIV e diminuição da carga viral para estudos de tratamento.

<table><tbody><tr><td>Almofada azul</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Deve ser esterilizada antes de usar</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A8022</td><td></td></tr><tr><td>CD19 (clone sj25c1) PE-Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>557835</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clone OKT3) FITC</td><td>Biolegend</td><td>317306</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (clone SK7) BUV395</td><td>BD Bioscience</td><td>564001</td><td></td></tr><tr><td>CD34 (clone AC136) FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-113-740</td><td></td></tr><tr><td>CD4 (clone SK3) BUV 496</td><td>BD Bioscience</td><td>564652/51</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (clone 2D1) APC</td><td>Biolegend</td><td>368511/12</td><td></td></tr><tr><td>CD8 (clone RPA-T8) BV421</td><td>BD Bioscience</td><td>562428</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix para sondas (sem dUTP)</td><td>Bio-Rad</td><td>1863025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Merck</td><td>10,02,95,21,000</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D4263</td><td>Para tampão de suspensão</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Biowest</td><td>L0615-500</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Sangue do Cordão Humano CD34 Kit de Seleção Positiva II</td><td>Stemcell</td><td>17896</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lise FACS 10X</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Diluir 1:10 em dH20 imediatamente antes</td></tr><tr><td>do uso Tubos FACS (Falcon 5 mL round-botton)</td> Solução de bloqueio do receptor <td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Fc (Human Trustain FcX)</td> <td>Biolegend</td><td>422302</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sigma</td><td>F8192-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17144002</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v.10</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Mesoft</td><td>157300</td><td>Deve ser esterilizado antes do uso</td></tr><tr><td>Lâmpada</td><td></td><td></td> de aquecimento <td>Hemacitômetro feito sob medida</td></tr><tr><td>(B&uuml; rker-T&uuml; rk)</td><td>VWR</td><td>DOWC1597418</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano gás</td><td>Orion Pharma</td><td>9658</td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa X20 citómetro de fluxo</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, aprovado pela PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72692405</td><td></td></tr><tr><td>Mouse cART food</td><td>ssniff Spezialdi&auml; ten GmbH</td> Produto <td></td><td>feito sob medida</td></tr><tr><td>Limitador de</td><td></td> mouse <td>Produto</td><td></td>feito sob medida</tr><tr><td>Agulha, Microlance 3, 30G &frac12; "</td><td>BD</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>NOG camundongos NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac</td><td>Taconic</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>VWR produtos químicos</td><td>436912C</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 96 Kit de isolamento de DNA e RNA de vírus</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740691</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga aprovados por PCR</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.405</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina 100X</td><td>Biowest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II DNA polimerase</td><td>Life Technologies</td><td>F549S</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta, estéreis, barreira ART 20P</td><td>ThermoScientific</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>100005398</td><td></td></tr><tr><td>QuantaSoft Software</td><td>Bio-Rad</td> QX100 Gerador de gotículas Bio-Rad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1886-3008</td><td></td></tr><tr><td>QX100 Leitor de gotículas</td> Solução de lise de hemácias <td>Bio-Rad</td><td>186-3003</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>DNAse livre de RNase tamanho F + tampão de reação</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740963</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inibidor de ribonuclease recombinante</td><td>ThermoScientific</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Biowest</td><td>L0501-500</td><td>Dissolver em seringa H20</td></tr><tr><td>Softject 1 mL</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010-200V0</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transcriptase Reversa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker</td><td>VWR</td><td>89370-910</td><td></td></tr><tr><td>Trypane blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure 0.5 EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Virkon S (desinfetante de vírus)</td><td>Dupont</td><td>Nº 7511</td><td></td></tr></tbody></table>

camundongos nog humanizados para exposição intravaginal ao hiv e tratamento da infecção pelo hiv

