Name: Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda mapeamento óptico de dupla tensão e cálcio em fatias cardíacas humanas para testes pré-clínicos de drogas. Este método permite caracterizar potenciais de ação e transientes de cálcio simultaneamente em tecido humano.

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Financiamento pelo NIH (subsídios R21 EB023106, R44 HL139248 e R01 HL126802), pela Fundação Leducq (projeto RHYTHM) e uma Bolsa de Pós-Doutorado da American Heart Association (19POST34370122) são reconhecidos com gratidão.

<ol><li>Ericsson, A. C., Crim, M. J., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+animal+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">A brief history of animal modeling.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 201-205 (2013).</li>
<li>Choudhary, A., Ibdah, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+today%27s+translational+medicine+world%5BTitle%5D)+AND+%22Missouri+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models in today's translational medicine world.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 220-222 (2013).</li>
<li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%2C+Medicine%2C+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evolution, Medicine, and Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Milani-Nejad, N., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology & Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Green, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+neuroprotective+drugs+that+are+so+promising+in+animals+fail+in+the+clinic%3F+An+industry+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Why do neuroprotective drugs that are so promising in animals fail in the clinic? An industry perspective.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 29 (11), 1030-1034 (2002).</li>
<li>Shinnawi, R., Gepstein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPCS+cell+modeling+of+inherited+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">iPCS cell modeling of inherited cardiac arrhythmias.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 16 (9), 331(2014).</li>
<li>Morimoto, Y., Mori, S., Sakai, F., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+fiber-shaped+cardiac+tissue+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived fiber-shaped cardiac tissue on a chip.</a> Lab on a Chip. 16 (12), 2295-2301 (2016).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+mitochondrial+cardiomyopathy+of+Barth+syndrome+with+induced+pluripotent+stem+cell+and+heart-on-chip+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies.</a> Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).</li>
<li>Ben-Ari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+electrophysiological+characteristics+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).</li>
<li>Goversen, B., van der Heyden, M. A. G., van Veen, T. A. B., de Boer, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immature+electrophysiological+phenotype+of+iPSC-CMs+still+hampers+in+vitro+drug+screening%3A+Special+focus+on+IK1%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The immature electrophysiological phenotype of iPSC-CMs still hampers in vitro drug screening: Special focus on IK1.</a> Pharmacology & Therapeutics. 183, 127-136 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+and+proliferation+of+mammalian+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes.</a> PloS One. 5 (9), 12559(2010).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+electromechanical+stimulation+to+maintain+adult+myocardial+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro.</a> Nature Communications. 10, 2168(2019).</li>
<li>Fischer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+and+structural+preservation+of+precision-cut+human+myocardium+under+continuous+electromechanical+stimulation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro.</a> Nature Communications. 10, 117(2019).</li>
<li>Ou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Biomimetic+Culture+System+for+Pig+and+Human+Heart+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices.</a> Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).</li>
<li>Qiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+slice+culture+platform+for+the+investigation+of+human+cardiac+tissue+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology+2%22%5BJournal%5D)">Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology 2. 144, 139-150 (2019).</li>
<li>Kang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Organotypic+Cultured+Cardiac+Slices%3A+New+Platform+For+High+Throughput+Preclinical+Human+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials.</a> Scientific Reports. 6, 28798(2016).</li>
<li>Camelliti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+heart+slices+are+a+multicellular+system+suitable+for+electrophysiological+and+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 390-398 (2011).</li>
