Name: Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Aprenda a preparar células sintéticas produtoras de proteínas usando lisados bacterianos livres de células, lipossomos e transferência de emulsão. Este método versátil permite a produção terapêutica de proteínas no local para aplicações em biotecnologia.

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Este trabalho foi apoiado pelo ERC-STG-2015-680242.
Os autores também reconhecem o apoio do Centro Integrado de Câncer Technion (TICC); o Russell Berrie Nanotechnology Institute; o Centro Interdisciplinar de Ciências e Engenharia de Vida Lorry I. Lokey; o Ministério da Economia de Israel para um Kamin Grant (52752); o Ministério da Ciência de Israel Tecnologia e Espaço – Escritório do Cientista Chefe (3-11878); a Fundação de Ciência de Israel (1778/13, 1421/17); a Associação israelense de câncer (2015-0116); a Fundação German-Israelense de Pesquisa e Desenvolvimento Científico para uma bolsa GIF Young (I-2328-1139.10/2012); o Programa FP-7 IRG da União Europeia para uma Bolsa de Integração de Carreira (908049); o Subsídio do Centro de Pesquisa Fosfolipídeo; uma Fundação Rosenblatt para pesquisa de câncer, uma Bolsa da Fundação Da Família Mallat; e a Unger Family Foundation. A. Schroeder reconhece as Bolsas Alon e Taub. O. Adir reconhece as bolsas Sherman e Gutwirth. G. Chen reconhece a Bolsa Sherman. N. Krinsky reconhece o Programa de Doutorado feminino da Baronesa Ariane de Rothschild da Fundação Rothschild Caesarea.

