Name: Indindo Raízes Peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformação Mediada em Trigo-Buck Tartary(Fagopyrum tataricum) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a induzir raízes peludas em trigo-sarraceno tartário (Fagopyrum tataricum) por transformação mediada por Agrobacterium rhizogenes. Este método simples e econômico facilita estudos genômicos e microbiômicos em plantas dicotiledôneas.

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Este trabalho foi apoiado pelos Fundos de Pesquisa Fundamentais para os institutos centrais de pesquisa de bem-estar público ZXKT17002.

A TB utilizada neste estudo foi nomeada como BT18, que se originou da raça "JinQiao No.2" cultivada pelo Centro de Pesquisa de Pequenos Grãos Diversos da Academia shanxi de Ciências Agrícolas. Os passos primários deste protocolo são ilustrados na Figura 1.
NOTA: Opere rapidamente a manipulação relacionada às plantas e, quando possível, mantenha as placas de Petri fechadas para evitar murchas e contaminação. Salvo disposição em contrário, todas as incubações de explante foram conduzidas a condição de uma luz de 14 horas e um período de fotoperíodo escuro de 10 horas a 25 °C. Salvo indicação em contrário, todas as operações relacionadas com explantas ou bactérias foram realizadas condições assépticas em uma capa de fluxo laminar. Todos os ingredientes de mídia para A. rhizogenes e culturas de plantas in vitro são fornecidos na Tabela 1. Após o ajuste do pH, todas as mídias foram autoclaved a 120 °C por 20 min. As mídias solidificadas foram preparadas preenchendo 25 mL de meio em uma placa de Petri de 9 cm de diâmetro e permitindo que ela se solidifique.
ATENÇÃO: Deposite todas as bactérias e plantas geneticamente modificadas no recipiente de resíduos apropriado. Opere todos os produtos químicos perigosos em um armário de fumaça e deposite-os no recipiente de resíduos perigosos.
1. Preparação de explantas de TB
<ol><li>Preparação de sementes de TB<ol>
<li>Selecione sementes de TB gordurosas e não danificadas(Figura 1A1)que tenham sido preservadas a uma temperatura inferior a 20 °C por no mais de 2 anos.</li>
		<li>Mergulhe as sementes em água a 28 °C por aproximadamente 20 min para que a camada de sementes possa ser facilmente descascada(Figura 1A2). Se necessário, use uma tesoura para cortar uma ranhura nas sementes para facilitar o peeling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Esterilização de sementes de TB<ol>
<li>Coloque 100-200 sementes descascadas em um frasco cônico esterilizado de 100 mL.</li>
		<li>Desinfete as sementes usando 75% de etanol para 30 s.</li>
		<li>Substitua o etanol por 5% de hipoclorito de sódio e desinfete por 15 min. NOTA: A desinfecção utilizando bicloreto de mercúrio a uma concentração de 1 g/L por 8 min pode ser usada como esterilizador alternativo para substituir o hipoclorito de sódio em qualquer caso de esterilização inadequada. ATENÇÃO: O bicloreto de mercúrio é perigoso e não é um material favorável ao meio ambiente. Opere-o no armário de fuming e deposite-o no recipiente de resíduos perigosos, se o bicloreto de mercúrio for usado em qualquer caso.</li>
		<li>Despeje o hipoclorito de sódio.</li>
		<li>Lave as sementes com água desionizada estéril 5 vezes.</li>
		<li>Borreve as sementes com um papel bibuloso estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de mudas de TB<ol>
<li>Prepare 50 mL Murashige e Skoog (MS) meio basal (1962) complementado com 30 g/L de sacarose e 7 g/L em pó de ágar (MSSA) (Tabela 1) em uma garrafa de cultura de tecido vegetal de 300 mL.</li>
		<li>Ajuste o pH para 5,8 antes de autoclaving.</li>
