Name: Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda microdissecção a laser para isolar regiões específicas de glioma e analisar a expressão diferencial de mRNA. Este método preserva a morfologia tecidual e a integridade do RNA para estudos de heterogeneidade tumoral.

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O trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, (NIH/NINDS) Subsídios: R37-NS094804, R01-NS105556, R21-NS107894 a M.G.C.; (NIH/NINDS) Subsídios R01-NS076991, R01-NS096756, R01-NS082311 a P.R.L.; (NIH/NIBI): R01-EB022563; (NIH/NCI) U01CA224160; o Departamento de Neurocirurgia, O Centro de Câncer rogel na Universidade de Michigan, ChadTough Foundation, e Leah's Happy Hearts Foundation para M.G.C. e P.R.L. RNA Biomedicine Grant F046166 para M.G.C. National Institutes of Health, UL1 TR002240 for Michigan Institute for Clinical and Health Research (MICHR), Postdoctoral Translational Scholars Program (PTSP) grant, Projeto F049768 para A.C. University of Michigan Forbes Cancer Research Institute, um Prêmio Médico-Cientista de Pesquisa para Prevenir a Cegueira, Inc. (RPB), subvenção R01 EY022633 do NEI do NIH (AK), e uma subvenção irrestrita da RPB para o Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais. Esta pesquisa utilizou o Vision Research Core (P30 EY007003) e o Cancer Center Research Core (P30 CA046592). AK é apoiada pelo Prêmio Acadêmico Emergente Mrs. William Davidson do A. Alfred Taubman Medical Research Institute.

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<li>Brat, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive%2C+Integrative+Genomic+Analysis+of+Diffuse+Lower-Grade+Gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).</li>
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</ol>

Todos os autores deste artigo não declaram conflitos potenciais de interesse.

Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à heterogeneidade e invasão do glioma são de importância crítica para descobrir novos alvos terapêuticos13. Neste manuscrito, descrevemos um método detalhado e otimizado para analisar a paisagem molecular da heterogeneidade e invasão de glioma usando microdissecção de captura a laser (LMD) seguida de análise transcritiva.
A microdissecção de captura a laser (DMD) pode ser usada para identificar diferentes áreas ou célula...

Gliomas são os tumores primários mais agressivos do sistema nervoso central. São altamente invasivos e heterogêneos1. A análise dos componentes celulares e moleculares do tumor revelará novos alvos terapêuticos.
Entre os diferentes métodos disponíveis atualmente, a microdissecção de captura a laser (DLM) do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável que permite o isolamento de áreas anatômicas discretas ou populações celulares específicas de tecidos tumorais para estudar seu perfil molecular2,3. O LMD permite a análise de perfis de expressão genética mRNA de células individuais selecionadas ou estruturas multicelulares4,5. O LMD pode ser utilizado para obter conhecimento mecanicista aprofundado sobre os eventos moleculares que ocorrem durante a progressão do tumor. A melhoria no processamento dos tecidos tumorais é necessária para obter a resolução óptica ideal da morfologia tecidual e da qualidade do RNA6. Embora a fixação do paraformaldeído seja a melhor opção para a análise morfológica, a qualidade do RNA é afetada e degradada nessas condições, resultando em má qualidade do RNA para análise de RNA-seq. O uso de seções de tecido congelado evita a formação de cristais de gelo, que poderia quebrar membranas celulares e produzir buracos dentro das células, e continua sendo a melhor opção para a análise de RNA-Seq7.
Aqui, descrevemos um método otimizado de fixação e coloração de seção para processar tecidos tumorais cerebrais congelados para LMD. Para evitar que cristais de gelo se formassem no tecido, perfundamos camundongos com uma solução de 30% de sacarose. Esta solução interrompe as interações entre moléculas de água polar e impede a formação de cristais de gelo, preservando a morfologia tecidual. A coloração tecidual é necessária para diferenciar e obter população específica de células ou áreas anatomicamente distintas dentro do tumor. É essencial fixar e manchar o tecido com corantes inócuos para manter a integridade do RNA. Foi demonstrado anteriormente que o tecido de coloração com hematoxilina/eosina (H&E) deteriora a integridade do RNA8. Corrigimos e manchamos o tecido de juros com etanol, cresyl violeta 4% e eosiny y 0,5% soluções. Cresyl violeta é um corante acidofílico que mancha o núcleo celular com uma cor azul escuro. EosinY é um tine basofílico que mancha componentes básicos das células, proporcionando uma distinção entre citoplasma e outras estruturas celulares8. Ambos os corantes são solúveis em etanol e não deterioram a qualidade do RNA. Para evitar danos teciduais e manter alta resolução óptica das estruturas celulares, montamos as seções teciduais antes do LMD9.