<li>Brandenburger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+from+human+adult+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium.</a> Cardiovascular Research. 93 (1), 50-59 (2012).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li>
<li>Halbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+slices+of+adult+mouse+hearts+-+A+new+multicellular+in+vitro+model+for+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ventricular slices of adult mouse hearts - A new multicellular in vitro model for electrophysiological studies.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 18 (1-3), 1-8 (2006).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices%3A+preparation%2C+handling%2C+and+successful+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 308 (9), 1112-1125 (2015).</li>
<li>Bussek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+slices+with+prolonged+survival+for+in+vitro+drug+safety+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue slices with prolonged survival for in vitro drug safety screening.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 66 (2), 145-151 (2012).</li>
<li>Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+Slices%3A+an+Intermediate+Complexity+Platform+for+Translational+Cardiovascular+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Drugs+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research.</a> Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 239-244 (2019).</li>
<li>Rouwkema, J., Koopman, B. F. J. M., Blitterswijk, C. A. V., Dhert, W. J. A., Malda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supply+of+nutrients+to+cells+in+engineered+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Supply of nutrients to cells in engineered tissues.</a> Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. 26 (1), 163-178 (2009).</li>
<li>Lang, D., Sulkin, M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+action+potentials+and+calcium+transients+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3275(2011).</li>
<li>Brianna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-Source+Multiparametric+Optocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Open-Source Multiparametric Optocardiography.</a> Scientific Reports. 9, 721(2019).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+cardiac+conduction+during+metabolic+ischemia+with+perfusate+sodium+and+calcium+in+guinea+pig+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulating cardiac conduction during metabolic ischemia with perfusate sodium and calcium in guinea pig hearts.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 316 (4), 849-861 (2019).</li>
<li>Kawara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+delay+after+premature+stimulation+in+chronically+diseased+human+myocardium+relates+to+the+architecture+of+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation delay after premature stimulation in chronically diseased human myocardium relates to the architecture of interstitial fibrosis.</a> Circulation. 104 (25), 3069-3075 (2001).</li>
<li>Qu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+recording+and+pro-arrhythmia+risk+analysis+in+human+ventricular+trabeculae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae.</a> Frontiers in Physiology. 5 (8), 1109(2018).</li>
<li>Franz, M. R., Swerdlow, C. D., Liem, L. B., Schaefer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cycle+length+dependence+of+human+action+potential+duration+in+vivo.+Effects+of+single+extrastimuli%2C+sudden+sustained+rate+acceleration+and+deceleration%2C+and+different+steady-state+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cycle length dependence of human action potential duration in vivo. Effects of single extrastimuli, sudden sustained rate acceleration and deceleration, and different steady-state frequencies.</a> Journal of Clinical Investigation. 82 (3), 972-979 (1988).</li>
<li>Lou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+heterogeneity+and+remodeling+of+ventricular+excitation-+contraction+coupling+in+human+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Transmural heterogeneity and remodeling of ventricular excitation- contraction coupling in human heart failure.</a> Circulation. 123 (17), 1881-1890 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui, apresentamos métodos passo a passo para obter fatias cardíacas viáveis de corações humanos presos cardioplegicamente e caracterizar funcionalmente as fatias usando mapeamento óptico duplo do potencial transmembrano e do cálcio intracelular. Com ambiente extracelular preservado e acoplamento de células nativas, as fatias cardíacas humanas podem ser usadas como um modelo preciso do coração humano para descoberta científica fundamental e para testes de eficácia e cardiotoxicidade de agentes farmacológicos e terapias g...

