Name: Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter uniformes em substrato planar para síntese de proteínas sem células. Este método permite medição rápida e quantitativa da atividade enzimática sem etapas complexas de purificação.

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Este trabalho foi apoiado pelo número de subvenção JSPS KAKENHI JP18K14260 e pelo orçamento da Agência japonesa de Ciência e Tecnologia da Terra Marinha. Agradecemos a Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) por fornecerem as instalações de caracterização. Agradecemos a Ken Takai (JAMSTEC) pelo suporte a software comercial. A microfabização foi realizada na Supercleanroom Takeda Sentanchi, a Universidade de Tóquio, apoiada pelo "Programa plataforma de nanotecnologia" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão, Número de Subvenção JPMXP09F19UT0087.

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Os autores não têm nada a revelar.

A medição altamente quantitativa baseada nas gotículas altamente uniformes, estáveis e biocompatíveis no FemDA possibilitou a distribuição discreta, a característica única do nosso estudo diferente das outras. Otimizamos sistematicamente e detalhamos os processos de microfabização e formação de gotículas neste artigo. Existem várias etapas críticas no protocolo estabelecido.
Primeiro, o revestimento uniforme do polímero CYTOP altamente viscoso no substrato de vidro fino retangular determina em...

Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microliter 96/384/1536-well placa, e nanoliter/picoliter/picoliter/femtoliter reatores1,,2,3,,4,5,6,7. Análogo à redução do tamanho do recurso de transistores em chips de circuito integrados na indústria de semicondutores nas últimas décadas, os microreatores bioquímicos estão passando por redução de volume e integração do sistema. Tais ferramentas de pequena escala tiveram um impacto profundo na biologia sintética baseada em células ou sem células, a biocoformação biomafatorial e a prototipagem e triagem de alta produtividade8,,9,,10,,11,12. Este artigo descreve nosso recente esforço no desenvolvimento de uma tecnologia única de gotículas e demonstra sua aplicação no CFPS13, uma tecnologia fundamental para a biologia sintética e comunidades de triagem molecular14. Em particular, fornecemos intencionalmente um protocolo otimizado e de baixo custo para tornar o dispositivo FemDA acessível a todos. O protocolo de baixo custo e fácil de lidar para o dispositivo miniaturizado contribuiria para os propósitos educacionais das universidades e ajudaria a disseminar a tecnologia.
FemDA prepara gotículas femtoliter a uma densidade ultra-alta de 106 por 1 cm2 em um substrato de vidro planar. Nós revestemos um polímero hidrofóbico, CYTOP15,no substrato de vidro e gravado seletivamente (removido) CYTOP em posições predefinidas para gerar uma matriz de microcâmara no substrato. Assim, a microcâmara resultante é composta por uma parede lateral hidrofóbica (CYTOP) e um fundo hidrofílico (vidro). Quando fluimos sequencialmente água e óleo sobre a superfície padronizada, a água pode ser presa e selada nos microchambers. A estrutura hidrofóbica-em-hidrofóbica é vital para repelir a água fora dos microchambers, isolar microreatores individuais e reter uma pequena solução aquosa dentro do espaço femtoliter. A propriedade única foi aplicada com sucesso para a preparação de gotículas de água em óleo e microcompartamentos lipídes bicamadas16,17. Em comparação com o protótipo do dispositivo16,primeiro otimizamos o processo de microfabaçação para realizar uma remoção completa do polímero CYTOP, bem como uma exposição completa do fundo de vidro. CYTOP é um fluoropolímero especial com tensão superficiais (19 mN/m) inferior à de materiais microrretores convencionais, como vidro, plásticos e silicone. Seu bom desempenho óptico, elétrico e químico já foi utilizado no tratamento superficial de dispositivos microfluidos18,19,20,,21,,22,,23,,24. No sistema FemDA, para obter uma boa moçação do óleo na superfície CYTOP, a tensão superficial do óleo deve ser menor do que a da superfície sólida25. Caso contrário, o óleo líquido em contato com a superfície sólida tende a se tornar esférico em vez de se espalhar sobre a superfície. Além disso, descobrimos que alguns óleos populares de perfluorocarbono (por exemplo, 3M FC-40)16 e óleos de hidrofluoroether (por exemplo, série 3M Novec) podem dissolver CYTOP como resultado da morfologia amorfa do CYTOP, que é fatal para medição quantitativa e seria questionável em termos de contaminação cruzada entre gotículas. Felizmente, identificamos um óleo biocompatível e ecologicamente correto que exibe tensão superficial mais baixa (< 19 mN/m)13. Também encontramos um novo surfactante que pode dissolver-se no óleo selecionado e funcionar em baixa concentração (0,1%, pelo menos 10 vezes menor do que os populares relatados anteriormente26,27)13. A interface água/óleo resultante pode ser estabilizada pelo surfactante. Devido à alta taxa de evaporação do óleo, após a descarga com o óleo, aplicamos outro óleo biocompatível e ambientalmente amigável para substituir o primeiro a selar os microchambers. Chamamos o primeiro óleo (ASAHIKLIN AE-3000 com 0,1 wt % SURFLON S-386) o "óleo de descarga" e o segundo óleo (Fomblin Y25) o "óleo de vedação", respectivamente.