<table><tbody><tr><td>Solução de Desprendimento de Células Accutase</td><td>Biolegend</td><td>423201</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante Livre de Animais EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), sem soro</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Corning Tubos de PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6530</td><td></td></tr><tr><td>Acetato Violeta Cresyl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle Meio: Mistura de Nutrientes F-12</td><td>Gibco</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Microdissecção a Laser (LMD)</td><td>Suplemento Leica</td><td>LMD7000</td><td></td></tr><tr><td>N-2 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Normocin - Reagente Antimicrobiano</td><td>Invivogen</td> Moldes de Embutir <td>Descartáveis Peel Away Ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de</td> Vidro de Membrana <td>Eletrônica Electronics Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>(2 &micro; m)</td> <td>Lieca</td><td>1150518</td><td></td></tr><tr><td>Solução Pontual</td><td>Zymo Research</td><td>D3001-1</td><td></td></tr><tr><td>Humano Recombinante FGF-básico</td><td>Peprotech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pesquisa Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050s</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solução de Descontaminação de RNase</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>SMARTer Kit de RNA-Seq Total Encalhado v2 - Pico Entrada Mammalian</td><td>Takara Bio</td><td>634411</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissecção de captura a laser de sub-regiões de glioma para caracterização espacial e molecular da heterogeneidade intratumoral, oncostreams e invasão

Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion

Gliomas são tumores cerebrais primários caracterizados por sua invasividade e heterogeneidade. Padrões histológicos específicos como pseudopalisades, proliferação microvascular, transformação mesenquimal e necrose caracterizam a heterogeneidade histológica de gliomas de alto grau. Nosso laboratório demonstrou que a presença de altas densidades de células mesenquimais, denominadas oncostreams, se correlacionam com a malignidade tumoral. Desenvolvemos uma abordagem única para entender os mecanismos que estão por trás do crescimento e da invasão de Glioma. Aqui, descrevemos um protocolo abrangente que utiliza microdissecção de captura a laser (LMD) e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial de mRNA de estruturas multicelulares heterogêneas intratumorais (ou seja, áreas mesenquimais ou áreas de invasão de tumor). Este método mantém boa histologia tecidual e integridade do RNA. Perfusão, congelamento, incorporação, secção e coloração foram otimizadas para preservar a morfologia e obter amostras de microdissecção a laser de alta qualidade. Os resultados indicam que a perfusão de camundongos portadores de glioma usando 30% de sacarose fornece boa morfologia e qualidade de RNA. Além disso, as seções de tumor de coloração com 4% de cresípia violeta e 0,5% de eosina resultam em boa coloração nuclear e celular, preservando a integridade do RNA. O método descrito é sensível e altamente reprodutível e pode ser utilizado para estudar a morfologia tumoral em vários modelos tumorais. Em resumo, descrevemos um método completo para realizar ODL que preserva a morfologia e a qualidade do RNA para sequenciamento para estudar as características moleculares de estruturas multicelulares heterogêneas dentro de tumores sólidos.

Nosso laboratório gerou um modelo de rato geneticamente modificado (GEMMs) usando o sistema de transposase da beleza adormecida (Figura 1A). Este sistema incorpora alterações genéticas específicas no genoma de células progenitoras neurais em camundongos neonatais. Estas células progenitoras alteradas formam tumores de glioma endógenos. As sequências plasmáticas utilizadas para gerar os tumores foram: (1) pT2C-LucPGK-SB100X para Transposon &am...

A microdissecção a laser (LMD) é uma técnica sensível e altamente reprodutível que pode ser usada para descobrir caminhos que mediam a heterogeneidade e invasão do glioma. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para isolar áreas discretas do tecido glioma usando LMD a laser seguido de análise transcritiva.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

Gliomas are primary brain tumors characterized by their invasiveness and heterogeneity. Specific histological patterns such as pseudopalisades, ...