Os modelos animais têm sido uma ferramenta valiosa usada para compreender os mecanismos subjacentes da fisiologia humana e da fisiopatologia, bem como uma plataforma para testes preliminares de terapias para tratar várias doenças1. Grandes avanços foram dados no campo da pesquisa biomédica com base nesses estudos em animais2. No entanto, existem diferenças significativas entre fisiologias humanas e animais, incluindo camundongos, ratos, cobaias, coelhos, ovelhas, porcos e cães3,4. Como resultado, houve inúmeras terapias medicamentosas, genéticas e celulares que se mostraram promissoras durante a fase de testes em animais, mas não conseguiram fazer jus aos resultados nos ensaios clínicos5. Para preencher essa lacuna, miócitos cardíacos isolados e células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) foram desenvolvidos como modelos para testar a resposta da fisiologia humana a várias drogas e doenças6. Cardiomiócitos derivados de células-tronco têm sido amplamente utilizados em sistemas de órgãos em um chip como um substituto do coração6,,7,,8. No entanto, a utilidade dos cardiomiócitos derivados do iPSC (iPSC-CMs) é impedida por seu fenótipo relativamente imaturo e pela falta de representação da subpopulação do cardiomiócito; o miocárdio maduro é uma estrutura complexa composta por vários tipos de células coexistitivas, como fibroblastos, neurônios, macrófagos e células endoteliais. Por outro lado, os cardiomiócitos humanos isolados são eletricamente maduros, e diferentes subpopulações de cardiomiócitos podem ser obtidas alterando os parâmetros de cultivo9. Ainda assim, esses miócitos geralmente apresentam morfologias potenciais de ação alteradas devido à falta de acoplamento de células celulares, rápida deseferição e ocorrência de comportamento proarrítmico in vitro10,11. Algumas das limitações foram abordadas por modelos de cultura celular 3D de iPSC-CMs e miócitos cardíacos. Esses modelos, que incluem esferoides, andaimes de hidrogel encapsulados culturas 3D, tecidos cardíacos projetados (EHTs) e sistemas de coração-em-um-chip, usam múltiplas populações de células cardíacas, como cardiomiócitos, fibroblastos e células endoteliais. Eles se auto-montam ou se reúnem ao longo de um andaime para formar estruturas 3D, e alguns até reproduzem a natureza anisotropica complexa do miocárdio. Esses modelos têm sido relatados como ter células de fenótipos maduros, propriedades conjunturais e perfis moleculares semelhantes ao tecido cardíaco. O sistema coração-em-um-chip também permite o estudo de efeitos sistêmicos em testes de drogas e modelos de doenças. No entanto, os modelos in vitro baseados em células não possuem a matriz extracelular nativa e, portanto, não podem imitar com precisão a eletrofisiologia do nível dos órgãos. As fatias cardíacas humanas, em contraste, têm uma matriz extracelular intacta e contatos nativos célula-célula, tornando-as úteis para examinar com mais precisão as propriedades arritmogênicas do miocárdio humano.
Pesquisadores desenvolveram fatias organotípicas cardíacas humanas como plataforma pré-clínica fisiológica para testes de drogas agudas e crônicas e para estudar eletrofisiologia cardíaca e progressão de doença cardíaca12,,13,14,,15,,16,,17,18,,19. Quando comparadas com cardiomiócitos derivados do iPSC, as fatias cardíacas humanas replicam mais fielmente a eletrofisiologia cardíaca humana adulta com um fenótipo de cardiomiócito maduro. Quando comparadas com cardiomiócitos humanos isolados, as fatias cardíacas apresentam durações potenciais de ação fisiológica devido ao acoplamento bem preservado celular-célula e à existência intrínseca de seus ambientes intra e extracelulares nativos.
Este protocolo descreve o processo de geração de fatias cardíacas humanas de corações doadores inteiros, realizando estudos agudos (ou seja, horas de duração) e crônicos (ou seja, dias de duração) para testar parâmetros de eletrofisiologia cardíaca através de mapeamento óptico. Embora este protocolo descreva apenas o uso do tecido ventricular esquerdo (LV), ele foi aplicado com sucesso a outras regiões do coração, bem como outras espécies como ratos, ratos, cobaias e suínos14,,20,,21,22. Nosso laboratório utiliza corações inteiros de doadores humanos que foram rejeitados para transplante nos últimos 5 anos, mas é viável que esses mesmos procedimentos sejam realizados em qualquer tecido de amostra de coração doador obtido por meios alternativos (por exemplo, implantes de dispositivo de assistência ventricular esquerda [LVAD], biópsias, miectomias) desde que os tecidos tenham a capacidade de serem seccionados em cubos. O mapeamento óptico é utilizado para análise neste estudo devido à sua capacidade de mapear simultaneamente potenciais de ação óptica e transitórios de cálcio com alta resolução espacial (100 x 100 pixels) e temporal (>1.000 quadros/s). Métodos alternativos também podem ser usados, como matrizes multieletrísmos (MEAs) ou microeletrodos, mas essas técnicas são limitadas por suas resoluções espaciais relativamente baixas. Além disso, os MEAs foram projetados para uso com culturas celulares, e microeletrodos afiados são mais facilmente gerenciados para uso com corações inteiros ou grandes cunhas de tecido.
O objetivo do artigo é permitir que mais pesquisadores usem tecidos cardíacos humanos para estudos de eletrofisiologia cardíaca. Deve-se notar que a tecnologia descrita neste artigo é relativamente simples e benéfica para estudos de curto prazo (na ordem de várias horas a dias). Cultura biomimética mais fisiológica para estudos de longo prazo (na ordem das semanas) tem sido discutida e descrita por uma série de outros estudos12,,18,23. Estimulação elétrica, carga mecânica e alongamento tecidual são mecanismos de condicionamento vantajosos que podem ajudar a limitar o aparecimento de remodelagem de tecido in vitro12,,18,23.

