Preparando proteínas que produzem células sintéticas usando extratos bacterianos livres de células, liposomos e transferência de emulsão

As células sintéticas produtoras de proteínas oferecem uma plataforma versátil para estudar as origens da vida, bem como terapias baseadas em células sintéticas para a entrega avançada de medicamentos. Este método é simples e acessível para RNA e expressão proteica e pode ser aplicado para a produção de proteína terapêutica no local diretamente dentro do corpo. Os sistemas podem ser usados para o tratamento de uma ampla gama de doenças, desde doenças metabólicas e reposições proteicas ao câncer e possivelmente diabetes.

Este protocolo de várias etapas tem um ponto de parada definido. Ao realizá-lo pela primeira vez, recomenda-se dividir o trabalho ao longo de vários dias. O protocolo para produção de células sintéticas começa com a preparação do lise S30-T7 livre de células.

Em seguida, os lipídios de membrana e a solução de nutrientes celulares são preparados para simular o ambiente interno e apoiar a produção de proteínas. O passo final é a preparação das próprias células sintéticas. Prepare culturas de partida duplicadas em frascos de 100 mililitros Erlenmeyer.

A cada frasco, adicione cinco mililitros de mídia LB complementados com 50 microgramas por mililitro de ampicillina e inoculados com uma única colônia de E.coli. Cresça a cultura durante a noite em um agitador de incubadora de piso a 250 rpm e 37 graus Celsius. Em seguida, prepare dois frascos erlenmeyer perplexos contendo 500 mililitros de mídia de TB complementados com 50 microgramas por mililitro de ampicillina.

Inocular cada frasco de dois litros com uma cultura inicial de cinco mililitros. Coloque os frascos em um shaker a 250 rpm e 37 graus Celsius. Monitore as culturas periodicamente usando um espectrofotômetro e cresça as culturas até OD600 entre 0,8 e um.

Para induzir a expressão de polimerase T7 RNA, adicione a cada frasco três mililitros de 100 mililitros IPTG para atingir 0,6 milimerlar. Continue crescendo as culturas até que OD600 seja aproximadamente quatro. Depois que as culturas atingirem a densidade óptica desejada, transfira a suspensão de cada frasco de Erlenmeyer em dois tubos de centrífuga esterilizados de 250 mililitros.

Centrifugar os tubos a 7.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernaspeso. Resuspenda cada pelota em 250 mililitros de tampão de lise S30 frio usando um agitador, se desejar.

Centrifugar a 7.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernasciente e resuspenque todas as pelotas juntas em 15 mililitros de tampão de lise S30 frio. Filtre a suspensão usando gaze pads.

Antes de prosseguir para a próxima etapa, pré-torne as pontas em frascos de 1,5 mililitro que serão necessários para armazenar o lysate. Homogeneize a suspensão duas vezes. Use uma pressão de trabalho de 15.000 PSI com uma pressão de ar de quatro barras para quebra de células.

Recolher o homogeneizar. Adicione 100 microliters de 0,1 molar DTT por 10 mililitros da suspensão homogeneizada. Centrifugar a suspensão a 24.700 vezes g a 30 minutos a quatro graus Celsius.

DTT e clorofórmio são classificados como irritantes e prejudiciais e, portanto, devem ser tratados com cuidado. O clorofórmio usado mais tarde no protocolo deve ser usado em uma área com extração de fumaça. Para preservar a atividade de lise, realize o passo rapidamente.

Coloque 200 alíquotas de microliter de supernascer em frascos pré-resfriados e congele-os imediatamente com nitrogênio líquido. Armazene os frascos a 80 graus Celsius negativos para uso futuro. Dissolver separadamente POPC e colesterol em clorofórmio cada um para uma concentração final de 100 miligramas por mililitro.

Vórtice cada frasco separadamente. Combine os componentes em um frasco de vidro de dois mililitros. Adicione 50 microliters da solução de clorofórmio de colesterol, 50 microlitadores da solução POPC-clorofórmio e 500 microliters de óleo mineral.

Vórtice do frasco, depois para evaporar o clorofórmio, aqueça-o por cerca de uma hora a 80 graus Celsius em uma capa química. Antes de iniciar a fase de produção de células sintéticas, prepare as soluções externas, pré-internas e de alimentação, conforme descrito no manuscrito. Em seguida, coloque 1,2 mililitros da solução externa em um tubo de 15 mililitros e adicione lentamente uma camada de 500 microliters de solução lipídica em óleo a partir do primeiro frasco de vidro.

Incubar o tubo em temperatura ambiente por 20 minutos. Para finalizar a preparação da solução interna, misture o gelo a um volume final de 100 microliters adicionando lysate S30-T7 e plasmídeo de DNA. Adicione 100 microliters da solução interna com liseto e plasmídeo ao segundo frasco de vidro de dois mililitros com 500 microliters de solução lipídica em óleo.

Pipeta para cima e para baixo vigorosamente por um minuto e, em seguida, vórtice por mais um minuto no nível cinco. Depois de incubar a emulsão resultante por 10 minutos em gelo esmagado, adicione lentamente a emulsão em cima da fase do óleo no tubo de 15 mililitros. Centrifugar o tubo por 10 minutos a 100 vezes g e quatro graus Celsius.

Em seguida, centrífuga por 10 minutos a 400 vezes g e quatro graus Celsius. No final da centrifugação, uma pelota deve ser observável na parte inferior do tubo. Para extrair a pelota, primeiro remova a camada de óleo em excesso.

Em seguida, carregue uma ponta de pipeta aparada com aproximadamente 400 microlitros de solução externa e use a ponta da pipeta para coletar a pelota, liberando a solução externa à medida que a ponta da pipeta passa pela fase do óleo. Limpe a ponta da pipeta e transfira a pelota para um tubo limpo de 1,5 mililitro. Centrifugar a pelota por 10 minutos a 1.000 vezes g e quatro graus Celsius.

Remova o supernatante e resuspenja a pelota em 100 microliters de solução alimentar. Para expressão proteica, incubar a suspensão por duas horas a 37 graus Celsius sem tremer. Plasmids expressando o modelo de proteína sfGFP e renilla luciferase foram introduzidos na síntese proteica livre de células, reações em massa cfps e células sintéticas.

A produção de proteínas foi avaliada utilizando vários métodos. A análise de manchas ocidentais detectou a produção de sfGFP His6 tanto em reações a granel cfps quanto dentro de células sintéticas. O sfGFP His6 purificado foi usado como controle positivo.

Um microscópio fluorescente com um Brightfield e um filtro GFP mostram células sintéticas que estão produzindo sfGFP. A citometria de fluxo foi utilizada para analisar células sintéticas produtoras de sfGFP. O cálculo da população de células sintéticas ativas baseou-se no limiar de intensidade de fluorescência sfGFP definido pela amostra de DNA negativo representada pelo histograma vermelho.

A intensidade média de fluorescência das células sintéticas produtoras de sfGFP foi calculada a partir da população de células sintéticas ativas e normalizada para a amostra de DNA negativo. As distribuições de diâmetro das células sintéticas ativas foram calculadas com base no sinal sfGFP. A atividade de renilla luciferase foi quantificada com medidas de luminescência.

Este método é altamente versátil e pode ser otimizado para diferentes proteínas-alvo alterando a origem do lysate, a composição lipídica e as concentrações de soluções internas. A análise FACS de células sintéticas que produzem uma proteína marcadora fluorescente poderia ser realizada para fornecer valor quantitativo da fração de células sintéticas ativas. A análise da mancha ocidental mediria a produção de proteínas.