Name: Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter uniformes em substrato planar para síntese de proteínas sem células. Este método permite medição rápida e quantitativa da atividade enzimática sem etapas complexas de purificação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi apoiado pelo número de subvenção JSPS KAKENHI JP18K14260 e pelo orçamento da Agência japonesa de Ciência e Tecnologia da Terra Marinha. Agradecemos a Shigeru Deguchi (JAMSTEC) e Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) por fornecerem as instalações de caracterização. Agradecemos a Ken Takai (JAMSTEC) pelo suporte a software comercial. A microfabização foi realizada na Supercleanroom Takeda Sentanchi, a Universidade de Tóquio, apoiada pelo "Programa plataforma de nanotecnologia" do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia (MEXT), Japão, Número de Subvenção JPMXP09F19UT0087.

<ol><li>Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplets+for+ultrasmall-volume+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplets for ultrasmall-volume analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).</li>
<li>Squires, T. M., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics%3A+fluid+physics+at+the+nanoliter+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale.</a> Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).</li>
<li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics+for+high-throughput+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics for high-throughput biological assays.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).</li>
<li>Zhu, P. A., Wang, L. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+droplet+generation+with+microfluidics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Passive and active droplet generation with microfluidics: a review.</a> Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).</li>
<li>Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturising+the+laboratory+in+emulsion+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Miniaturising the laboratory in emulsion droplets.</a> Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).</li>
<li>Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tubes+to+drops%3A+droplet-based+microfluidics+for+ultrahigh-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics+D%3A+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004(2013).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhang%2C+Y+%22DNA+Nanotechnology%22">DNA Nanotechnology</a>. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).</li>
<li>Dubuc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+microcompartmentalised+transcription-translation+for+the+prototyping+of+synthetic+communication+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks.</a> Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).</li>
<li>Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+approaches+in+synthetic+biology+utilizing+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics.</a> Genes. 9 (3), (2018).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+cell-free+protein+synthesis+in+synthetic+biology%3A+Interfacing+bio-machinery+with+synthetic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments.</a> Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).</li>
<li>Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+artificial+life%3A+techniques+for+bottom-up+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology.</a> Micromachines. 10 (5), (2019).</li>
<li>Bowman, E. K., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplet-assisted+screening+of+biomolecule+production+for+metabolic+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications.</a> Trends in Biotechnology. , (2019).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+high-throughput+screening+based+on+digital+protein+synthesis+in+a+massively+parallel+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array.</a> Science Advances. 5 (8), 8185(2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. , (2019).</li>
<li>Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+a+high-performance+perfluorinated+polymer+electret+and+its+application+to+micro+power+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011(2008).</li>
<li>Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+enzymatic+assay+in+a+directly+accessible+femtoliter+droplet+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array.</a> Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrayed+lipid+bilayer+chambers+allow+single-molecule+analysis+of+membrane+transporter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity.</a> Nature Communications. 5, 4519(2014).</li>
<li>Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+surface+plasmon+waveguides+and+devices+in+Cytop+with+integrated+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).</li>
<li>Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensing+using+straight+long-range+surface+plasmon+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides.</a> Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).</li>
<li>Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+invisible+visible%3A+a+microfluidic+chip+using+a+low+refractive+index+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer.</a> Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).</li>
<li>Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting+using+thin+fluoroploymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).</li>
<li>Lin, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+voltage+electrowetting-on-dielectric+platform+using+multi-layer+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+B-Chemical%22%5BJournal%5D)">Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators.</a> Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).</li>
<li>Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+microfluidic+system+for+long-term+perfusion+culture+and+on-line+monitoring+of+intestinal+tissue+models%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models.</a> Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).</li>
<li>Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoropolymer-coated+PDMS+microfluidic+devices+for+application+in+organic+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry-a+European+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis.</a> Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).</li>
<li>de Gennes, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wetting%3A+statics+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Wetting: statics and dynamics.</a> Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Wagner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+fluorinated+polyglycerols+for+droplet+microfluidics+as+an+alternative+to+PEG-based+copolymer+surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants.</a> Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).</li>
<li>Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%3A+a+tool+for+biology%2C+chemistry+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22TrAC+Trends+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidic+systems+for+high-throughput+single+DNA+molecule+isothermal+amplification+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis.</a> Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).</li>
<li>Galinis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+nanoparticles+for+improved+protein+synthesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie-International+Edition%22%5BJournal%5D)">DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+bioassays%3A+theory%2C+applications%2C+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Digital bioassays: theory, applications, and perspectives.</a> Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).</li>
<li>Mazutis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Courtois, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+device+for+monitoring+time-dependent+in+vitro+expression+from+single+genes+in+picolitre+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets.</a> ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).</li>
<li>Agresti, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).</li>
<li>Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding%3A+tracking+mobile+micro-reactors+for+high-throughput+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Mukhopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+PDMS+isn%27t+the+best%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">When PDMS isn't the best.</a> Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).</li>
<li>Bradshaw, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequence+of+Escherichia+coli+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMantilla%2C+CB+%22Techniques+in+Confocal+Microscopy%22">Techniques in Confocal Microscopy</a>. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).</li>
<li>Noji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+counting+of+biomolecules+with+femtoliter+dropret+chamber+array%5BTitle%5D)+AND+%22The+17th+International+Conference+on+Solid-State+Sensors%2C+Actuators+and+Microsystems+%28TRANSDUCERS+%26+EUROSENSORS+XXVII%22%5BJournal%5D)">Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array.</a> The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-localization+for+fast+analysis+of+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays.</a> Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+barcode-inspired+automatic+analysis+for+arrayed+microfluidic+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays.</a> Biomicrofluidics. 7 (3), 034110(2013).</li>
<li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGonzalez%2C+RC+%22Digital+image+processing%22">Digital image processing</a>. , Pearson. New York, NY. (2018).</li>
<li>Cohen, L., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+arrays+for+protein+and+nucleic+acid+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A medição altamente quantitativa baseada nas gotículas altamente uniformes, estáveis e biocompatíveis no FemDA possibilitou a distribuição discreta, a característica única do nosso estudo diferente das outras. Otimizamos sistematicamente e detalhamos os processos de microfabização e formação de gotículas neste artigo. Existem várias etapas críticas no protocolo estabelecido.