<table><tbody><tr><td>Seringa BD de 1mL</td><td>Thomas Scientific</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>monóxido de 2,3-butanodiona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Gabinete de biossegurança</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1377</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Cayman</td><td>13186</td><td></td></tr><tr><td>Armadilha de bolhas</td><td>Radnoti</td><td></td><td></td>130149</tr><tr><td>Cloreto</td><td>de cálcio Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>Di-4-ANEPPS</td> Solução de estoque de <td>biotium</td><td></td><td>a 1,25 mg / mL em DMSO</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3c Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico de emissão</td><td>Chroma</td><td>T630LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emissão (RH237)</td>Filtro de emissão <td>Chroma</td><td>ET690 / 50m</td><td></td></tr><tr><td>(Rhod2AM)</td><td>Chroma</td><td>ET590 / 33m</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico de excitação</td><td>Chroma</td><td>T550LPXR-UF1</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitação</td><td>Chroma</td><td>ET500 / 40x</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Tubos de centrífuga cônicos</td><td>Trocador de calor Fisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Radnoti</td><td>158821</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Incubadora</td><td></td> Sigma-Aldrich H3375 <td></td> ThermoFisher Scientific 50145502 <td></td></tr><tr><td>Insulina Transferrina Selênio (ITS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fonte de luz de excitação LED</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-Mic-LED-520</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnessium hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11150059</td><td></td></tr><tr><td>Micam Ultima L tipo câmera CMOS</td><td>Scimedia</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07522-20</td><td></td></tr><tr><td>Fio de estimulação de platina</td><td>Alfa Aesar</td><td>43275</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P6867</td><td>não iônico, surfactante poliol</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Dados do Powerlab aquisição e estimulador</td><td>AD Instruments</td><td>Powerlab 4/26</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td></td></tr><tr><td>Rhod2AM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1245MP</td><td></td></tr><tr><td>Rhod-2AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Esterilizador, esferas secas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z378550</td><td></td></tr><tr><td>Difusor de Oxigênio para Pedra</td><td>Madeira de Água</td><td>B00O0NUVM0</td><td></td></tr><tr><td>TissueSeal - Histoacryl Adesivo Tópico</td><td>para Pele gobiomed</td><td>AESCULAP</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Baixo Ponto de Fusão Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td></td> Ultrassônico <td>Branson 1800</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000 smz</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de eletrofisiologia cardíaca pré-plínica por mapeamento Óptico de dupla tensão e cálcio de fatias cardíacas organotípicas humanas