NOTA: A ilustração do protocolo completo de produção das células sintéticas é apresentada na Figura 1. De acordo com as necessidades do usuário, a expressão proteica (seção 3.2) e a formação de células sintéticas (seção 4) do protocolo também podem ser realizadas independentemente (com algumas adaptações).
1. Preparação do lysate S30-T7
<ol><li>Placa de raia a bactéria E. coli BL21(DE3) transformada com a polimerase T7 RNA expressando pAR1219 plasmídeo em uma placa LB-ágar suplementada com ampicillina de 50 μg/mL para obter colônias únicas.</li>
	<li>Prepare uma solução de partida: Inocule uma única colônia em 5 mL de LB-media suplementada com ampicillina de 50 μg/mL em um frasco erlenmeyer de 100 mL e cresça durante a noite usando um agitador de incubadora de piso a 250 rpm e 37 °C. Prepare as duplicatas.</li>
	<li>Inocule cada partida de 5 mL separadamente em 500 mL de mídia tb suplementada com ampicillina de 50 μg/mL em um frasco erlenmeyer de 2 L com defletores e cresça-o usando um agitador de incubadora de piso a 250 rpm e 37 °C até atingirOD 600 de 0,8-1. Monitore periodicamente usando um espectrofotômetro.</li>
	<li>Adicione 2-3 mL de 100 mM de estoque de IPTG (para atingir 0,4 - 0,6 mM) para indução de expressão de polimerase T7 RNA e continue crescendo a cultura até atingir OD600¥4.</li>
	<li>Transfira a solução de cada frasco de Erlenmeyer para dois tubos de centrífuga esterilizados de 250 mL.</li>
	<li>Centrífuga cada um a 7.000 x g por 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante. NOTA: Nesta fase, a pelota bacteriana pode ser armazenada a -20 °C por alguns dias antes de passar para os próximos passos.</li>
	<li>Suspenda novamente cada pelota em 250 mL de tampão de lysate frio (4 °C) S30 e centrífuga a 7.000 x g por 10 min a 4 °C. NOTA: O tampão de lysato S30 é usado para manter a estabilidade proteica após a realização da lse celular utilizando o homogeneizador na etapa 1.9. A partir deste passo em diante, todas as etapas até 1.12 devem ser realizadas consecutivamente e rapidamente. NOTA: Antes de seguir para o próximo passo, pré-resfrie as pontas e frascos de 1,5 mililitro que serão necessários para armazenar o lysato</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e suspenda novamente todas as pelotas em 15 mL de tampão de lysato S30 frio. Filtrar a suspensão usando gaze pad. NOTA: 15ml de solução é devido ao volume de homogeneizador min. Deve-se notar que a concentração de bactérias também é importante.</li>
	<li>Homogeneizar a uma pressão de trabalho de 15.000 psi, com uma pressão de ar de 4 bar (duas passagens) para quebra celular. Evite a diluição da solução para um lysate mais concentrado e ativo.</li>
	<li>Adicione 100 μL de 0,1 M DTT (CUIDADO) por 10 mL da suspensão homogeneizada.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão a 24.700 x g por 30 min a 4 °C.</li>
	<li>Realize rapidamente o seguinte passo para preservar a atividade lisato: divida o sobrenadante um por um em alicotas de 200 μL em frascos pré-refrigerados de 1,5 mL e imediatamente estale congelá-los com nitrogênio líquido. Armazene a -80 °C para uso adicional. ATENÇÃO: O DTT é classificado como irritante e prejudicial e, portanto, deve ser tratado com cuidado.</li>
</ol>2. Preparação de lipídios na solução de óleo
<ol><li>Dissolva POPC e colesterol em clorofórmio (CUIDADO) separadamente, cada um com uma concentração final de 100 mg/mL. Vórtice cada frasco separadamente.<ol>
<li>Combine os componentes em um frasco de vidro de 2mL: adicione 50 μL de POPC no clorofórmio, 50 μL de colesterol no clorofórmio e 500 μL de óleo mineral. Para 100 μL de células sintéticas, são necessários 2 frascos de lipídios em óleo.</li>
		<li>Vórtice, e depois aquecer por cerca de 1 h a 80 °C em uma capa química para evaporar o clorofórmio. Certifique-se de que a evaporação completa ocorreu seguindo o tempo/condições especificado e monitorando o volume da solução. NOTA: A solução lipídica resultante do óleo pode ser armazenada à temperatura ambiente por até duas semanas. Para melhores resultados, recomenda-se usar uma nova preparação antes de cada experimento. As proporções de lipídios e colesterol podem ser alteradas de acordo com a composição da membrana desejada. Uma alta concentração de colesterol pode levar à formação de agregados na solução final de células sintéticas. ATENÇÃO: O clorofórmio é classificado como irritante e prejudicial e, portanto, deve ser tratado com cuidado e em áreas com extração de fumaça.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparações de soluções externas, pré-internas e de alimentação
<ol><li>Elaboração de soluções de estoque<ol>
<li>Prepare as soluções de estoque listadas na Tabela 2 utilizando água ultrapura (UPW). NOTA: As soluções de estoque devem ser preparadas com antecedência e armazenadas a -20 °C até o uso posterior. O reagente 7 tende a formar agregados. O aquecimento para 37 °C reduzirá a agregação. Uma ligeira agregação não afetará significativamente a reação. A solução do reagente 8 é leitosa e turva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução externa<ol>
<li>Dissolver a glicose em H2O sem DNase/RNase para uma concentração final de 200 mM.</li>
		<li>Para 100 μL de solução interna, prepare 1,6 mL de solução externa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução pré-interna<ol>
<li>Adicionar reagentes 1-14 de acordo com as quantidades e concentração listadas na Tabela 2. Por exemplo, para um volume final de célula sintética de 100 μL, prepare 100 μL de solução interna. NOTA: UpW deve ser adicionado para completar o volume final necessário. Nesta fase, a mistura pode ser armazenada a 4 °C por algumas horas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solução de alimentação<ol>