		<li>Distribua 10 sementes uniformemente por garrafa de meio MSSA.</li>
		<li>Germinar as sementes em uma sala de cultura a 25 °C ± 1 °C a condição de luz por 7-10 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação de explantas estéreis<ol>
<li>Selecione mudas robustas de TB(Figura 1C),quando as 2 peças de cotiledons forem desdobradas.</li>
		<li>Corte as mudas das raízes(Figura 1C pontas de flecha vermelhas),evitando o contato com o meio.</li>
		<li>Coloque-os em uma placa de Petri estéril.</li>
		<li>Corte os hipocotyls em segmentos de 0,8 a 1 cm e corte os cotiledons em aproximadamente 0,5 cm de pedaços.</li>
		<li>Pré-cultura estas explantes no meio MSSA a condição de luz por 24 horas.</li>
		<li>Transfira-os para um frasco cônico esterilizado de 100 mL, que agora está pronto para infecção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparação de A. rhizogenes para transformação
NOTA: A cepa A. rhizogenes ACCC10060 foi gentilmente fornecida pelo Instituto de Desenvolvimento de Plantas Medicinais e preservada a -80 °C. A. rhizogenes foi transformado com o vetor binário pK7GWIWG2D (II) que abriga um T-DNA carregando o gene b4 acompanhando um GFP como gene indicador e o gene de resistência Kan como um marcador selecionável. O gene b4 é um membro da família bHLH fator de transcrição, que ainda não foi publicado. Para avaliar o potencial das raízes peludas da TB, A. rizogenes foi transformado com o vetor binário pK7WG2D contendo o gene MYB116 para investigar seu efeito na produção de metabólitos secundários, como flavonoides no nível de expressão genética e por análises metabólicas. Ativado A. rhizogenes deve estar bem preparado ao mesmo tempo com as explantas.
<ol><li>Ativação de A. rhizogenes
	<ol>
<li>Descongele A. rhizogenes no gelo</li>
		<li>Mergulhe as bactérias e forre-as uniformemente no meio manitol de levedura (YEB) suplementado com pó de ágar de 15 g/L, 50 mg/L de rifampicina e 50 mg/L de espectinomicina (YEBARS, pH 7.0).</li>
		<li>Incubar a bactéria a 28 °C por 12-16 horas.</li>
		<li>Escolha uma colônia monoclonal e a cultigue em outra placa de Petri da mesma maneira descrita acima.</li>
		<li>Selecione colônias monoclonais e as cultura em um frasco cônico esterilizado de 100 mL contendo 20 mL de meio YEB suplementado com rifampicina de 50 mg/L e 50 mg/L de espectinomicina (YEBRS, pH 7.0) a 28 °C e 200 rpm por 16-18 h até que o valor deOD 600 atinja 2.0.</li>
		<li>Incubar 2%-4% da cultura acima mencionada em outro frasco cônico de 100 mL contendo 20 mL de meio YEBRS a 28 °C e 200 rpm por 4-5 h até que o valor deOD 600 atinja aproximadamente 0,5(Figura 1D).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Infecção e triagem de explantas de TB
NOTA: O objetivo deste protocolo é obter raízes peludas geneticamente transformadas. As raízes do tipo selvagem foram utilizadas como controle negativo para avaliar a expressão transgênica. Neste protocolo, A. rhizogenes foi transformado com vetor binário pK7WG2D carregando o gene de FtMYB116 ou pK7GWIWG2D (II) carregando o gene de b4 com antecedência.
<ol><li>Resuspensão de A. rhizogenes
	<ol>
<li>Transfira a cultura obtida na etapa 2.1.6 para um tubo centrífugo esterilizado de 50 mL.</li>
		<li>Gire a 4.000 x g por 10 min a 20 °C.</li>
		<li>Remova o sobrenadante e resuspenda a pelota bacteriana com meio ms suplementado com sacarose de 30 g/L e acetosiringone de 300 μM (AS) (MSSAS, pH 5.8) a OD600 ◗ 0,2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infecção de explantas<ol>
<li>Infundir a suspensão bacteriana obtida na etapa 3.1.3 em um frasco cônico contendo as explantas preparadas na etapa 1.4.6 por 10 min(Figura 1E).</li>