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

As preparações de fatias cardíacas humanas foram recentemente desenvolvidas como uma plataforma para estudos de fisiologia humana e testes de terapia para diminuir a distância entre os ensaios animais e clínicos. Numerosos modelos animais e células têm sido usados para examinar os efeitos das drogas, mas essas respostas muitas vezes diferem em humanos. As fatias cardíacas humanas oferecem uma vantagem para o teste de drogas, pois são diretamente derivadas de corações humanos viáveis. Além de ter preservado estruturas multicelulares, acoplamento celular-célula e ambientes de matriz extracelular, fatias de tecido cardíaco humano podem ser usadas para testar diretamente o efeito de inúmeras drogas na fisiologia cardíaca humana adulta. O que distingue esse modelo de outras preparações cardíacas, como corações inteiros ou cunhas, é que as fatias podem ser submetidas à cultura de longo prazo. Como tal, as fatias cardíacas permitem estudar os efeitos agudos e crônicos das drogas. Além disso, a capacidade de coletar várias centenas a mil fatias de um único coração faz deste um modelo de alta produtividade para testar várias drogas em diferentes concentrações e combinações com outras drogas ao mesmo tempo. As fatias podem ser preparadas de qualquer região do coração. Neste protocolo, descrevemos a preparação de fatias ventriculares esquerdas isolando cubos de tecido da parede livre ventricular esquerda e seccionando-as em fatias usando um microtoma vibratório de alta precisão. Essas fatias podem então ser submetidas a experimentos agudos para medir a função eletrofisiológica cardíaca da linha de base ou cultivadas para estudos crônicos de drogas. Este protocolo também descreve o mapeamento óptico duplo de fatias cardíacas para gravações simultâneas de potenciais transmembranos e dinâmicas intracelulares de cálcio para determinar os efeitos das drogas que estão sendo investigadas.

Fatias organotípicas humanas foram coletadas do ventrículo esquerdo de um coração humano doador de acordo com o protocolo detalhado acima e ilustrado emFigura 1. Um sistema de mapeamento óptico de câmera dupla como esse emFigura 2foi utilizado na configuração de imagem vertical para realizar mapeamento óptico simultâneo de tensão e cálcio cerca de 1 h após a conclusão do protocolo de corte. Os dados foram analisados utilizando-se o RHYTHM1.2 (<strong class="xfig...

Este protocolo descreve o procedimento de secção e cultivo de fatias cardíacas humanas para testes de drogas pré-clínicos e detalha o uso de mapeamento óptico para o registro de tensão transmembrana e sinais de cálcio intracelular simultaneamente a partir dessas fatias.

Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Este protocolo é significativo porque fornece aos pesquisadores as habilidades para empregar corações humanos doadores para testes de drogas fisiológicas pré-clínicos. Este tecido utiliza corantes de tensão e cálcio para a caracterização simultânea de potenciais de ação cardíaca e transitórios de cálcio intracelulares em fatias de tecido humano. Para configurar o sistema de mapeamento óptico, conecte um banho de tecido com uma camada de gel de polidimtilsiloxano inferior a um sistema de perfusão e circule um litro de solução de recuperação a 37 graus Celsius oxigenado com 100% de oxigênio através do sistema de perfusão a uma taxa de fluxo rápido o suficiente para manter a temperatura e evitar o acúmulo de perfusato de banho.Em seguida, use um alvo para ajustar o foco e o alinhamento das duas câmeras CMOS e use uma fonte de luz LED verde com um comprimento de onda de 520 mais ou menos cinco nanômetros para excitar os corantes sensíveis à tensão e indicadores de cálcio simultaneamente. Antes de obter seções teciduais, misture a solução de cardioplegia congelada e líquida e coloque o tecido cardíaco no banho de cardioplegia gelada e identifique a parede livre ventricular esquerda. Col

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Bioengineering

Bioengenharia

Este artigo descreve uma técnica de alta resolução temporal e espacial, visualmente, movimento de ação potencial imagem sobre a superfície de corações de ratos perfundidos Langendorff-utilizando um corante potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeamento óptica de corações perfundidos Langendorff-Rat

Este artigo descreve os procedimentos básicos para a realização de experimentos de mapeamento óptico no coração de coelho Langendorff-perfundidos usando o sistema de imagem panorâmica, ea modalidade de imagem dupla (tensão e cálcio).