Humanized NOG Mice for Intravaginal HIV Exposure and Treatment of HIV Infection

Camundongos humanizados fornecem uma plataforma sofisticada para estudar a virologia do vírus da imunodeficiência humana (HIV) e testar drogas antivirais. Este protocolo descreve o estabelecimento de um sistema imunológico humano em camundongos adultos NOG. Aqui, explicamos todos os passos práticos do isolamento das células CD34+ derivadas do sangue do cordão umbilical e seu subsequente transplante intravenoso para os camundongos, até a manipulação do modelo através da infecção pelo HIV, combinação de terapia antirretroviral ( cART), e amostragem de sangue. Aproximadamente 75.000 células hCD34+ são injetadas por via intravenosa nos camundongos e o nível de chimerismo humano, também conhecido como humanização, no sangue periférico é estimado longitudinalmente por meses por citometria de fluxo. Um total de 75.000 células hCD34+ produz células CD45+ humanas no sangue periférico. Os camundongos são suscetíveis à infecção intravaginal com HIV e o sangue podem ser amostrados uma vez por semana para análise, e duas vezes mensais por longos períodos. Este protocolo descreve um ensaio para quantificação da carga viral plasmática usando pcR digital droplet (ddPCR). Mostramos como os camundongos podem ser efetivamente tratados com um regime de cART padrão de cuidado na dieta. A entrega do cART na forma de chow de rato regular é um refinamento significativo do modelo experimental. Este modelo pode ser usado para análise pré-clínica de compostos sistêmicos e tópicos de profilaxia pré-exposição, bem como para testes de novos tratamentos e estratégias de cura do HIV.

A estratégia de gating para a análise da pureza das células-tronco é retratada na Figura 1. A Figura 1A-C mostra a população purificada do CD34+ e a Figura 1D-F do CD34- fluxo utilizado para ilustrar que a quantidade mínima da população cd34+ é perdida no processo de isolamento. A pureza das células-tronco CD34+ isoladas ficou entre 85%-95% com menos de 1% de contaminação por células T. <strong clas...

Desenvolvemos um protocolo para a geração e avaliação de um modelo de camundongo NOG infectado por vírus humanizado e humano com base no transplante de células-tronco, exposição intravaginal do vírus da imunodeficiência humana e RNA PCR digital de gota digital Quantificação.

Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV

Humanized mice provide a sophisticated platform to study human immunodeficiency virus (HIV) virology and to test antiviral drugs. This protocol describes ...

