Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

Com a TRAP, podemos investigar o processamento do desenvolvimento na resolução celular. Usamos promotores específicos do tipo celular para conduzir uma sub-unidade ribossômica marcada, e a partir daí podemos isolar o RNA polissário. Este protocolo produz RNA de alta qualidade, mas em quantidades muito limitadas, portanto, métodos especializados para entrada ultra-baixa são necessários para produzir bibliotecas de RNA de alta qualidade.

O TRAP é uma ferramenta ideal para a pesquisa de plantas, pois muitos processos de desenvolvimento dependem de vias de sinalização mecânica e relacionadas à parede celular. Usamos o TRAP para estudar a comunicação celular-célula na formação lateral de raízes. Como obter RNA de boa qualidade provou não ser tão direto quanto esperávamos, esperamos que esta instrução de vídeo passo a passo aumente a aplicabilidade do TRAP e ajude a promover essa técnica poderosa.

Para esterilizar as linhas homozigos propagadas, espalhe menos de 300 microliters de sementes uniformemente em placas de Petri de 12 por 12 centímetros quadrados, e empilhe as placas em um dessecador de 60 litros. Após a esterilização de gás durante a noite, deixe o gás evaporar antes de coletar as sementes em um tubo de armazenamento de 50 mililitros. Antes de emplacar, diluir as sementes esterilizadas com 0,1% de ágar para obter um mililitro de mistura de sementes imbibed por placa.

Para emplacar a mistura de sementes, use tampas quadradas de placa de Petri para criar um suporte de modelo laminado para o plantio de três fileiras de sementes por prato, e coloque placas de ágar vazias no porta-modelos. Distribua um mililitro das sementes absorvidas uniformemente em três fileiras de placas. E coloque as placas processadas em pilhas em um fluxo laminar, até que as sementes estejam secas.

Quando as sementes tiverem grudado na superfície do ágar, feche as tampas e sele cada placa com fita micropora. Para o tratamento exógeno das raízes arabidopsis com um agente de interesse, prepare 1,5 a dois centímetros de largura, 10 centímetros de comprimento, tiras de papel de tecido. Mergulhe o papel de tecido em 10 naa micromolar, e use pinças para aplicar uma tira de papel de tecido em cada linha de raízes.

Em seguida, pressione suavemente as bolhas de ar e esvazie o excesso de líquido da placa, antes de rotular a placa com o tempo. No ponto final experimental apropriado, use fórceps para remover cuidadosamente as tiras de papel de tecido de cada placa sem separar as raízes, e use uma lâmina cirúrgica para cortar uma vez por linha ao longo da junção de raiz de ensaio, em um único curso determinado. Use pinças para deslizar ao longo das raízes de cada linha, para coletar as raízes em três feixes.

E esvazie as raízes em um tubo de 50 mililitros cheio de nitrogênio líquido, para congelamento instantâneo. Quando todas as amostras de raiz por tratamento tiverem sido coletadas, decante o excesso de nitrogênio líquido usando a tampa do tubo para evitar que as raízes derramem. E coloque o tubo em um vaso de doer, para um armazenamento de 80 graus celsius.

Para moagem e homogeneização de tecidos, use luvas de algodão sob luvas de laboratório padrão e adicione PMSF ao tampão de extração de pórsome. Esvazie a amostra de tecido em uma argamassa contendo nitrogênio líquido, e use um pilão resfriado para moer cuidadosamente os tecidos até que todo o material apareça como um pó branco. Quando todo o tecido tiver sido moído, adicione cinco mililitros de tampão de extração de polisso à amostra, e misture rapidamente os fragmentos de tecido congelado com o pó antes que o tampão congele.

Assim que a mistura puder ser transferida, esvazie o chorume em um homogeneizador de vidro no gelo, e use mais dois mililitros de tampão de extração de pórsome para enxaguar a argamassa e o pilão. Triture manualmente o chorume até que o extrato fique homogêneo. Em seguida, despeje o extrato de raiz bruta em um tubo de centrífuga de 50 mililitros no gelo, e processe a próxima amostra como demonstrado.