		<li>Tire as explantas e seque-as usando um papel bibuloso estéril.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cocultura de explants com A. rhizogenes
<ol><li>Coloque um papel filtro estéril de 9 cm de diâmetro no meio MS, que é solidificado utilizando pó de ágar de 7 g/L suplementado com 30 g/L de sacarose e 100 μM AS (meio MSSAAS, pH 5.2).</li>
	<li>Sobreponha as plantas no papel filtro a 25 °C por 3 dias no escuro (Figura 1F).</li>
</ol>5. Indução e cultura seletiva
<ol><li>Coloque aproximadamente 20 explantas infectadas no meio MSSA suplementado com 500 mg/L cefotaxime e 50 mg/L de kanamicina (Kan) (MSSACK, pH 5.8) (Figura 1G).</li>
	<li>Incuba-los verticalmente a condição de luz a 25 °C ± 1 °C. As raízes peludas ocorrem aproximadamente 1 semana após a incubação(Figura 1H pontas de flecha sinuosa de traço preto indicam ocorrência de raízes peludas). NOTA: Substitua o meio MSSACK a cada 15 dias, se necessário.</li>
</ol>6. Subculturing TB raízes peludas
NOTA: Este procedimento visa colher raízes peludas vigorosas. Observe regularmente o crescimento de raízes peludas durante a propagação, e remova as contaminadas e inativadas em tempo hábil. Se necessário, repita os seguintes passos para propagar raízes mais peludas. Leva aproximadamente 10 a 14 dias desde a subculação até a colheita.
<ol><li>Selecione as raízes peludas que mostram aparência branca e rápido crescimento.</li>
	<li>Corte-os em pedaços de 2-3 cm.</li>
	<li>É óbvio que estão em um banco limpo.</li>
	<li>Subcultura-los em um frasco cônico esterilizado de 100 mL contendo 5 mL de mS médio suplementado com 30 g/L de sacarose e 50 mg/L Kan (MSSK, pH 5.8) a uma velocidade rotativa de 80 rpm a 25 °C no escuro até que se espalhem para o fundo do frasco(Figura 1I).</li>
</ol>7. Identificação de raízes peludas transformadas e conservação
NOTA: Raízes peludas transformadas podem ser identificadas com base nos aspectos da morfologia e nível genético. A identificação também pode ser realizada de acordo com o genoma da raiz peluda e resistência, que não estão cobertos neste protocolo. Este procedimento se concentra principalmente no gene do repórter e na identificação genética do alvo.
<ol><li>Remova as raízes peludas e contaminadas e selecione aquelas com aparência branca.</li>
	<li>Avalie se há fluorescência verde um transiluminador ultravioleta duplo azul/leve.</li>
	<li>Selecione as raízes peludas que exibem um forte sinal de fluorescência nos tubos numerados ou embrulhadas usando um papel alumínio marcado depois de secá-las com um papel absorvente.</li>
	<li>Liofiliste-os em nitrogênio líquido, seguido de armazenar toda a colheita a −80 °C para investigação posterior.</li>
	<li>Identificação genética<ol>
<li>Triturar 0,1 g das raízes peludas em pó fino em nitrogênio líquido.</li>
		<li>Prepare o DNA genômico de linhas transgênicas independentes de TB usando o método de brometo de cetiltilamônio modificado (CTAB)25 de acordo com a instrução do fabricante do kit de DNA genômico da planta.</li>
		<li>Realize a reação em cadeia de polimerase (PCR) usando 100 ng de modelo de DNA genômico e primers listados na Tabela 2.</li>
		<li>Realize o ciclo de amplificação da seguinte forma: predenaturação a 94 °C por 5 min, desnaturação a 94 °C para 30 s, recozimento do primer a 55 °C para 30 s e extensão de primer a 72 °C para 30 s. Após 36 ciclos e uma etapa final de extensão a 72 °C por 10 min, analise os produtos de amplificação em géis de agarose de 1%.</li>
		<li>Manche os géis com coloração de ácido nucleico e visualize-os luz UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