A criação desse modelo humanizado de camundongos pode auxiliar em estudos pré-clínicos de pesquisa sobre HIV. Por exemplo, tanto as cepas virais diferentes quanto novas intervenções de HIV podem ser avaliadas. Esses protocolos podem ser usados para avaliar o status da variante CCR5 do doador de células-tronco e para infectar eficientemente camundongos humanizados com HIV e quantificar cargas virais de plasma de camundongos.O protocolo de quantificação de RNA pode ser facilmente adaptado para quantificar qualquer sequência de RNA viral de escolha que seja detectável em amostras de plasma. Para triagem genética de amostras de sangue do cordão umbilical para as variantes CCR5 delta 32, incubar 1,25 microlitros de fluxo não pelleted com 11,25 microlitros de mistura PCR contendo 200 mistura dNTP micromolar, 0,01 unidade por microlitro de polimerase de DNA de alta fidelidade e primers dianteiros e reversos conforme detalhado na tabela. Ajuste o volume com água livre de nuclease para aproximadamente 12,5 microliters para cada reação pcr e amplie os fragmentos genômicos com o programa de ciclismo PCR, conforme indicado na tabela.No final da reação, separe os produtos PCR em um gel de 2% de agarose. Os produtos PCR dos alelos do tipo selvagem e dos alelos delta 32 produzem fragmentos pcr de 196 pares de base e 164 pares de base, respectivamente, tornando as bandas facilmente distinguíveis pela eletroforese de gel. Para exposição intravaginal ao HIV, coloque uma lâmpada de aquecimento focada no centro do espaço de trabalho onde o mouse estará localizado e coloque 20 pontas de pipeta microliter estéreis em uma pipeta apropriada no capô.Coloque um recipiente com desinfetante líquido no capô para inativação imediata de quaisquer materiais e líquidos que tenham estado em contato com o vírus. Coloque o mouse anestesiado sobre uma almofada azul estéril na posição supina sob a lâmpada com a cauda do mouse de frente para a parte de trás do capô e confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal no mouse. Segure o animal na base da cauda.Levantando suavemente o mouse pela base da cauda, apoie o animal em uma posição de cabeça para baixo ereto. Use uma ponta de tubo estéril para estimular a área genital com o acariciamento suave em direção ao ânus para induzir o esvaziamento do reto e aliviar a pressão sobre a vagina. Para expor a abertura vaginal, enrole cuidadosamente a cauda do rato através dos dedos, de tal forma que a vulva se abra naturalmente.Usando uma nova ponta de pipeta, coloque a ponta ao nível da abertura vaginal e libere atraumaticamente 20 microliters do vírus na vagina, permitindo que a gravidade puxe a suspensão viral para dentro da vagina. Quando todo o vírus for entregue, mantenha o rato nesta posição por cinco minutos para evitar o vazamento induzido pela gravidade do vírus. Em seguida, devolva cuidadosamente o mouse para sua gaiola doméstica na posição supina e monitore até a recuperação completa.Para isolar o RNA das amostras de plasma de camundongo descongelado, use um kit de isolamento de RNA do vírus de acordo com as instruções do fabricante. Adicione a amostra que se liga à coluna e adicione uma etapa de tratamento DNase na coluna para garantir a remoção de todo o DNA dentro da amostra de plasma. Em seguida, armazene as amostras de RNA a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora.Para sintetizar o CDNA, use transcriptase reversa de acordo com os protocolos padrão, incluindo 0,5 microliters de um inibidor de RNase dentro da reação cDNA para evitar a degradação do RNA, em seguida, realize a síntese de CDNA como detalhado na tabela e armazene as amostras de cDNA a 80 graus Celsius por pelo menos uma hora. Para preparar amostras para ddPCR, misture 11 microlitros da mistura de reação da sonda ddPCR contendo polimerase e dNTPs com 250 nanomolar de sonda de ligação de sulco menor e 900 nanomolar de cada um dos primers dianteiros e invertidos, conforme indicado na tabela. Adicione três microliters de cada amostra de cDNA e ajuste os volumes totais de PCR para 22 microliters com água sem nuclease.Use óleo de geração de gotículas para sondas em um gerador de gotículas de acordo com o protocolo do fabricante para emulsionar as misturas de PCR. Em seguida, execute o programa PCR conforme descrito na tabela. Para o tratamento cART após infecção confirmada pelo HIV, alimente os camundongos com pelotas preparadas por um fornecedor externo contendo um regime padrão de cART, conforme indicado na tabela.Use uma dieta cART de cor vermelha para diferenciá-la facilmente da comida comum do rato e use uma dieta de controle de chow sem cART em uma cor marrom padrão. Para o início do tratamento, coloque a dieta de chow contendo cART em gaiolas estéreis antes de transferir os ratos da gaiola antiga para a nova gaiola. Em seguida, monitore os pesos dos camundongos e verifique o consumo de chow contendo cART diariamente para garantir que os ratos estejam se ajustando à mudança.Aqui, é retratada a estratégia de gating de citometria de fluxo para análise da pureza das células-tronco, com a pureza das células-tronco positivas CD34 isoladas tipicamente variando entre 85 e 95% com uma contaminação celular inferior a 1%T. A análise do PCR demonstra o status da variante CCR5 das células-tronco do doador purificado, tornando facilmente identificáveis os doadores heterozigos delta 32 da CCR5 delta 32. A frequência do genótipo mutante em um grupo de 19 doadores foi de cerca de 15,8% de acordo com estudos epidemiológicos maiores de populações escandinavas.Três a cinco meses após a transferência adotiva de 7,5 vezes 10 para o 4º CD45 células positivas humanas em camundongos receptores, 20 a 50% dos glóbulos brancos recuperados de amostras de sangue periférico animal receptor são células positivas CD45 humanas e os camundongos terão desenvolvido células B e T humanas. 64% dos camundongos são infectados pelo HIV após a exposição vaginal, como demonstrado. Quatro semanas depois de mudar para uma dieta de 40 dias contendo cART padrão, as cargas virais em camundongos hiv positivos diminuem abaixo do limite de detecção.Após a cessação da dieta, o vírus se recupera, espelhando dados clínicos. É importante ressaltar que os ratos no cART toleram bem a mudança na dieta. É fundamental lembrar que esses animais são imunodeficientes e, portanto, vulneráveis ao meio ambiente.A adesão às técnicas assépticas aumentará o sucesso geral da saúde animal e do protocolo. Após o estabelecimento da coorte humanizada de camundongos para infecção pelo HIV, o protocolo pode ser adaptado para quantificação viral de RNA em tecidos ou para testar novas intervenções em diferentes cepas virais. A flexibilidade e a acessibilidade de camundongos humanizados para estudos de infecção pelo HIV permitiram progressos críticos na virologia do HIV, imunologia e pesquisa de tratamento.Antes de tentar protocolos envolvendo HIV infeccioso, certifique-se de obter aprovação das autoridades locais do ambiente de trabalho e aderir aos procedimentos aprovados de descontaminação.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um ensaio para avaliar a eficácia da terapia antirretroviral oral combinada (cART oral) em um modelo de camundongo humanizado infectado pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1). Uma combinação de medicamentos direcionados ao HIV-1, incluindo inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeos e inibidores de transferência de fita integrase, é administrada junto com um suplemento nutricional e antibióticos. Após o consumo dessa mistura pelos camundongos humanizados...