Multiparamétrico Mapping Optical do Coração Coelho Langendorff-perfundidos

Este artigo detalha o procedimento de dissecação, a configuração instrumental, e as condições experimentais durante o mapeamento óptico de potencial transmembrana (Vm) e transientes de cálcio intracelular (CAT) em Langendorff isolados intactos corações perfundidos mouse.

Mapeamento de potenciais de ação óptica e transientes de cálcio no coração de rato

Este artigo descreve a técnica usada para realizar o mapeamento óptico de canal duplo em monocamadas de células atriais HL-1 cultivadas. Este protocolo exclusivo permite a visualização simultânea da atividade de cálcio (Ca) e voltagem (Vm) na mesma área para a detecção e análise detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das monocamadas de cultura.

Tensão e cálcio Dual Channel Mapping Optical do Cultivadas HL-1 Atrial miócitos Monolayer

Este artigo descreve o protocolo detalhado e equipamentos necessários para o mapeamento de óptica dupla de transmembrana potencial (V m) e livre intra-retículo sarcoplasmático (RS) Ca2 + no coração de coelho Langendorff-perfundidos. Este método permite a observação direta e quantificação de V m e SR Ca2 + dinâmica no coração intacto.

Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

Este protocolo descreve a avaliação eletrofisiológica dos átrios murino utilizando um sistema óptico de mapeamento com alta resolução temporal e espacial, incluindo gravações duas da tensão da membrana e Ca2 + transitória sob programado estimulação através de um cateter eletrodo especializados.

Avaliação eletrofisiológica de murino átrios com mapeamento óptico de alta resolução

Aqui, apresentamos um protocolo para a modulação do sistema nervoso autonomic intracardíaca e a avaliação da sua influência na eletrofisiologia básica, arritmogênica e acampamento dinâmica usando uma configuração de Langendorff ex vivo .

Impacto dos neurônios intracardíacos eletrofisiologia cardíaca e arritmogênica em um sistema de Langendorff Ex Vivo

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de investigação da dinâmica cardíaca por meio de um modelo animal translacional. A abordagem experimental descrita incorpora optocardiografia de dupla emissão em conjunto com um estudo eletrofisiológico para avaliar a atividade elétrica em um modelo cardíaco suíno isolado e intacto.

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

Apresentamos um protocolo para avaliar os efeitos eletromecânicos da ativação do GtACR1 em cardiomiócitos de coelho. Fornecemos informações detalhadas sobre isolamento celular, cultivo e transdução adenoviral, e sobre experimentos funcionais com as técnicas de patch-clamp e fibra de carbono.

Avaliação eletromecânica da atividade cardiomiocito optogeneticamente modulada

Este protocolo introduz o mapeamento óptico dual-dye de corações de camundongos obtidos de animais selvagens e knock-in afetados por taquicardia ventricular polimórfica catecolaminérgica, incluindo medidas eletrofisiológicas de voltagem transmembrana e transientes intracelulares de Ca2+ com alta resolução temporal e espacial.

Mapeamento Óptico de Coração de Camundongos RyR2R2474S Knock-In de Taquicardia Ventricular Polimórfica Catecolaminérgica

Aprenda mapeamento óptico de dupla tensão e cálcio em fatias cardíacas humanas para testes pré-clínicos de drogas. Este método permite caracterizar potenciais de ação e transientes de cálcio simultaneamente em tecido humano.

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Avaliação de Eletrofisiologia Cardíaca Pré-Plínica por Mapeamento Óptico de Dupla Tensão e Cálcio de Fatias Cardíacas Organotípicas Humanas

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