<li>Adicione todos os reagentes de acordo com os valores e concentração listados na Tabela 3. NOTA: Use a razão 1:1 da solução de alimentação:solução interna. Para um volume final de célula sintética de 100 μL, prepare 100 μL de solução de alimentação. Recomenda-se preparar um pequeno volume excedente de solução externa, interna e alimentar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparação de células sintéticas
NOTA: Os seguintes volumes são ajustados para a preparação de 100 μL de células sintéticas.
<ol><li>Células sintéticas que produzem proteína<ol>
<li>Em um tubo de 15 mL, coloque 12 mL da solução externa e adicione lentamente, em cima de uma camada, de 500 μL de lipídios na solução de óleo. Incubar em temperatura ambiente por 20 min.</li>
		<li>Para finalizar a preparação da solução interna: misture os ingredientes da solução interna no gelo triturado a um volume final de 100 μL descongelando e adicionando S30-T7 Lysate (reagente 15) e plasmídeo de DNA (reagente 16) à mistura armazenada.</li>
		<li>Para o segundo frasco de vidro de 2 mL com 500 μL de lipídios na solução de óleo, adicione 100 μL da solução interna. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente por 1 minuto e vórtice por mais um minuto no nível cinco.<ol>
<li>Incubar por 10 min em gelo esmagado e adicionar lentamente a emulsão resultante em cima da fase do óleo no tubo de 15 mL (a partir de 4.1.1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifugação por 10 min a 100 x g e 4 °C e, em seguida, centrífuga por 10 min a 400 x g e 4 °C. Ao final da centrifugação, deve-se observar uma pelota na parte inferior do tubo. NOTA: O uso de um rotor de centrífuga de balde balançando é preferido aqui para adquirir uma melhor cobertura de uma segunda camada de lipídios durante a passagem das gotículas de água em óleo através da interfase. Caso não haja pelota observável, a velocidade de centrifugação pode ser aumentada para 1000 x g. Caso contrário, consulte a seção Discussão referente à gravidade específica da solução externa.</li>
		<li>Extrair a pelota.<ol>
<li>Remova o excesso de camada de óleo.</li>
			<li>Use uma ponta de pipeta aparada carregada com aproximadamente 400 μL de solução externa para extrair a pelota. Solte a solução externa durante a fase de óleo, a fim de coletar apenas a pelota na fase aquosa.<ol>
<li>Limpe a ponta após a extração da pelota para evitar a transferência de restos de óleo e transfira a pelota para um tubo limpo de 1,5 mL.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Centrifugação por 10 min a 1.000 x g e 4 °C, remova o sobrenadante e suspenda novamente a pelota em 100 μL de solução de alimentação (proporção de 1:1 de soluções internas:alimentação). NOTA: Um rotor de centrífuga de ângulo fixo também pode ser usado aqui.</li>
		<li>Para expressão proteica, incubar por 2 horas a 37 °C sem tremer. NOTA: O tempo ideal de incubação varia entre diferentes proteínas.</li>
		<li>Avalie a quantidade de proteína produzida utilizando um método adequado de acordo com as propriedades da proteína alvo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Grupos de controle recomendados<ol>
<li>Solução interna e confirmação de atividade de lysate<ol>
<li>Prepare uma solução interna completa (com DNA e S30-T7 lysate).</li>
			<li>Incubar imediatamente a reação acima usando um agitador de incubadora a 250 rpm ou uma termomixer a 1200 rpm, a uma temperatura constante de 37 °C por 2 h. NOTA: Ajuste o tempo de incubação para corresponder ao tempo de incubação das células sintéticas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Células sintéticas<ol>
<li>Grupo de controle negativo: Prepare o protocolo apresentado em 4.1 com solução interna sem DNA.</li>
			<li>Controle positivo: Prepare o protocolo apresentado em 4.1 com solução interna contendo uma codificação plasmídea T7 para um gene de repórter. NOTA: Adicione um grupo de controle positivo composto por um gene de repórter, como o sfGFP, ao lado dos grupos de teste para garantir a etapa de eficiência de encapsulamento.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Merkle, D., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+and+anchoring+of+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution and anchoring of cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> ChemBioChem. 9 (16), 2673-2681 (2008).</li>
<li>Vleugel, M., Roth, S., Groenendijk, C. F., Dogterom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+basic+mitotic+spindles+in+spherical+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of basic mitotic spindles in spherical emulsion droplets.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54278(2016).</li>
<li>Bayoumi, M., Bayley, H., Maglia, G., Sapra, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-compartment+encapsulation+of+communicating+droplets+and+droplet+networks+in+hydrogel+as+a+model+for+artificial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multi-compartment encapsulation of communicating droplets and droplet networks in hydrogel as a model for artificial cells.</a> Scientific Reports. 7, 45167(2017).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: applications come of age.</a> Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Este protocolo introduz um método simples e acessível para a produção de grandes quantidades de células sintéticas produtoras de proteínas. O rendimento das células ativas depende da execução cuidadosa e precisa do protocolo com ênfase em várias etapas críticas. Na seção de preparação de lisato deste método, é essencial alcançar a densidade de bactérias apropriada antes da lse celular para alcançar uma quantidade suficiente de proteínas no lisato bacteriano. Em segundo lugar, o processo de lyse deve ser realizado a 4 °C ...