Este protocolo utiliza microdissecção a laser e sequenciamento de RNA para analisar a expressão diferencial mRNA da heterogeneidade intratumor, como áreas de acúmulo de células mesenquimais ou áreas de invasão tumoral. Este método foi otimizado para preservar a histologia tecidual de boa qualidade e a integridade do RNA para facilitar a aquisição de amostras de microdisseção a laser de alta qualidade. Este método é sensível e altamente reprodutível.Pode ser utilizado para estudar morfologia tumoral e heterogeneidade em vários modelos tumorais. A microdisseção a laser do tecido tumoral cerebral congelado é uma técnica econômica e confiável para o isolamento de áreas anatômicas discretas de populações celulares de tecidos tumorais para estudar seus perfis moleculares. A LMD pode ser utilizada para obter conhecimento mecanicista aprofundado sobre os eventos moleculares que ocorrem durante a progressão do tumor, e pode revelar novos alvos terapêuticos.Uma bioluminescência in vivo da carga tumoral do camundongo atinge um sinal entre uma vez 10 a seis e uma vezes 10 para o 7º fótons. Flush solução de tirana oxigenada através do sistema circulatório do rato portador de tumor eutanizado até que o fígado e pulmões tenham sido completamente limpos de sangue. Continue perfundando o animal com solução de 30% de sacarose dissolvida em solução de tyrode por mais 15 minutos.Para avaliar o sucesso da perfusão, confirme que o pescoço, cauda e pernas são rígidos no final da circulação. Em seguida, colher o cérebro de acordo com os protocolos padrão e armazenar o cérebro durante a noite em solução fresca de 30% de sacarose. Para se preparar para a criopreservação, encha um frasco com isopentane fria-2-metilbutano e coloque o frasco em um recipiente cheio de nitrogênio líquido.Enquanto o solvente está esfriando, borre o cérebro seco em um pedaço de papel filtro e coloque o cérebro em um Cryomold rotulado. Cuidadosamente em aproximadamente cinco mililitros de temperatura ideal cortando médio para o centro do Cryomold e colocar o cérebro no molde na orientação desejada. Usando fórceps limpos, coloque rapidamente o Cryomold na isopentane-2-metilbutano refrigerado por 30 a 40 segundos.Uma vez que o meio de corte tenha se solidificado, transfira o Cryomold para gelo seco e enrole o tecido cerebral congelado cryomold e encaixe tecido cerebral congelado em papel alumínio para menos 80 graus Celsius de armazenamento. Para adquirir seções congeladas de tecido tumoral cerebral, primeiro defina a temperatura de um criostat entre menos 20 e menos 24 graus Celsius, e coloque o bloco amostral na câmara criostat por 30 a 60 minutos. Enquanto a amostra estiver equilibrando, limpe a câmara e o porta-faca com 100% de etanol e pulverize os pincéis da seção com solução de limpeza RNase.Quando a amostra estiver pronta, remova o molde e use meio de corte fresco para anexar o bloco de tecido congelado ao disco de espécime do criostat. Coloque o bloco no suporte do disco e alinhe o bloco com a lâmina da faca. Adquira 10 seções de micrômetros do cérebro usando um dos pincéis livres de Rnase para achatar cuidadosamente e desenrolar os pedaços de tecido na superfície de corte.Para montar as seções de tecido cerebral nas lâminas, pressione suavemente o lado carregado positivamente de um deslizamento de vidro PEN sem RNase rotulado sobre a seção e coloque o slide em uma caixa de armazenamento dentro da câmara. Quando todos os slides tiverem sido coletados, coloque a caixa de armazenamento a menos 80 graus Celsius. Para dissolver o meio de corte antes da micro dissecção a laser, submergir os slides em imersões sequenciais de etanol descendente de 30 segundos seguidas por coloração de solução violeta cristalina por 20 segundos e cinco segundos em solução 0,5% eosina Y.No final da incubação eosin Y, use papel filtro para bloquear os slides secos e desidratar os slides em imersões sequenciais ascendentes de etanol. Após a imersão de etanol de 60 segundos, enxágue os slides em um recipiente de xileno