Terapia Antirretroviral Combinada Oral para Tratar a Infecção pelo HIV-1 em Modelo de Camundongo Humanizado

O vídeo demonstra uma técnica para gerar um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada baseada em células-tronco contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV). O tecido do timo fetal humano e as células-tronco hematopoiéticas (HSCs) projetadas são implantados na cápsula renal de um camundongo gravemente imunocomprometido. As HSCs, que expressam receptores de antígenos quiméricos (CARs) contra o HIV, são misturadas em uma mistura de proteínas gelatinosas que promove sua...

Construindo um modelo de camundongo humanizado com imunidade projetada contra o HIV

Este protocolo descreve os métodos na construção de um modelo humanizado de camundongo medula óssea/fígado/timo com imunidade projetada baseada em células-tronco contra a infecção pelo HIV.

De células-tronco Baseado Imunidade Engineered contra infecção por HIV no modelo humanizado mouse

Este protocolo fornece um método para estabelecer ratos humanizados (hu-NSG) através da injeção de colestase de células estaminais hematopoiéticas em camundongos NSG neonatais condicionada por radiação. O mouse hu-NSG é suscetível à infecção pelo HIV e terapia anti-retroviral combinatória (carrinho) e serve como um modelo fisiopatológico apropriado para investigações de latência e a replicação do HIV.

Humanizado NOD/SCID/IL2rγnula (hu-NSG) Mouse modelo para estudos de latência e a replicação do HIV

Este protocolo fornece um método confiável para estabelecer camundongos humanizados com o sistema imunológico humano e células hepáticas. Os ratos imunodeficientes reconstituídos duplos conseguidos através da injeção pseudoaneurysms de hepatócitos humanos e de pilhas de haste hematopoietic de CD34+ são suscetíveis à infecção do vírus-1 da imunodeficiência humana e recapitulam dano de fígado como observado em Doentes infectados pelo VIH.

Estabelecimento do modelo humanizado duplo do rato de TK-NOG para a patogénese HIV-associada do fígado

Aqui estão três abordagens experimentais para estudar a dinâmica da infecção pelo HIV em camundongos humanizados. O primeiro permite o estudo de eventos de infecção crônica, enquanto os dois últimos permitem o estudo de eventos agudos após infecção primária ou reativação viral.

Infecção por HIV crônica, aguda e reativada em modelos de camundongos imunodeficientes humanizados

Este protocolo descreve um novo método para administrar medicamentos antirretrovirais combinacionais orais que suprimem com sucesso a replicação do RNA do HIV-1 em camundongos humanizados.

Tratamento Antirretroviral Combinacional Oral em Camundongos Humanizados Infectados pelo HIV-1

Este protocolo descreve como a combinação da infecção por EcoHIV com camundongos Tmem119-EGFP oferece um sistema biológico valioso para investigar alterações microgliais e reservatórios virais em modelos de roedores de distúrbios neurocognitivos associados ao HIV.

Identificação de células infectadas por EcoHIV em camundongos transgênicos manipulados por microglia

Este experimento visualizado é um guia para a utilização de um clone fluorescentes molecular do HIV para viver experiências imagem confocal.

Visualizando transferência de células-célula de HIV usando Clones fluorescente de HIV e Microscopia Confocal ao vivo

Tropismo do HIV pode ser inferida a partir da região V3 do envelope viral. V3 é PCR amplificados em triplicata utilizando nested RT-PCR, sequenciado, e interpretados usando software de bioinformática. Amostras com a seqüência de um ou mais (s) com pontuações baixas são G2P classificados como não-R5 vírus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Aprenda a estabelecer um modelo de camundongo NOG humanizado para pesquisa pré-clínica do HIV usando transplante de células-tronco e exposição intravaginal. Este protocolo permite avaliar cepas virais e intervenções terapêuticas.

Camundongos NOG humanizados para exposição intravaginal ao HIV e tratamento da infecção pelo HIV

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