As células sintéticas são partículas artificiais semelhantes a células, imitando uma ou múltiplas funções de uma célula viva, como a capacidade de se dividir, formar interações de membrana e sintetizar proteínas com base em um código genético1,2,3. Células sintéticas que encerram sistemas de síntese proteica livre de células (CFPS) possuem alta modularidade devido à sua capacidade de produzir várias proteínas e seqüências de RNA após alterações no modelo de DNA. Apresentando uma alternativa atraente às abordagens atuais da produção de proteínas, os sistemas CFPS baseiam-se em lisato celular, componentes purificados ou componentes sintéticos e incluem todas as máquinas de transcrição e tradução necessárias para a síntese de proteínas como ribossomos, Polimerase de RNA, aminoácidos e fontes de energia (por exemplo, 3-fosfoliglicerato e adenina,tripofatos)4,5,6,7, 8,8.9 O encapsulamento de um sistema CFPS dentro de vesículas lipídicas permite a produção simples e eficiente de proteínas sem depender de uma célula viva10. Além disso, esta plataforma permite a síntese de peptídeos que podem se degradar dentro das células naturais, a produção de proteínas tóxicas para as células vivas e a modificação de proteínas com aminoácidos não naturais11,12. As células sintéticas têm sido utilizadas como modelo para fins de pesquisa investigando os componentes celulares mínimos necessários para permitir a vida celular a partir de uma perspectiva evolutiva1,13. As células sintéticas também têm sido utilizadas para construir e implementar circuitogenético e como modelos para evolução dirigida14,,15,,16. Outros estudos têm focado na capacidade das células sintéticas de imitar a atividade biológica das células naturais, visando substituir células naturais danificadas, como células beta em pacientes com diabetes17. Além disso, a capacidade dessas células sintéticas encapsuladas cfps de produzir uma variedade de proteínas terapêuticas ilustra seu potencial para serem incorporadas ao uso clínico18.
Aqui descrevemos um protocolo de escala de laboratório de baixo para cima (Figura 1) para a produção de RNA e células sintéticas produtoras de proteínas com base em um sistema CFPS encapsulado em uma vesícula lipídica. Isso mostra o potencial uso de plataformas de células sintéticas como novos sistemas de entrega de medicamentos para a produção in loco de uma droga de proteína terapêutica in vivo19. Estudos anteriores têm investigado a otimização da reação cfps e os processos de preparação de lésa celular4,8,20. Além disso, várias técnicas têm sido aplicadas para a preparação do liposome do tamanho celular, tais como os métodos de estabilização de gotículas microfluidas e baseadas em polímeros21,,22,23, que também diferem na composição lipídica dos liposóis24,,25,26. No protocolo apresentado, as células sintéticas são produzidas utilizando-se um método de transferência de emulsão de água-no-óleo e o processo de encapsulamento é realizado a baixas temperaturas (<4 °C)5,10,24,27,28. Estas condições leves têm sido favoráveis para a manutenção da integridade biofuncional das máquinas moleculares, ou seja, ribossomos e proteínas27,29,30. A composição lipídica das partículas consiste tanto no colesterol quanto no 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glicero-3-fosfocholine (POPC). A primeira é encontrada em todas as membranas celulares dos mamíferos e é essencial para a estabilidade, rigidez e redução da permeabilidade da membrana, e esta última imita a composição fosfolipídea dos mamíferos11,13. A transcrição celular e a maquinaria molecular de tradução são extraídas da cepa BL21 (DE3) Escherichia coli (E. coli), que é transformada com pAR1219 plasmídeo superexpressor t7 rna polimerase para aumentar a potência cfps e a síntese de proteínas. Este sistema tem sido utilizado para produzir proteínas diagnósticas e terapêuticas, com pesos moleculares de até 66 kDa in vitro e in vivo19,31. O protocolo a seguir fornece um método simples e eficaz para a produção do sistema celular sintético, que pode abordar uma ampla gama de questões fundamentais associadas à síntese proteica na natureza e também pode ser utilizado para aplicações de entrega de medicamentos.