por três minutos. Em seguida, seque as lâminas na superfície livre de RNase à temperatura ambiente por 10 segundos antes de montar as amostras em meio de montagem preparado com água livre de RNase.Após 10 a 20 segundos, transfira os slides para a plataforma de microdisseção do microscópio. Para microdisseção de captura a laser, ligue a energia antes de ligar o laser. Em seguida, ligue o controlador de microscópio no computador e inicie o software de microdisseção de captura a laser.No painel Controle do Microscópio, selecione a ampliação de 10 vezes. Sob controle a laser, defina os parâmetros laser para dissecção tecidual e selecione uma frequência laser de 120 hertz e uma corrente laser de 100% Para microdisseção a laser precisa, defina a velocidade para 10 e defina a abertura para 10 micrômetros. Em seguida, afina a energia para 53.Carregue o coletor de tecido que capturará o tecido após a seção e clique no segundo botão Descarregar. Substitua o coletor vazio por tubos de cabeça plana PCR de 0,5 mililitros sem Dase e sem rnase contendo 30 microliters de tampão de lise por tubo. Devolva o coletor para a máquina e clique para continuar.Carregue a amostra processada no microscópio e clique em Descarregar no software de microdisseção a laser. Suba a amostra no suporte de slides e coloque o suporte de slides no palco. Clique em Continuar e selecione Cortar o corte na janela Formas de Corte.Use os controles de microscópio para encontrar a área de interesse e desenhar um contorno em torno da região de interesse. Em seguida, selecione um tubo coletor de destino e clique em Iniciar corte para prosseguir a microdisseção do tecido. Quando todas as áreas de interesse forem dissecadas, transfira os tubos coletores do suporte para o gelo seco até que estejam em processamento a jusante.Para adquirir tecidos com morfologia superior e integridade do RNA, foram avaliadas várias abordagens de perfusão. Para dissecar as áreas de interesse, é necessário manchar os tecidos com corantes inócuos para RNA. A perfusão subsequente de camundongos portadores de tumor com solução de tyrode e 30% de sacarose seguida de uma incubação durante a noite em 30% de sacarose resulta na preservação da morfologia e integridade do RNA do tecido do camundongo.Embora a fixação do tecido paraformaldeído resulte em uma morfologia tecidual de alta qualidade, a integridade do RNA é impactada negativamente. Outras abordagens como o uso de uma incubação de solução de tyrode, ou solução de tyrode mais incubações de solução de sacarose de 30% não afetam a qualidade do RNA, mas observa-se uma resolução reduzida na morfologia tecidual. Se os tecidos não forem montados com meio de montagem, as seções ficam desidratadas e a morfologia se deteriora enquanto a montagem das amostras de tecido com 15% de montagem média dissolvida na água mantém uma morfologia tecidual de alta qualidade.A imagem do microscópio de microdisseção de captura a laser permite a seleção do tecido tumoral para dissecção. Essa região de seleção de interesse permite, então, dissecção de áreas de interesse dentro de cada amostra de tecido para análise de integridade do RNA. Manter uma morfologia de tecido tumoral de alta qualidade e integridade do RNA é fundamental.A solução de tyrode e a perfusão de 30% de sacarose com preservação durante a noite em 30% de sacarose melhora significativamente a morfologia tecidual para LMD. A fixação rápida de lyoma, coloração e montagem com solução DE GAN é um passo fundamental para preservar a qualidade do RNA e evitar que as rachaduras se formem dentro do tecido. Recomendamos seccionar pelo menos 2,5 vezes 10 para o 6º tumor total de micrômetros quadrados por área de tecido para obter quantidades apropriadas de RNA para controle de qualidade de RNA e análise transcriômica.A LMD permite a análise das vias de sinalização molecular que regulam a heterogeneidade e a invasão do glioma que poderiam revelar novos alvos potenciais para o desenvolvimento translacional futuro em modelos de glioma pré-clínico.