A estratégia de vedação de óleo em duas etapas pode realizar uma formação robusta da matriz de gotículas femtoliter em minutos e sem instrumentação sofisticada. Devido ao problema de evaporação, tem sido considerado desafiador gerar microreatores menores do que os volumes picoliter28. A FemDA abordou essa questão otimizando sistematicamente os materiais e processos utilizados para a elaboração de microreatores/gotículas. Várias características notáveis das gotículas resultantes incluem a alta uniformidade (ou monodispersidade), estabilidade e biocompatibilidade na escala femtoliter. O coeficiente de variação (CV) do volume de gotículas é de apenas 3% (sem correção de vinheta para as imagens microscópicas), o menor CV entre as plataformas de gotículas do mundo, o que garante uma medição altamente paralela e quantitativa. A gotícula femtoliter é estável por pelo menos 24 horas sem contaminação cruzada entre gotículas à temperatura ambiente, o que é valioso para uma medição confiável do curso de tempo. Em relação à biocompatibilidade, conseguimos sintetizar várias proteínas a partir de um DNA modelo de cópia única na gotícula femtoliter, que anteriormente havia sido considerada difícil ou ineficiente29,30. Seria digno de elucidar por que algumas proteínas capazes de ser sintetizadas no FemDA não podem ser sintetizadas em outros sistemas de gotículas. FemDA não foi meramente um avanço técnico, mas também realizou uma medição quantitativa sem precedentes que pode correlacionar o rendimento da proteína (como refletido pela intensidade da fluorescência da gotícula) ao número de moléculas de DNA modelo em cada gotícula. Como resultado, o histograma da intensidade de fluorescência de gotículas do CFPS baseado em FemDA mostrou uma distribuição discreta que pode ser bem encaixada por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais. Além disso, a probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson31. Assim, o rendimento diferente de proteínas em cada gotícula pode ser normalizado com base na distribuição discreta. Este recurso crítico nos permite separar as informações de atividade enzimática da intensidade aparente, que ainda não está disponível com outras plataformas de microreatores. Os sistemas de classificação de células/gotículas microfluidas existentes são habilitados em classificação totalmente automática e bons em concentrar amostras, mas às vezes só podem produzir um histograma relativamente amplo ou de cauda longa no aspecto analítico32,33. Nosso sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatível estabelece um novo benchmark e um alto padrão analítico no campo do desenvolvimento de microreatores.
Os óleos e surfactantes que poderiam ser usados para a preparação de gotículas ainda são muito limitados34. A combinação de ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 estabelecida na FemDA é um novo membro do crescente arsenal da interface fisioquímica entre a fase aquosa e a fase13do óleo . A nova interface em FemDA é fisicamente estável, quimicamente inerte e biologicamente compatível com a transcrição complexa, tradução e máquinas de modificação pós-translacional para muitos tipos de proteínas13. Seria bastante atraente encontrar uma proteína que não pode ser sintetizada nas configurações de gotícula. Além disso, a economia de custos dos reagentes é mais evidente no sistema de gotícula femtoliter do que no sistema de reator nanoliter e picoliter35,36. Em particular, muitas vezes haveria um grande volume morto, que é causado principalmente por tubos ou suprimentos externos, em sistemas microfluídicos de geração de droplet, mas não em nosso FemDA. O formato de matriz também é favorecido pela caracterização microscópica repetida e detalhada (semelhante à chamada análise de alto conteúdo) para cada reator37, em vez de apenas um único instantâneo para um objeto em movimento rápido. A escala femtoliter permitiu a integração de mais de um milhão de reatores em uma área do tamanho de um dedo, enquanto o mesmo número de reatores nanoliteres (se existir) requer sobre a área do metro quadrado, o que seria sem dúvida impraticável para fabricar ou usar tal sistema.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil)trietoxissilano</td><td></td><td></td> Seringa <td></td></tr> de <tr><td>1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grau</td><td>EL: para uso eletrônico.</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser 3D</td><td>Lasertec</td><td>OPTELICS HYBRID</td><td>Outros microscópios semelhantes (por exemplo, Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) também são aplicáveis.</td></tr><tr><td>Seringa de 50 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-50LZ</td><td></td></tr><tr><td>6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D6567</td><td>Prepare uma solução estoque de 5 mM em dimetilsulfóxido</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grau</td><td>EL: para uso eletrônico. Pureza 99,8%.