<table><tbody><tr><td><forte>A. Reagentes necessários para a etapa 1 (preparação do lisado S30-T7)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli BL21 (DE3)&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2527</td><td>E.coli BL21 (DE3).</td></tr><tr><td>pAR1219</td><td>Sigma</td><td>T2076</td><td>TargeTron vetor para transformação.</td></tr><tr><td>Solução estoque de 50 mg / mL de ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td>Armazenado a -20 ° C.</td></tr><tr><td>10 g/L de bacto-triptona</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Para preparação de placa de ágar Luria Bertani (LB) (1,5%).</td></tr><tr><td>10 g/L de cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L de extrato de levedura de bacto</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>15 g/L Ágar-ágar purificado</td><td>Merck</td><td>1.01614.5007</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; g/mL Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>10 g/L Bacto-triptona</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Para preparação de meio Luria Bertani (LB) (20 mL).</td></tr><tr><td>10 g/L de cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td></td></tr><tr><td>5 g/L de extrato de levedura de bacto</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>50 &micro; g/mL Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>12 g/L Bacto-triptona</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>211705</td><td>Para preparação de meios de caldo fantástico (TB) (1 L).</td></tr><tr><td>24 g/L de extrato de Bacto-Levedura</td><td>BD Bioscience&nbsp;</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>4% (v/v) Glicerol anidro</td><td>Bio-Lab</td><td>7120501</td><td></td></tr><tr><td>2.32 g/L K2HPO4</td><td>Spectrum químico</td><td>P1383</td><td></td></tr><tr><td>12.54 g/L KH2PO4</td><td>Spectrum químico</td><td>P1380</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 50 &micro; g/mL de Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Solução-mãe de 100 mM de Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)&nbsp;</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td><td>Filtrado usando 0.2 &micro; m filtro de seringa hidrofílico PVDF.</td></tr><tr><td>Solução-mãe de ditiotreitol (TDT) 0,1 M</td><td>TCI</td><td>D1071</td><td>Filtrado usando 0.2 &micro; m filtro de seringa hidrofílico PVDF.</td></tr><tr><td>10 mM Tris-acetato em pH = 7,4</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Tampão lisado S30 (1,5 L)</td></tr><tr><td>14 mM acetato de magnésio</td><td>Merck</td><td>1,05819,0250</td><td></td></tr><tr><td>60 mM acetato de potássio</td><td>Carlo Erba</td><td>470147</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>TCI</td><td>D1071</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL/L 2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento necessário para a etapa 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mL frascos Erlenmeyer esterilizados</td><td>Thermo Scientific</td><td>50-154-2846</td><td>2 frascos</td></tr><tr><td>2 L frascos Erlenmeyer esterilizados com defletores</td><td>KIMAX-KIMBLE</td><td>25630</td><td>2 frascos</td></tr><tr><td>Agitador de piso</td><td>MRC</td><td>TOU-120-2</td><td>Incubadora agitadora de laboratório 450x450mm, 400rpm, 70 &deg; C</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003340) - Fiberlite F10-6 x 100 LEX Rotor de ângulo fixo. Deve permitir pelo menos 13.000 x g.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; * Pré-resfriado a 4 °C.</td></tr><tr><td>Homogeneizador de alta pressão</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Pré-resfriado a 4 °C.</td></tr><tr><td>-80oC freezer</td><td>SO-LOW</td><td>U85-18</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>De preferência pré-resfriado a -20 °C.</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>TECAN</td><td>IN-MNANO</td><td>Infinite M200 pro</td></tr><tr><td>Placa transparente de 96 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro graduado esterilizado</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga esterilizados</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>De preferência pré-resfriado a -20 °C.</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta esterilizadas</td><td>Corning</td><td></td><td>De preferência pré-resfriado a -20 °C.</td></tr><tr><td>Balde de gelo picado</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Tanque pequeno de nitrogênio líquido</td><td>NALGENE</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>B. Reagentes necessários para a etapa 3 (lipídios na preparação da solução oleosa):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC)</td><td>Lipoid</td><td>556400</td><td>Colesterol em pó</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td> em pó <td>Bio-Lab</td><td>3082301</td><td></td></tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td>Óleo leve</td></tr><tr><td><forte>Equipamento necessário para a etapa 2< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Indústrias científicas</td><td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de aquecimento</td><td>TECHNE</td><td>FDB03AD</td><td>Pré-aquecido a 80 °C. Deve permitir temperatura controlada.&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos de vidro com gargalo de rosca de 2 mL</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>VT009M-1232</td><td>Para uma escala maior, use falcões de 50 mL e evapore o clorofórmio usando o evaporador rotativo.</td></tr><tr><td>Tampa de Rosca de 9mm</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>C395R-09LC</td><td></td></tr><<tr><td>strong>C. Reagentes necessários para a etapa 3 (misturas de reação interna e de alimentação):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Spectrum</td><td>H1089</td><td>1 M HEPES-KOH (pH = 8) - tampão de pH</td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio (KOH)</td><td>Frutarom</td><td>55290</td><td></td></tr><tr><td>1 M Acetato de magnésio</td><td>Merck</td><td>1.05819.0250</td><td>Cofator e estabilizador de carga negativa.</td></tr><tr><td>1 M Acetato de potássio</td><td>Carlo Erba</td><td>470147</td><td>Estabilizador de carga negativa.</td></tr><tr><td>5.2 M Acetato de amônio</td><td>Merck</td><td>1.01116.1000</td><td>Estabiliza a carga negativa.</td></tr><tr><td>50% (p/v) Polietilenoglicol 6000 (PEG)</td><td>Merck</td><td>8.07491.1000</td><td>Aumenta a concentração das macromoléculas.</td></tr><tr><td>0,5 M 3-fosfoglicerato (3-PGA)</td><td>Sigma</td><td>P8877</td><td>Fonte de energia secundária.</td></tr><tr><td>Mistura de aminoácidos 50 mM I</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>Aditivo de aminoácidos. Contém: 50 mM de cada um dos seguintes 17&nbsp; aminoácidos naturais - alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, prolina, serina, treonina e valina.</td></tr><tr><td>50 mM Mistura de aminoácidos II</td><td>Sigma</td><td>LAA21-1KT</td><td>Aditivo de aminoácidos. Contém: 50 mM de cada um dos 3 aminoácidos naturais a seguir - triptofano, fenilalanina e tirosina.</td></tr><tr><td>100 mM Trifosfato de adenina (ATP)</td> <td>Sigma</td><td>A3377</td><td>Nucleotídeos e fonte de energia.</td></tr><tr><td>50 mM Trifosfato de guanidina (GTP)</td> <td>Sigma</td><td>G8877</td><td>Nucleotídeos e fonte de energia.</td></tr><tr><td>100 mM Trifosfato de uridina (UTP)</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>226310010</td><td>Aditivo de nucleotídeos.</td></tr><tr><td>100 mM Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG)</td><td>INALCO</td><td>INA-1758-1400</td><td>Indução da expressão de genes.</td></tr><tr><td>2 M Sacarose</td><td>J.T. Baker</td><td>1933078</td><td>Gerando um gradiente de densidade.</td></tr><tr><td>2 M Glicose</td><td>Sigma</td><td>16301</td><td>Gerando um gradiente de densidade.</td></tr><tr><td>H2O Água UltraPura (UPW)</td><td>Bio-Lab</td><td>2321777500</td><td>DNase & Lisado</td></tr><tr><td>S30-T7</td> livre de RNase<td>_</td><td>_</td><td>Preparado na etapa 1.&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Fonte de transcrição e componentes de tradução. Armazenar em -80 &deg; c, descongele no gelo acidentado logo antes do uso.&nbsp;</td></tr><tr><td>Estoque de plasmídeo de DNA de escolha</td><td>_</td><td>_</td><td>Contém a sequência para a proteína solicitada. Sob promotor T7</td></tr><tr><td>D. Equipamento necessário para a etapa 4 (preparação de células sintéticas)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubadora de piso ou Thermomixer</td><td>MRC</td><td>TOU-120-2</td><td>Incubadora agitadora de laboratório 450x450mm, 400rpm, 70 &deg; C</td></tr><tr><td>PHMT Grant Bio&nbsp;</td>Centrífuga <td>Thermomixer</td><td></td> <td>PSC18</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>75004270</td><td>(75003629) - TX-400 4 x 400mL Rotor de Balde Oscilante. Adequado para tubos de 15 mL. Preferencialmente baldes oscilantes. Deve permitir pelo menos 1000 x g. Pré-resfriado a 4 °C.</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td>(75003424) - rotor de 24 x 1,5/2,0mL com ClickSeal. Adequado para frascos Eppendorf. Pré-resfriado a 4 °C.</td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Scientific industries</td><td>SI-0256</td><td></td></tr><tr><td>Balde de gelo picado</td><td>Bel-Art</td><td>M18848-4001</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de vidro com gargalo de rosca de 2 mL</td><td>CSI Analytical Innovations</td><td>VT009M-1232</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico estéreis de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico esterilizados de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta esterilizadas</td><td>Corning</td><td></td><td>Esterilizado por autoclave.</td></tr></tbody></table>

preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

A abordagem de montagem de baixo para cima para a construção de células sintéticas é uma ferramenta eficaz para isolar e investigar processos celulares em um ambiente de imitação celular. Além disso, o desenvolvimento de sistemas de expressão livre de células demonstrou a capacidade de reconstituir os processos de produção, transcrição e tradução de proteínas (DNA→RNA→protein) de forma controlada, aproveitando a biologia sintética. Aqui descrevemos um protocolo para preparar um sistema de expressão livre de células, incluindo a produção de um potente lisato bacteriano e encapsulamento deste lisato dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUVs) ricas em colesterol( ou seja, lipossomos estáveis), para formar células sintéticas. O protocolo descreve os métodos para a preparação dos componentes das células sintéticas, incluindo a produção de lisatos bacterianos ativos, seguido de uma preparação detalhada passo a passo das células sintéticas com base em um método de transferência de emulsão de água em óleo. Estes facilitam a produção de milhões de células sintéticas de forma simples e acessível, com alta versatilidade para a produção de diferentes tipos de proteínas. As células sintéticas obtidas podem ser utilizadas para investigar a produção e a atividade de proteína/RNA em um ambiente isolado, em evolução direcionada, e também como uma plataforma controlada de entrega de medicamentos para produção sob demanda de proteínas terapêuticas dentro do corpo.

Apresentamos um protocolo para a preparação de células sintéticas encapsulando um sistema CFPS S30-T7 baseado em BL21 E. coli dentro de vesículas lipídicas. Uma descrição esquemmática do processo de preparação que inclui uma imagem de cada etapa é apresentada na Figura 2. O sucesso do processo de preparação de células sintéticas depende do desempenho adequado de cada etapa e efetuado por diferentes parâmetros. O protocolo deve ser ajustado para acomodar a produção de uma proteína es...

Este protocolo descreve o método, materiais, equipamentos e etapas para a preparação de baixo para cima de RNA e proteína susceptíveis de produzir células sintéticas. O compartimento aquoso interno das células sintéticas continha o lisato bacteriano S30 encapsulado dentro de uma bicamada lipídica (ou seja, lipossomos estáveis), utilizando um método de transferência de emulsão de água no óleo.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