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Neurociência

O vídeo descreve a dissecção a laser do modelo de cocultura organotípica 3D com precisão em nível de mícron. Em modelos organotípicos 3D, constituintes estromais, como fibroblastos, são co-cultivados tridimensionalmente com células epiteliais cancerígenas. O modelo 3D serve como uma ferramenta experimental que permite que as interações entre invasão e estroma de câncer sejam estudadas em condições quase fisiológicas.

Microdissecção a laser: uma técnica para isolar células invasoras de câncer colorretal a partir de um modelo de cultura organotípica 3D

Fonte: Parker, J. J., et al. Um modelo de cultura de fatias organotípicas de glioblastoma humano para estudo da migração de células tumorais e efeitos específicos do paciente de medicamentos anti-invasivos. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo mostra a imagem de fatias de tecido de glioblastoma expressando proteína fluorescente verde (GFP) por meio de microscopia confocal. Imagens de alta resolução são capturadas em intervalos consistentes para rastrear o movimento e a direção das células tumorais.

Imagem da migração de células tumorais em tecido de glioblastoma usando microscopia confocal de varredura com lapso de tempo

Perfil molecular de células de laser e microdissecados do estroma, modelos de cancro colorectal sintéticos engenharia de tecidos representa uma abordagem nova e manipulável para caracterizar e dissecar a biologia distinta na interface entre as células tumorais na frente invasiva e células estromais de cancro associado.

Profiling Molecular do microambiente do tumor invasivo em um modelo 3-Dimensional de células de câncer colorretal e<em&gt; Ex vivo</em&gt; Os fibroblastos

Os modelos atuais ex vivo de glioblastoma (GBM) não são otimizados para o estudo fisiologicamente relevante da invasão de tumores humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para geração e manutenção de culturas de fatia organotípicas a partir de tecido GBM humano fresco. É fornecida uma descrição da microscopia por lapso de tempo e técnicas quantitativas de análise de migração celular.

Um modelo de cultura de fatia organotipica de glioblastoma humano para estudo de migração de células tumorais e efeitos específicos de pacientes de drogas anti-invasivas

Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.

Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente

Os efeitos de inibidores migrastatic na migração da pilha do cancro do glioma em ensaios tridimensionais da invasão (3D) usando um inibidor do do histone do histona (HDAC) são caracterizados pela microscopia confocal de alta resolução.

Caracterização dos efeitos de inibidores de Migrastatic na invasão do spheroid do tumor 3D pela microscopia confocal de alta resolução

A desregulação proteômica desempenha um papel importante na disseminação de gliomas difusos infiltrantes, mas várias proteínas relevantes permanecem não identificadas. O processamento espacial digital (DSP) oferece uma abordagem eficiente e de alto rendimento para caracterizar a expressão diferencial de proteínas candidatas que podem contribuir para a invasão e migração de gliomas infiltrativos.

Perfil Espacial Digital para Caracterização do Microambiente em Glioma Infiltrante Difuso do Tipo Adulto

Relatamos uma técnica que permite imagens ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma (GBM) invadindo um tecido cerebral de vertebrados. O acoplamento da injeção ortotópica de células GBM marcadas fluorescentemente em um cérebro transparente de peixe-zebra com imagens intravitais de alta resolução permite a medição da dinâmica do citoesqueleto durante a invasão do câncer in situ .

Imagem ao vivo da dinâmica dos microtúbulos em células de glioblastoma invadindo o cérebro do peixe-zebra

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de alto rendimento para segmentação de regiões de interesse confirmadas pela patologia de imagens de seção de tecidos manchados e finos para enriquecimento de populações celulares resolvidas por histologia usando microdisseção a laser. Esta estratégia inclui um novo algoritmo que permite a transferência de demarcações denotando populações celulares de interesse diretamente para microscópios a laser.

Microdisseção laser industrializada e guiada por inteligência artificial para análise proteômica microescalada do Microambiente tumoral

A microdissecção por captura a laser de tecidos de fibrose submucosa oral permite a extração precisa de células de regiões histológicas de interesse para a análise de dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais.

Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser

Apresentamos um modelo de migração de glioblastoma 3D usando gliomasferas magnéticas derivadas de pacientes geradas a partir de tumores recém-diagnosticados e recorrentes. Esta plataforma permite visualização da dinâmica de migração específica do paciente e avaliação da eficácia terapêutica. O ensaio pode ser multiplexado após a migração para avaliar a localização e os padrões de expressão da proteína.

Ensaio de Migração de Glioblastoma 3D Reproduzível com Localização Magnética de Esferoides Mediadas por Nanopartículas sob Condições Hipóxicas

Aprenda microdissecção a laser para isolar regiões específicas de glioma e analisar a expressão diferencial de mRNA. Este método preserva a morfologia tecidual e a integridade do RNA para estudos de heterogeneidade tumoral.

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão (Vídeo) | JoVE Journal

Microdissecção de Captura a Laser de Sub-regiões de Glioma para Caracterização Espacial e Molecular da Heterogeneidade Intratumoral, Oncostreams e Invasão

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