A TB tem sido utilizada em diversos estudos relacionados a metabólitos secundários em níveis genéticos e metabólicos1,2,5,27,28. A cultura raiz peluda, como fonte única de produção metabólica, desempenha um papel fundamental na engenharia metabólica29 e pode ser usada para alterar vias metabólicas inserindo os genes relacionados. Kim et...

O trigo-sarraceno tartary (TB)(L.) Gaertn é um tipo de dicotyledon pertencente ao gênero Fagopyrum e à família Polygonaceae1. Como um tipo de alimento homólogo da medicina chinesa, a TB vem recebendo considerável interesse devido à sua composição química distinta e às diversas bioatividades contra doenças. A TB é principalmente rica em carboidratos, proteínas, vitaminas e carotenóides, bem como em polifenóis como ácidos fenólicos e flavonoides1. Várias atividades biológicas e farmacológicas de flavonoides, incluindo antioxidativo, anti-hipertensivo2, e anti-inflamatório, bem como propriedades anticancerígenas e antidiabéticas, foram demonstradas3.
Agrobacterium rhizogenes é uma bactéria do solo que contribui para o desenvolvimento de doenças radiculares peludas em várias plantas superiores, especialmente dicotyledons, infectando locais de feridas4,5. Este processo é iniciado pela transferência do T-DNA no plasmídeo 55,6 e é comumente acompanhado pela integração e expressão de um gene exógeno do plasmídeo Ri e os passos subsequentes de geração do fenótipo da raiz peluda7. A. rhizogenes-mediadas raízes transgênicas peludas, como uma poderosa ferramenta no campo da biotecnologia vegetal, têm sido mais amplamente utilizadas devido à sua estabilidade e alta produtividade e fácil obtenção em um curto período de tempo. Além disso, as raízes peludas induzidas por A. rizógenes são eficientemente distinguidas pelo seu desenvolvimento de raiz plagiota e crescimento altamente ramificado em um meio livre dehormônios 8. Eles podem ser usados em diversos campos de pesquisa, incluindo produção de sementes artificiais, pesquisa de nódulos radiculares e no estudo das interações com outros organismos, como fungos micorrízicos, nematóides e patógenos radiculares7,9. Além disso, culturas de transformação de raízes peludas têm sido amplamente utilizadas como um sistema experimental para investigar as vias bioquímicas e a sinalização química e produzir metabólitos secundários vegetais que são usados como fármacos, cosméticos e aditivos alimentares8,10. Os valiosos metabólitos secundários, incluindo alcalóides indobes, aconitos, alcalóides tropanos, terpenóides e flavonoides, sintetizados em raízes peludas do tipo selvagem têm sido investigados por várias décadas em inúmeras espécies, como ginsenoside em Panax ginseng11, coumarine em Ammi majus12, e compostos fenólicos na TB2,13.
Raízes peludas foram produzidas usando A. rizogenes em 79 espécies de plantas de 27 famílias14. Por exemplo, a transformação da raiz peluda mediada por A. rhizogenesfoi relatada na soja15,16, Salvia17, Plumbago indica18, Lotus japonicus19, e chicória(Cichorium intybus L.) 20. A transformação das raízes peludas da TB também foi investigada2. Poucos protocolos detalhados estão disponíveis em relação ao desenvolvimento de raízes peludas mediadas por A. rhizogenes ou carregando um vetor binário ou não. Por exemplo, Sandra et al.21 introduziram um método de produção de raízes transgênicas de batata peluda sustentadas em brotos do tipo selvagem. As raízes peludas totalmente desenvolvidas poderiam ser visualizadas 5-6 semanas após a injeção de A. rhizogenes carregando o gene gus reporter para o caule internode plantas de batata. Outro estudo também havia relatado um sistema de raiz peluda transgênica induzido por A. rhizogenes que abrigava o gene do repórter gusA na juta(Corchorus capsularis L.) 22. Além disso, Supaart et al.23 obtiveram raízes transgênicas de tabaco peludo usando A. rhizogenes transformados com a expressão vetorial pBI121 carregando o gene de Δ1-tetrahidrocanabinolic acid (THCA) para produzir THCA.
No entanto, um processo passo a passo para uma geração eficaz de transformação de raízes peludas, especialmente na TB, tem sido relativamente menos demonstrado. Neste estudo, descrevemos um protocolo detalhado usando A. rhizogenes carregando o gene do repórter(GFP),um marcador seletivo(Kan),e um gene de interesse(b4,um gene identificado do nosso grupo, mas um gene inédito da família hélice-loop-hélice básica (bHLH)para gerar transformação genética de raiz peluda na TB. O experimento durou de 5 a 6 semanas, desde a inoculação das sementes até a geração de raízes peludas, envolvendo a preparação explante, infecção, coculturing, subcultura e posterior propagação. Além disso, A. rizogenes contendo um plasmídeo binário que transporta o transgene de TB do fator de transcrição da mieloblastose 116 (FtMYB116) foi usado para determinar se ftMYB116 pode promover o acúmulo de flavonoides, particularmente rutina, em TB no nível genético e metabólico através da transformação da raiz peluda da TB. FtMYB116, que é um fator transcricional induzido pela luz, regula a síntese de rutin em diferentes condições de luz5. Calcone synthase(CHS),flavanone-3-hydroxylase(F3H),flavonoide-3'-hydroxylase(F3'H),e flavonol synthase(FLS)24 são enzimas-chave envolvidas na via metabólica da biossíntese rutina. Portanto, este estudo demonstra a superexpressão de FtMYB116 em raízes peludas da TB e a expressão de genes enzimáticos chave, bem como o conteúdo de rutin e outros flavonoides como a quercetina.