As células sintéticas produtoras de proteínas oferecem uma plataforma versátil para estudar as origens da vida, bem como terapias baseadas em células sintéticas para a entrega avançada de medicamentos. Este método é simples e acessível para RNA e expressão proteica e pode ser aplicado para a produção de proteína terapêutica no local diretamente dentro do corpo. Os sistemas podem ser usados para o tratamento de uma ampla gama de doenças, desde doenças metabólicas e reposições proteicas ao câncer e possivelmente diabetes.Este protocolo de várias etapas tem um ponto de parada definido. Ao realizá-lo pela primeira vez, recomenda-se dividir o trabalho ao longo de vários dias. O protocolo para produção de células sintéticas começa com a preparação do lise S30-T7 livre de células.Em seguida, os lipídios de membrana e a solução de nutrientes celulares são preparados para simular o ambiente interno e apoiar a produção de proteínas. O passo final é a preparação das próprias células sintéticas. Prepare culturas de partida duplicadas em frascos de 100 mililitros Erlenmeyer.A cada frasco, adicione cinco mililitros de mídia LB complementados com 50 microgramas por mililitro de ampicillina e inoculados com uma única colônia de E.coli. Cresça a cultura durante a noite em um agitador de incubadora de piso a 250 rpm e 37 graus Celsius. Em seguida, prepare dois frascos erlenmeyer perplexos contendo 500 mililitros de mídia de TB complementados com 50 microgramas por mililitro de ampicillina.Inocular cada frasco de dois litros com uma cultura inicial de cinco mililitros. Coloque os frascos em um shaker a 250 rpm e 37 graus Celsius. Monitore as culturas periodicamente usando um espectrofotômetro e cresça as culturas até OD600 entre 0,8 e um.Para induzir a expressão de polimerase T7 RNA, adicione a cada frasco três mililitros de 100 mililitros IPTG para atingir 0,6 milimerlar. Continue crescendo as culturas até que OD600 seja aproximadamente quatro. Depois que as culturas atingirem a densidade óptica desejada, transfira a suspensão de cada frasco de Erlenmeyer em dois tubos de centrífuga esterilizados de 250 mililitros.Centrifugar os tubos a 7.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernaspeso. Resuspenda cada pelota em 250 mililitros de tampão de lise S30 frio usando um agitador, se desejar.Centrifugar a 7.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernasciente e resuspenque todas as pelotas juntas em 15 mililitros de tampão de lise S30 frio. Filtre a suspensão usando gaze pads.Antes de prosseguir para a próxima etapa, pré-torne as pontas em frascos de 1,5 mililitro que serão necessários para armazenar o lysate. Homogeneize a suspensão duas vezes. Use uma pressão de trabalho de 15.000 PSI com uma pressão de ar de quatro barras para quebra de células.Recolher o homogeneizar. Adicione 100 microliters de 0,1 molar DTT por 10 mililitros da suspensão homogeneizada. Centrifugar a suspensão a 24.700 vezes g a 30 minutos a quatro graus Celsius.DTT e clorofórmio são classificados como irritantes e prejudiciais e, portanto, devem ser tratados com cuidado. O clorofórmio usado mais tarde no protocolo deve ser usado em uma área com extração de fumaça. Para preservar a atividade de lise, realize o passo rapidamente.Coloque 200 alíquotas de microliter de supernascer em frascos pré-resfriados e congele-os imediatamente com nitrogênio líquido. Armazene os frascos a 80 graus Celsius negativos para uso futuro. Dissolver separadamente POPC e colesterol em clorofórmio cada um para uma concentração final de 100 miligramas por mililitro.Vórtice cada frasco separadamente. Combine os componentes em um frasco de vidro de dois mililitros. Adicione 50 microliters da solução de clorofórmio de colesterol, 50 microlitadores da solução POPC-clorofórmio e 500 microliters de óleo mineral.Vórtice do frasco, depois para evaporar o clorofórmio, aqueça-o por cerca de uma hora a 80 graus Celsius em uma capa química. Antes de iniciar a fase de produção de células sintéticas, prepare as soluções externas, pré-internas e de alimentação, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, coloque 1,2 mililitros da solução externa em um tubo de 15 mililitros e adicione lentamente uma camada de 500 microliters de solução lipídica em óleo a partir do primeiro frasco de vidro.Incubar o tubo em temperatura ambiente por 20 minutos. Para finalizar a preparação da solução interna, misture o gelo a um volume final de 100 microliters adicionando lysate S30-T7 e plasmídeo de DNA. Adicione 100 microliters da solução interna com liseto e plasmídeo ao segundo frasco de vidro de dois mililitros com 500 microliters de solução lipídica em óleo.Pipeta para cima e para baixo vigorosamente por um minuto e, em seguida, vórtice por mais um minuto no nível cinco. Depois de incubar a emulsão resultante por 10 minutos em gelo esmagado, adicione lentamente a emulsão em cima da fase do óleo no tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo por 10 minutos a 100 vezes g e quatro graus Celsius.Em seguida, centrífuga por 10 minutos a 400 vezes g e quatro graus Celsius. No final da centrifugação, uma pelota deve ser observável na parte inferior do tubo. Para extrair a pelota, primeiro remova a camada de óleo em excesso.Em seguida, carregue uma ponta de pipeta aparada com aproximadamente 400 microlitros de solução externa e use a ponta da pipeta para coletar a pelota, liberando a solução externa à medida que a ponta da pipeta passa pela fase do óleo. Limpe a ponta da pipeta e transfira a pelota para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Centrifugar a pelota por 10 minutos a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius.Remova o supernatante e resuspenja a pelota em 100 microliters de solução alimentar. Para expressão proteica, incubar a suspensão por duas horas a 37 graus Celsius sem tremer. Plasmids expressando o modelo de proteína sfGFP e renilla luciferase foram introduzidos na síntese proteica livre de células, reações em massa cfps e células sintéticas.A produção de proteínas foi avaliada utilizando vários métodos. A análise de manchas ocidentais detectou a produção de sfGFP His6 tanto em reações a granel cfps quanto dentro de células sintéticas. O sfGFP His6 purificado foi usado como controle positivo.Um microscópio fluorescente com um Brightfield e um filtro GFP mostram células sintéticas que estão produzindo sfGFP. A citometria de fluxo foi utilizada para analisar células sintéticas produtoras de sfGFP. O cálculo da população de células sintéticas ativas baseou-se no limiar de intensidade de fluorescência sfGFP definido pela amostra de DNA negativo representada pelo histograma vermelho.A intensidade média de fluorescência das células sintéticas produtoras de sfGFP foi calculada a partir da população de células sintéticas ativas e normalizada para a amostra de DNA negativo. As distribuições de diâmetro das células sintéticas ativas foram calculadas com base no sinal sfGFP. A atividade de renilla luciferase foi quantificada com medidas de luminescência.Este método é altamente versátil e pode ser otimizado para diferentes proteínas-alvo alterando a origem do lysate, a composição lipídica e as concentrações de soluções internas. A análise FACS de células sintéticas que produzem uma proteína marcadora fluorescente poderia ser realizada para fornecer valor quantitativo da fração de células sintéticas ativas. A análise da mancha ocidental mediria a produção de proteínas.