</td></tr><tr><td>Soprador de ar</td><td>Hozan</td><td>Z-263</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de alumínio</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-24M-02</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de microtubo de alumínio</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-136C</td><td></td></tr><tr><td>ASAHIKLIN AE-3000</td><td>AGC</td> <td>(amostra de teste)</td> <td>A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à AGC.</td></tr><tr><td>Limpador BEMCOT PS-2</td><td>Ozu</td><td>028208</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia com êmbolo</td><td>Kai</td><td>BPP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Matsunami Glass</td><td>No. 1 (24 mm e vezes; 32 mm, 0,13 ~ 0,17 mm de espessura)</td> <td>Tamanho personalizado.</td></tr><tr><td>Porta-manchas de vidro</td><td>Nakayama</td><td>803-131-11</td><td></td></tr><tr><td>CRECIA TechnoWipe limpador limpo</td> Papel <td>Nippon Crecia</td><td>C100-M</td><td></td></tr><tr><td>Tapete de corte</td><td>GE Healthcare</td><td>WB100020</td><td></td></tr><tr><td>CYTOP</td><td>AGC</td><td>CTL-816AP</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de desaeração</td><td>Thinky</td><td>AR-100</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de mesa</td><td>Roland</td><td>STIKA SV-8</td><td></td></tr><tr><td>Desenvolvedor</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 300 MIF</td><td>AZ Electronic Materials foi agora adquirida pela Merck. Outros desenvolvedores alcalinos também podem ser aplicáveis, mas devem exigir otimização das condições de desenvolvimento (tempo, temperatura, etc.)</td></tr><tr><td>Fita adesiva dupla face de filme Kapton</td><td>Teraoka Seisakusho</td><td>7602 #25</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Kanto Químico EL</td><td>grau</td><td>EL: para uso eletrônico. Pureza 99,5%.</td></tr><tr><td>Versão de Fiji</td><td></td><td></td><td>: ImageJ 1.51n</td></tr><tr><td>Cortador de cabo plano</td><td>Tokyo-IDEAL</td><td>MT-0100</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Fomblin</td><td>Solvay</td><td>Y25 ou Y25 / 6</td><td>A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à Solvay. Fomblin Y25 / 6 é uma alternativa se Y25 não estiver prontamente disponível.</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>COMO UM</td><td>TH-900</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de injeção</td><td>Terumo</td><td>NN-2270C</td><td>22G &times; 70 mm</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Especificação de epifluorescência, câmera CCD ou sCMOS, palco motorizado, sistema de foco automático e lente objetiva de alta NA são necessários.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td><td></td><td>Versão: 4.5</td></tr><tr><td>Alinhador de máscara</td><td>SUSS</td><td>MA-6</td><td>Outros alinhadores de máscara também são aplicáveis, desde que o modo de contato a vácuo esteja disponível.</td></tr><tr><td>Pipeta MICROMAN</td><td>GILSON</td><td>E M250E</td><td>Ponta do pistão capilar: CP250</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Versão Microsoft</td><td></td><td>: 16.16.15</td></tr><tr><td>Mini câmara de vácuo</td><td>COMO UM</td><td>MVP-100MV</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90101</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-021D/SP</td><td></td></tr><tr><td>PLACA DE Petri</td><td>AS ONE</td><td>GD90-15</td><td>Diâmetro 90 mm, altura 15 mm.</td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ P4903</td><td>A AZ Electronic Materials foi agora adquirida pela Merck. AZ P4620 é uma alternativa.</td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>BioTek</td><td>POWERSCAN HT</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de polietileno</td><td>AS ONE</td><td>6-896-02</td><td>Nome comercial: Saniment.</td></tr><tr><td>Kit de síntese de proteínas in vitro PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S ou E6800L</td><td>Para reação de síntese de proteínas sem células.</td></tr><tr><td>Sistema de gravação de íons reativos</td><td>Samco</td><td>RIE-10NR</td><td>Outros sistemas RIE também são aplicáveis, mas devem exigir a otimização das condições RIE (vazão de gás, pressão da câmara, potência de RF, tempo de gravação, etc.)</td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>3M</td><td>810-1-18D</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>194-09575</td><td>Concentração de 8 M; perigo.</td></tr><tr><td>Revestidor de rotação</td><td>Oshigane</td><td>SC-308</td><td></td></tr><tr><td>SURFLON S-386 surfactante</td><td>AGC</td> <td>(amostra de teste)</td> <td>A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à AGC.</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone SYLGARD 184</td><td>Dow</td><td>Sylgard184</td><td>Composição química: polidimetilsiloxano. A proporção de mistura padrão é base: agente de cura = 10 : 1 (m/m).</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Ideal-tek</td><td>2WF. SA.1 2A</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>AS ONE</td><td>ASU-2M</td><td></td></tr><tr><td>Mandril a vácuo</td><td>Oshigane</td> <td>(Personalizado)</td><td>Material: delrin; estágio de amostra retangular com vários furos (48 furos, cada um com 1 mm de diâmetro); o tamanho é personalizado para caber no tamanho da lamínula (24 mm e vezes; 32 mm).</td></tr></tbody></table>

uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de dna único

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Os avanços na resolução espacial e na sensibilidade de detecção da instrumentação científica possibilitam a aplicação de pequenos reatores para pesquisas biológicas e químicas. Para atender à demanda por microreatores de alto desempenho, desenvolvemos um dispositivo Femtoliter droplet array (FemDA) e exemplificamos sua aplicação em reações de síntese proteica livre de células massivamente paralelas (CFPS). Mais de um milhão de gotículas uniformes foram prontamente geradas dentro de uma área do tamanho de um dedo usando um protocolo de vedação de óleo de duas etapas. Cada gotícula estava ancorada em uma microcâmara femtoliter composta por um fundo hidrofílico e uma parede lateral hidrofóbica. A estrutura hidrofóbica híbrida e os óleos de vedação dedicados e surfactantes são cruciais para manter a solução aquosa femtoliter no espaço femtoliter sem perda de evaporação. A configuração femtoliter e a estrutura simples do dispositivo FemDA permitiram o consumo mínimo de reagentes. A dimensão uniforme dos reatores de gotículas tornou as medições quantitativas e de curso de tempo em larga escala convincentes e confiáveis. A tecnologia FemDA correlacionou o rendimento proteico da reação do CFPS com o número de moléculas de DNA em cada gotícula. Agilizamos os procedimentos sobre a microfabização do dispositivo, a formação das gotículas femtoliter e a aquisição e análise dos dados de imagem microscópica. O protocolo detalhado com o baixo custo otimizado de execução torna a tecnologia FemDA acessível a todos que possuem instalações padrão de limpeza e um microscópio de fluorescência convencional em seu próprio lugar.

O processo de microfabricação consiste em limpeza de substratos, funcionalização de superfície, revestimento CYTOP, fotolitografia, gravura a seco, despojo fotoresist e limpeza final. É importante ressaltar que o protocolo apresentado permitiu a remoção completa do polímero CYTOP hidrofóbico dentro dos microchambers Figura 3A, produzindo uma estrutura hidrofóbica-hidrofóbica altamente paralela em um substrato de vidro de cobertura padrão. Com o auxílio do protocolo de vedação de óleo, verifi...

O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm2 que pode ser usado para síntese proteica sem células.

Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Mais de um milhão de uniformes das gotículas são produzidos no substrato do tamanho do dedo. E moléculas de DNA simples são distribuídas aleatoriamente em cada gota. O rendimento da proteína é proporcional ao número de moléculas em uma gotícula.Nossa técnica pode ser usada para uma medição rápida e quantitativa da atividade enzimática sem expressão e purificação de proteínas complicadas. Para começar, coloque um copo de tampa em um rack de coloração e coloque o rack em oito hidróxido de sódio molar. Sonicar o vidro de cobertura e o rack de coloração por 15 minutos em temperatura ambiente.Remova o rack de coloração do hidróxido de sódio e enxágue o vidro da tampa com água 10 vezes. Seque o vidro da tampa com uma arma de ar. Em seguida, asse e seque o copo de cobertura em uma placa quente a 200 graus Celsius por cinco minutos.Prepare solução de 0,05% aminosilano. Mergulhe o vidro de cobertura nesta solução e incuba-o por uma hora em temperatura ambiente. Enxágüe o vidro da tampa cinco vezes em água pura.Em seguida, seque o vidro da tampa usando uma arma de ar. Asse na placa quente a 80 graus Celsius por cinco minutos. Coloque o substrato de vidro de cobertura em um mandril de vácuo personalizado para o revestimento de spin.Dispense de 70 a 90 microliters de polímero CYTOP tipo A no centro do substrato de vidro. Em seguida, imediatamente gire o polímero. O revestimento inicial do polímero danifica a qualidade da matriz de microcâmara final.Distribua o polímero no centro do vidro de cobertura sem introduzir bolhas de ar. Pegue o vidro revestido segurando-o nas esquinas e coloque-o em uma folha de alumínio. Asse por 30 minutos a 80 graus Celsius e depois por mais uma hora a 200 graus Celsius.Dispense 0,2 a 0,3 mililitros de fotoresist no centro do substrato. Imediatamente gire o fotoresist a 6.000 rpm por 60 segundos. Use uma limpeza encharcada de etanol para remover o excesso de fotoresistia das bordas do substrato.Asse o substrato a 110 graus Celsius por cinco minutos. Para reidratar o fotoresist, deixe o substrato ficar por 30 minutos a uma umidade relativa de 42 a 60% Carregue o substrato no alinhador da máscara e exponha-o por 25 segundos em um modo de contato a vácuo. Em seguida, mergulhe o substrato no desenvolvedor por cinco minutos para dissolver o fotoresist exposto.Enxágüe o substrato 10 vezes usando água pura. Em seguida, seque o substrato completamente usando a pistola de ar. Coloque o substrato na câmara de reação da máquina de gravura de íons reativos e etch o fotoresist coberto CYTOP com o plasma de oxigênio.Após a gravação, remova o fotoresist restante sonicando o substrato em acetona por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, sonicar o substrato em propanol por cinco minutos. Enxágüe, sonicato e enxágue o substrato novamente usando água pura como descrito no manuscrito.Em seguida, seque o substrato com uma arma de ar. Usando um cortador de desktop, corte fita de filme Kapton de revestimento duplo nas formas de microcanal definidas. Coloque os pedaços de fita cortadas no fundo de uma placa de Petri plana para servir como mestre para a moldagem do PDMS.Despeje a mistura PDMS na placa petri com padrão de fita. Em seguida, coloque a placa de Petri em uma mini câmara de vácuo e desaerar a mistura PDMS por uma a três horas. Em seguida, coloque a placa de Petri em um forno a 60 graus Celsius e deixe-a durante a noite para curar o PDMS.Depois que o PDMS tiver curado, descasque o elastômero curado da placa de Petri e use um cortador de cabo plano para cortar os blocos microcanais PDMS. Em seguida, faça um buraco em cada extremidade de cada microcanal. O substrato previamente preparado terá uma área para a matriz de microcâmaras.Posicione o microcanal PDMS nesta parte do substrato. Em seguida, insira uma ponta de tubulação de 200 microliter em um dos orifícios do microcanal PDMS. Primeiro, prepare a solução de reação CFPS em um tubo PCR.Em seguida, usando uma ponta de tubulação não filtrante de 200 microliteres, elasve 10 microliters da solução. Insira a ponta da tubulação no orifício de entrada do microcanal PDMS e empurre para baixo no êmbolo da tubulação até que a solução transborde da saída do microcanal. Transfira o dispositivo FemDA