<table><tbody><tr><td>2 * Taq PCR</td><td>MasterMix Aidlab, China</td><td>PC0901</td><td></td></tr><tr><td>Ágar pó</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>A8190</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador de termocicladores 2720</td><td>da Biosystems ThermoFisher Scientific, EUA</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>AS</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>A8110</td><td>Diluído em DMSO, vetores binários de 100</td></tr><tr><td></td><td>mM ThermoFisher Científico (invitrogen), US</td><td>/</td><td>pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II)</td></tr><tr><td>Cefotaxima, sódio</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>C8240</td><td>Diluído em Água, 200 mg/mL</td></tr><tr><td>CF15RXII micro de alta velocidade</td><td>Hitachi, Japão</td><td>No. 90560201</td><td></td></tr><tr><td>Diposable Petri-dish</td><td>Guanghua fábrica de instrumentos médicos, Yangzhou, China/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DYY-6C aparelho</td> <td>de eletroforeseBjliuyi, Pequim China</td><td>ECS002301</td><td></td></tr><tr><td>Kit de RNA de planta EASYspin Plus</td><td>Aidlab, China</td><td>RN38</td><td></td></tr><tr><td>ELGA purelab untra bioscience</td><td>ELGA LabWater, Reino Unido</td><td>82665JK1819</td><td></td></tr><tr><td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td><td>biotek, US</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP/LR enzima de reação</td><td>ThermoFisher Scientific (invitrogen), US</td><td>11789100/11791110</td><td></td></tr><tr><td>Agitador multifuncional HYG-C</td><td>Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Kan</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>K8020</td><td>Diluído em Água, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>MLS-3750 Esterilizador de autoclave</td><td>Sanyo, Japão</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>MS sais com vitaminas</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>M8521</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Solarbio Life Ciência, Pequim, China</td><td>S8210</td><td></td></tr><tr><td>Outros produtos químicos não declarados</td><td>Beijing Chemical Works, China</td><td></td><td>etanol, bicloreto de mercúrio, etc.</td></tr><tr><td>Medidor de pH PHS-3C</td><td>Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China</td><td>a008</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNA genômico vegetal</td><td>TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD</td><td>DP305</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>R8010</td><td>Diluído em DMSO, 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>S8040</td><td>Diluído em Água, 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>S8270</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA Marker</td><td>TransGen Biotech, Pequim, China</td><td>BM101-01</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Whatman diâmetro 9 cm Papel de filtro</td><td>Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura em pó</td><td>Solarbio Life Science, Pequim, China</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

indindo raízes peludas por agrobacterium rhizogenes-transformação mediada em trigo-buck tartary(fagopyrum tataricum)