preparing-protein-producing-synthetic-cells-using-cell-free-bacterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Wiegand, D. J., et al. Expressão de proteína livre de células usando a bactéria de crescimento rápido Vibrio natriegens. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o uso de um sistema de expressão de proteínas livres de células bacterianas baseado em lisado bruto de Vibrio natriegens para realizar transcrição e tradução in vitro acopladas. Ele destaca a preparação de uma mistura mestre com componentes essenciais e a síntese passo a passo de proteínas funcionais a partir de um molde de DNA.

Expressão de proteína livre de células usando um extrato de células brutas bacterianas

Este protocolo de cinco dias descreve todos os passos, equipamentos e software suplementar necessário para a criação e execução de um Escherichia coli endógena eficiente baseado TX-TL livre de células sistema de expressão a partir do zero. Com reagentes, o protocolo leva 8 horas ou menos para configurar uma reação, coletar e processar dados.

Protocolos para implementação de uma Escherichia coli Com base TX-TL Expression System-Free Cell para Biologia Sintética

Descrevemos um procedimento simples de litografia para a imobilização de moléculas de DNA do gene-comprimento sobre uma superfície, que pode ser usada para realizar experiências de expressão do gene sem célula em biochips.

Superfície-imobilização funcional dos Genes usando várias etapas Strand deslocamento litografia

Este protocolo detalha as etapas, custos e equipamentos necessários para gerar Escherichia coli-com base em extratos de células e implementar em vitro reações de síntese de proteínas dentro de 4 dias ou menos. Para aproveitar a natureza flexível desta plataforma para aplicações de amplas, podemos discutir as condições de reação que podem ser adaptadas e otimizadas.

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Este protocolo descreve um método eficiente livre de células para a produção de proteolipossomo de alta qualidade pelo método de diálise de duas camadas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. Este método fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

Este protocolo descreve um método rápido e simples para produzir lisenato bacteriano para expressão genética livre de células, usando uma cepa projetada de Escherichia coli e exigindo apenas equipamentos de laboratório padrão.

Produção rápida, acessível e descomplicada de lysate sem células bacterianas

Este trabalho descreve a preparação do extrato celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em menos de 24 horas. Explicação do protocolo de autoindução automática livre de células (CFAI) detalha melhorias feitas para reduzir a supervisão dos pesquisadores e aumentar as quantidades de extrato celular obtidos.

De células à síntese de proteínas livres de células dentro de 24 horas usando fluxo de trabalho de autoindução sem células

Apresenta-se aqui um protocolo para a preparação e calibração tampão de extratos celulares de cepas knockout de exonuclease V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD e ΔrecB). Esta é uma abordagem rápida, fácil e direta para a expressão em sistemas de síntese de proteínas livres de células usando modelos lineares de DNA.

Síntese de proteínas livres de células a partir de extratos celulares deficientes em exonicordes utilizando modelos lineares de DNA

O presente protocolo descreve um método detalhado para a produção bacteriana de proteínas recombinantes, incluindo proteínas tipicamente insolúveis ou contendo ligação dissulfeto, embaladas dentro de vesículas ligadas à membrana extracelular. Isso tem potencial para ser aplicado a áreas versáteis da pesquisa científica, incluindo biotecnologia aplicada e medicina.

Produção e análise otimizadas de vesículas cheias de proteína recombinante de E. coli

Este protocolo descreve o sistema de Síntese de Proteínas Livres de Células (CFPS) usado na construção de células sintéticas. Ele descreve os principais estágios com resultados representativos em diferentes microcompartimentos. O protocolo visa estabelecer as melhores práticas para diversos laboratórios na comunidade de células sintéticas, promovendo o progresso no desenvolvimento de células sintéticas.

Sistema de síntese de proteínas livres de células para a construção de células sintéticas

Aprenda a preparar células sintéticas produtoras de proteínas usando lisados bacterianos livres de células, lipossomos e transferência de emulsão. Este método versátil permite a produção terapêutica de proteínas no local para aplicações em biotecnologia.

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão (Vídeo) | JoVE Journal

Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

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