Para a coleta total de RNA, transfira 200 alíquotas de microliter de cada amostra bruta para tubos de microcentrifuge limpos, pré-resfriados e rotulados. Para remover paredes celulares, detritos e grandes organelas, centrifugar as amostras e decantar o supernaente em tubos cônicos frescos e pré-resfriados para uma segunda centrifugação. Enquanto os tubos estão girando, alíquota de 60 microliters de contas magnéticas GFP por amostra, em um tubo de 1,5 mililitro.

E coloque o tubo em um suporte magnético, para facilitar a remoção de supernaspes. Em seguida, lave as contas duas vezes em um mililitro de tampão de lavagem a frio por lavagem, e suspenda novamente as contas em 60 microliters de tampão de lavagem por amostra. Imediatamente após a centrifugação, decante o supernanato limpo em tubos rotulados de 15 mililitros, e adicione 60 microliters de contas lavadas a cada amostra.

Em seguida, coloque todas as amostras horizontalmente em um balde de gelo, para uma incubação de duas horas com balanço. No final da incubação, colete as contas em um suporte magnético no gelo e adicione PMSF ao tampão de extração de polissóis restante. Depois de descartar os supernantes, adicione aproximadamente cinco mililitros de tampão de extração de pórsome às amostras e suspenda as contas dentro das amostras com inclinação suave.

Balance as amostras por 15 minutos no shaker no gelo, seguido por duas lavagens com tampão de lavagem fresco no ímã, como demonstrado. Após a última lavagem, transfira as amostras em um mililitro de tampão de lavagem, em um tubo de 1,5 mililitro. E recolher as contas mais uma vez no suporte magnético, para remover todo o supernatante.

Em seguida, coloque os tubos no gelo até que todas as amostras tenham sido processadas. Para o recondicionamento dos suprimentos de laboratório, primeiro, enxague todo o equipamento nos resíduos químicos. Lave as argamassas, pilões e homogeneizadores com sabão, antes de enxaguar bem cada instrumento.

Em seguida, coloque o equipamento em um recipiente seguro para o calor, e asse os materiais durante a noite a mais de 220 graus celsius. Escove todos os tubos de centrífugas limpos com detergente, antes de colocar os tubos em uma bandeja autoclavevel com uma borda e um capô de fumaça. Despeje um mililitro de pirocarbonato de diethyl líquida e um litro de solução de água deionizada nos tubos por três a 18 horas.

Em seguida, colete a solução antes de esterilizar a bandeja de tubos na autoclave. Aqui, plantas representativas com sinais GFP são mostradas. A contra-coloração com iodeto de propídio marca os contornos da parede celular.

As linhas correspondem ao padrão de localização da endoderme e ao periciclo do polo xilema. Nestas medidas representativas obtidas a partir do RNA polisário, a maioria das amostras apresentou muito pouca degradação, com números de integridade de RNA variando de nove a 10. Nestes gráficos, podem ser observados traços de bibliotecas preparadas com sucesso, destacando a robustez do procedimento, apesar dos volumes de reação reduzidos.

Antes da produção de um conjunto de dados de abrangência de genomas, o TRAP RNA de um experimento piloto pode ser sondado por RTPCR quantitativo para validar o sucesso do tratamento e/ou as condições experimentais, bem como a especificidade do tecido. Nesta análise, o teste de três genes responsivos àuxina confirmou uma indução hormonal bem sucedida após duas horas de tratamento. Perfis genéticos de marcadores específicos de tecido recuperados dos dados de sequenciamento confirmaram a especificidade do tipo celular.

Siga conselhos de boas práticas ao lidar com o RNA. Trabalhe em um banco estéril, limpe seu equipamento com solução de remoção de RNA, use luvas e troque-as imediatamente quando forem contaminadas. Certifique-se de manusear e descartar adequadamente todos os produtos químicos tóxicos e gases que foram usados durante o procedimento, especialmente gás cloro-DEPC e nitrogênio líquido.

No portfólio de estudos omicais, o TRAP ocupa um nicho importante, e já tem sido usado para responder a muitas questões biológicas, especialmente na biologia do desenvolvimento, a TRAP tem um enorme potencial.