Inducing Hairy Roots by Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation in Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum)

O trigo-sarraceno tartary (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possui várias atividades biológicas e farmacológicas porque contém metabólitos secundários abundantes, como flavonoides, especialmente rutina. Os rizógeness agrobacterium têm sido gradualmente usados em todo o mundo para induzir raízes peludas em plantas medicinais para investigar funções genéticas e aumentar o rendimento de metabólitos secundários. Neste estudo, descrevemos um método detalhado para gerar raízes peludas mediadas por A. Rhizogenesna TB. Cotyledons e eixo hipocotyledonary em 7-10 dias foram selecionados como explants e infectados com A. rizogenes carregando um vetor binário, que induziu raízes peludas aveniosas que apareceram após 1 semana. A transformação da raiz peluda gerada foi identificada com base na morfologia, seleção de resistência (kanamicina) e expressão genética de repórter (proteína fluorescente verde). Posteriormente, as raízes peludas transformadas foram auto-propagadas conforme necessário. Enquanto isso, um fator de transcrição da mieloblastose (MYB), FtMYB116, foi transformado no genoma da TB usando as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespara verificar o papel do FtMYB116 na sintetização dos flavonoides. Os resultados mostraram que a expressão de genes flavonoides e o rendimento de compostos flavonoides (rutina e quercetina) foram significativamente (p < 0,01) promovidos por FtMYB116, indicando que as raízes peludas mediadas por A. rhizogenespodem ser usadas como uma ferramenta alternativa eficaz para investigar as funções genéticas e a produção de metabólitos secundários. O protocolo detalhado passo a passo descrito neste estudo para a geração de raízes peludas pode ser adotado para qualquer transformação genética ou outras plantas medicinais após o ajuste.

Agrobacterium rhizogenes-transformação de raiz peluda da TB mediada Este estudo descreve o protocolo passo-a-passo que foi estabelecido para obter raízes peludas geneticamente transformadas usando A. rhizogenes. Levou aproximadamente 5-6 semanas desde a inoculação das sementes de TB até a colheita das raízes peludas identificadas, e alguns passos-chave são retratados na Figura 1 (A-H). Resumidamente, as sementes com casca esterilizadas f...

Descrevemos um método de indução de raízes peludas pela transformação mediada pelo Agrobacterium rhizogenesno trigo-sarraceno tartary(Fagopyrum tataricum). Isso pode ser usado para investigar funções genéticas e produção de metabólitos secundários em trigo sarraceno tartary, ser adotado para qualquer transformação genética, ou usado para outras plantas medicinais após a melhoria.

Indindo Raízes Peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformação Mediada em Trigo-Buck Tartary(Fagopyrum tataricum)

Tartary buckwheat (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] possesses various biological and pharmacological activities because it contains abundant ...