para um bloco de alumínio pré-refrigerado.Confirme se a área de matriz de microcâmara passa rapidamente de translúcida para transparente. Desenhe 300 microliters de óleo de descarga pré-refrigerado e transfira imediatamente o óleo para a ponta tubulata do orifício de entrada do microcanal. O óleo de descarga se move para o microcanal e extrude a solução de reação em excesso localizada fora dos microchambers.Remova simultaneamente as duas pontas de tubulação inseridas do dispositivo. Mova imediatamente o dispositivo do bloco de alumínio para o filme de parafina. Insira a ponta de tubulação preparada contendo o óleo de vedação na entrada do microcanal PDMS e injete o óleo até que ele transborde da tomada.As gotículas femtoliter são seladas em microchambers individuais pelo óleo. Abra a imagem BF desfocada. Para remover fundos contínuos suaves de cada quadro, selecione Subtrair o fundo do menu Process.Digite 20 para o raio da bola rolando. Verifique a caixa De visualização e selecione Ok. Selecione Sim quando perguntado se deve processar todas as imagens.Em seguida, para reduzir o ruído, selecione Processo, Filtros, Mediana. Digite 2.0 para o raio em pixels. Verifique a caixa De visualização e selecione Ok.Selecione Sim quando perguntado se deve processar todas as imagens. Em seguida, selecione Imagem, Ajuste, Limiar para separar as imagens dos microchambers do fundo da imagem. No menu Plugins, selecione FemDA, Análise FemDA.Insira o número mínimo e máximo aproximado de pixels de uma única microcâmara. A circularidade mínima e máxima esperada dos microchambers e os números do quadro de início e final, em seguida, selecione Gerar ROI para detectar os microchambers. Os ROIs detectados com sucesso são mostrados no ROITable do menu pop-up.Na janela Análise FemDA, selecione Aplicar máscara de ROI. Examine a imagem para ver se os microchambers foram detectados corretamente. Abra a imagem da fluorescência e traga-a para a frente.Clique em Aplicar a máscara ROI novamente para adicionar os ROIs à imagem de fluorescência. Na janela Análise FemDA, selecione One-Shot para analisar dados de ponto final da imagem. Digite N para o número de pixels superiores usar os pixels topo de linha de cada ROI para calcular a intensidade média da gotícula correspondente.Em seguida, clique em Medir a intensidade para calcular as intensidades médias de todas as gotículas detectadas. O ROITable é atualizado com os novos dados da imagem da fluorescência e o histograma é exibido em uma nova janela. Exporte os dados clicando no botão Salvar como texto.A solução fluorescente foi encapsulada em microchambers FemDA e a intensidade da fluorescência, que está correlacionada com o tamanho da gotícula, foi medida por meio de microscopia. Verificou-se que as gotículas tinham uma distribuição de tamanho estreito. A imagem 3D reconstruída da microscopia confocal também mostrou o tamanho consistente da gotícula ao longo do tempo.As gotículas foram estáveis à temperatura ambiente sem perda de evaporação ou contaminação cruzada entre gotículas por pelo menos 24 horas. A proteína fluorescente mNeonGreen foi sintetizada em FemDA. E os dados da imagem da pilha foram analisados com o auxílio da imagem de campo brilhante desfocado concomitante.Como a intensidade de fluorescência de cada gotícula é medida de seu rendimento proteico, o histograma sugere fortemente números desiguais de moléculas de DNA por gotícula. A probabilidade de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson. A síntese da enzima fosfattase alcalina também foi realizada em FemDA com imagens capturadas a cada cinco minutos.A reação mostrou uma distribuição discreta semelhante da intensidade de fluorescência das gotículas em momentos anteriores e os resultados do histograma verificaram que os números desiguais das moléculas de DNA nas gotículas. Uma única molécula de DNA encapsulada em gotículas individuais pode ser ainda mais recuperada, amplificada e sequenciada, torná-la a maior triagem de proteínas possível. Uma técnica de gotícula com volume pequeno e alta estabilidade permite um diagnóstico molecular rápido e preciso de doenças cancerígenas com biomarcadores específicos.

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

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