Usando este protocolo, demonstraremos o processo passo a passo para induzir raízes peludas no trigo tartário pela primeira vez. Esta técnica é fácil e barata para começar a genômica e microbiomia para trigo-sarraceno tartário e outras plantas. Embora este método detalhado seja configurado para trigo-sarraceno tartário, ele pode ser aplicado a outras plantas dicot com algumas modificações.Embora este método seja fácil de executar, ele tem muitos passos detalhados. A demonstração visual pode ajudar os pesquisadores a alcançar uma indução de raiz pelente mais eficiente. Demonstrando o procedimento será Guangtao Qian, um estudante de mestrado do meu laboratório.Comece selecionando sementes de trigo-trigo tartário gordurosas e não danificadas e absorvendo as sementes em água Celsius de 28 graus por aproximadamente 20 minutos. Quando o casaco de sementes puder ser facilmente removido, coloque 100 a 200 sementes descascadas em um frasco cônico esterilizado de 100 mililitros contendo 75% de etanol por 30 segundos. No final da esterilização, substitua o etanol por hipoclorito de 5%.Após 15 minutos, decante o hipoclorito de sódio e lave as sementes com água deionizada estéril cinco vezes. Em seguida, borrique as sementes secas com um pedaço de papel bibuloso estéril. Para obter mudas de trigo tartário, adicione 10 sementes por garrafa a garrafas individuais de cultura de tecido vegetal de 300 mililitros contendo 50 mililitros de meio MSSA.Em seguida, germine as sementes em uma sala de cultura aos 25, mais ou menos 1, graus Celsius sob condições de luz. Após 7 a 10 dias, selecione mudas robustas com duas peças de cotilledons desdobrados e corte as mudas das raízes. Coloque as mudas em uma placa de petri estéril e corte os hipocotils em segmentos de 0,8 a 1 centímetro.Sheer the cotyledons em aproximadamente 0,5 centímetros de peças e pré-cultura as explantas resultantes sob condições de luz por 24 horas. No dia seguinte, transfira as explantas para um frasco consírico esterilizado de 100 mililitros. Para ativar A.rizogenes, descongele a cultura no gelo antes de emplacar uniformemente as bactérias no meio sólido YEB com antibióticos para uma incubação de 12 a 16 horas a 28 graus Celsius.Na manhã seguinte, escolha uma colônia monoclonal para cultura em uma nova placa de petri como acabou de demonstrar. Após mais 12 a 16 horas de incubação, inocular as colônias monoclonais resultantes em um frasco consílico esterilizado de 100 mililitros contendo 20 mililitros de yeb médio sólido com antibióticos a 28 graus Celsius e 200 revoluções por minuto por 16 a 18 horas até que a densidade óptica em 600 atinja 2,0. Em seguida, transfira 2-4% da cultura celular bacteriana para um novo frasco cônico de 100 mililitros contendo 20 mililitros de meio sólido YEB fresco com antibióticos a 28 graus Celsius e 200 revoluções por minuto por 4 a 5 horas até que a densidade óptica a 600 nanômetros atinja aproximadamente 0,5.Para induzir a transformação da raiz pelrosa, transfira a cultura A.rizogenes em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e colete as bactérias por centrifugação. Resuspenque a pelota em mssas médio para uma densidade óptica de aproximadamente 0,2 e infunda a suspensão no frasco de explants. Após 10 minutos, retire as explantas do frasco e borre-as com um pedaço de papel bibuloso estéril.Em seguida, coloque um pedaço estéril de 9 centímetros de diâmetro de papel filtro sobre um prato de mssaas médio e sobreponha as explantas no papel filtro para uma incubação de três dias a 25 graus Celsius no escuro. Ao final da incubação, transfira aproximadamente 20 explantas infectadas para o mssack médio e verticalmente incubar as plantas em condições leves a 25, mais ou menos 1, graus Celsius. Após 10 a 14 dias de cultura, selecione as raízes peludas demonstrando uma aparência branca e crescimento rápido e corte as raízes em pedaços de dois a três centímetros.Claramente numera as raízes em um banco limpo. Subcultura as peças radiculares em um frasco consílico esterilizado de 100 mililitros contendo mSK médio a 25 graus Celsius e 80 revoluções por minuto no escuro até que se espalharam para o fundo do frasco. Para identificar as raízes peludas, remova as raízes peludas e contaminadas e selecione aquelas com aparência branca.Se um gene repórter foi usado, verifique as raízes quanto à fluorescência sob um transilluminator ultra violeta azul ou leve e selecione as raízes peluadas que exibem um forte sinal fluorescente. Em seguida, seque as raízes com papel absorvente e enrole-as em papel alumínio marcado para análise imediata. Para armazenamento a longo prazo, lyophilize as raízes em nitrogênio líquido e coloque as raízes a menos 80 graus Celsius até sua investigação.Após a transformação genética e a cultura, como demonstrado, as raízes peludas exibirão uma cor branca fofa e uma forma plagiotrópico nos locais de ferida das explantas e formarão uma matriz altamente ramificada e entrelaçada. Um gene repórter pode ser usado para facilitar a diferenciação das raízes peluadas transgênicas sob uma transilluminação ultravioleta ultravioleta azul ou leve, ou a identificação de um gene alvo de interesse. Aqui, mostra-se a expressão relativa de um fator de transcrição induzido pela luz nas linhas transgênicas de raízes peludas tartárias.Notavelmente, a biossíntese de rutina e quercetina também são promovidas no nível metabólico em resposta à superexpressão do fator de transcrição induzida. Além disso, a expressão genética relativa dos genes da síntese flavenóide em todas as três linhas transgênicas, são notavelmente maiores do que as medidas no grupo controle, indicando uma transformação de raiz pelada bem sucedida em explantas tartárias de trigo sarraceno. Isso é infecção das sementes, seleção das explantas, e a concentração das bactérias afetam diretamente o sucesso da indução da raiz pelêgica.Podemos avaliar a expressão genética, a proteína do DNA ou reações proteicas ou a produção em massa de metabólitos secundários para estudar metabólitos secundários de regulação transcricional. As bactérias projetadas são perigosas para os humanos e seu ambiente. Tome cuidado para manusear, operar e descartar as bactérias corretamente.

inducing-hairy-roots-agrobacterium-rhizogenes-mediated-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

Devido à sua versátil aplicação como espécie-modelo em vários campos de estudo, há a necessidade de um kit de ferramentas de transformação genética em banana-da-terra (Plantago lanceolata) de  folha estreita. Aqui, utilizando a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens, é apresentado um protocolo que resulta em linhagens transgênicas estáveis com eficiência de transformação de 20%.

Transformação Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Plátano de Folha Estreita

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Aqui, apresentamos o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir plantas compostas.

Um Método Eficiente e Reprodutível para Produção de Compósitos por Transformação de Raízes Pelosas à Base de Agrobacterium rhizogenes

O protocolo descreve indução de raízes pilosas utilizando hastes primárias de inflorescência de Arabidopsis e hipocótilos de Brassica napus . As raízes pilosas podem ser cultivadas e usadas como explantes para regenerar plantas transgênicas.

Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana e Brassica napus

A metodologia de alto rendimento, automatizada, produção e transformação de protoplastos de tabaco é descrito. O sistema robótico permite a expressão do gene massivamente paralelo e descoberta no sistema modelo BY-2 que podem ser traduzidas para as culturas não-modelo.

A plataforma robótica de alta capacidade de protoplastos Isolamento e Transformação

A oogênese de Drosophila continua a ser excepcionalmente útil no estudo da proliferação e herança mitocondrial. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado usado para rotular o DNA mitocondrial replicante (mtDNA) em ovários adultos de Drosophila com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), o que facilita a descoberta de mecanismos associados à herança mitocondrial que antes eram discutíveis.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

Geneticamente codificado histona-miniSOG induz mutações hereditárias do genoma de uma forma dependente da luz azul. Este método de mutagénese é simples, rápido, livre de produtos químicos tóxicos, e bem adequada para triagem genética para a frente e integração do transgene.

A mutagénese aleatória optogenetic Usando Histona-miniSOG em<em&gt; C. elegans</em

Os mutantes de deleção de genes gerados através da recombinação homóloga são o padrão-ouro para estudos de função gênica. O método OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) para a geração rápida de construções de exclusão é descrito. A transformação fúngica mediada por Agrobacterium segue. Finalmente, é apresentado um método de confirmação baseado em PCR de deleções genéticas em transformantes fúngicos.

Produção de Deleção Rápida em Fungi via<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Transformação mediada de construções de eliminação de OSCAR

Aqui, apresentamos um protocolo para espacial e temporalmente, avaliar a presença de microbiota viável nas entranhas de carrapato usando uma abordagem de hibridação in situ de montagem todo modificado.

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Aprenda a induzir raízes peludas em trigo-sarraceno tartário (Fagopyrum tataricum) por transformação mediada por Agrobacterium rhizogenes. Este método simples e econômico facilita estudos genômicos e microbiômicos em plantas dicotiledôneas.

Indindo Raízes Peludas por Agrobacterium rhizogenes-Transformação Mediada em Trigo-Buck Tartary(Fagopyrum tataricum)

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