Primeiro, o revestimento uniforme do polímero CYTOP altamente viscoso no substrato de vidro fino retangular determina em...

Pesquisadores usam reatores para realizar reações bioquím químicas. Há esforços significativos que têm sido feitos para reduzir o tamanho do reator e aumentar o rendimento experimental, a fim de diminuir o consumo de reagentes e, ao mesmo tempo, melhorar a eficiência do trabalho. Ambos os aspectos visam libertar os pesquisadores de uma carga de trabalho pesada, diminuindo o custo e acelerando a pesquisa e o desenvolvimento. Temos um roteiro histórico claro sobre o desenvolvimento das tecnologias do reator do ponto de vista dos volumes de reação e do throughput: bicos únicos/frascos/tubos de ensaio, tubos mililitros, tubos microliteres, microliter 8-tube tiras, microliter 96/384/1536-well placa, e nanoliter/picoliter/picoliter/femtoliter reatores1,,2,3,,4,5,6,7. Análogo à redução do tamanho do recurso de transistores em chips de circuito integrados na indústria de semicondutores nas últimas décadas, os microreatores bioquímicos estão passando por redução de volume e integração do sistema. Tais ferramentas de pequena escala tiveram um impacto profundo na biologia sintética baseada em células ou sem células, a biocoformação biomafatorial e a prototipagem e triagem de alta produtividade8,,9,,10,,11,12. Este artigo descreve nosso recente esforço no desenvolvimento de uma tecnologia única de gotículas e demonstra sua aplicação no CFPS13, uma tecnologia fundamental para a biologia sintética e comunidades de triagem molecular14. Em particular, fornecemos intencionalmente um protocolo otimizado e de baixo custo para tornar o dispositivo FemDA acessível a todos. O protocolo de baixo custo e fácil de lidar para o dispositivo miniaturizado contribuiria para os propósitos educacionais das universidades e ajudaria a disseminar a tecnologia.
FemDA prepara gotículas femtoliter a uma densidade ultra-alta de 106 por 1 cm2 em um substrato de vidro planar. Nós revestemos um polímero hidrofóbico, CYTOP15,no substrato de vidro e gravado seletivamente (removido) CYTOP em posições predefinidas para gerar uma matriz de microcâmara no substrato. Assim, a microcâmara resultante é composta por uma parede lateral hidrofóbica (CYTOP) e um fundo hidrofílico (vidro). Quando fluimos sequencialmente água e óleo sobre a superfície padronizada, a água pode ser presa e selada nos microchambers. A estrutura hidrofóbica-em-hidrofóbica é vital para repelir a água fora dos microchambers, isolar microreatores individuais e reter uma pequena solução aquosa dentro do espaço femtoliter. A propriedade única foi aplicada com sucesso para a preparação de gotículas de água em óleo e microcompartamentos lipídes bicamadas16,17. Em comparação com o protótipo do dispositivo16,primeiro otimizamos o processo de microfabaçação para realizar uma remoção completa do polímero CYTOP, bem como uma exposição completa do fundo de vidro. CYTOP é um fluoropolímero especial com tensão superficiais (19 mN/m) inferior à de materiais microrretores convencionais, como vidro, plásticos e silicone. Seu bom desempenho óptico, elétrico e químico já foi utilizado no tratamento superficial de dispositivos microfluidos18,19,20,,21,,22,,23,,24. No sistema FemDA, para obter uma boa moçação do óleo na superfície CYTOP, a tensão superficial do óleo deve ser menor do que a da superfície sólida25. Caso contrário, o óleo líquido em contato com a superfície sólida tende a se tornar esférico em vez de se espalhar sobre a superfície. Além disso, descobrimos que alguns óleos populares de perfluorocarbono (por exemplo, 3M FC-40)16 e óleos de hidrofluoroether (por exemplo, série 3M Novec) podem dissolver CYTOP como resultado da morfologia amorfa do CYTOP, que é fatal para medição quantitativa e seria questionável em termos de contaminação cruzada entre gotículas. Felizmente, identificamos um óleo biocompatível e ecologicamente correto que exibe tensão superficial mais baixa (< 19 mN/m)13. Também encontramos um novo surfactante que pode dissolver-se no óleo selecionado e funcionar em baixa concentração (0,1%, pelo menos 10 vezes menor do que os populares relatados anteriormente26,27)13. A interface água/óleo resultante pode ser estabilizada pelo surfactante. Devido à alta taxa de evaporação do óleo, após a descarga com o óleo, aplicamos outro óleo biocompatível e ambientalmente amigável para substituir o primeiro a selar os microchambers. Chamamos o primeiro óleo (ASAHIKLIN AE-3000 com 0,1 wt % SURFLON S-386) o "óleo de descarga" e o segundo óleo (Fomblin Y25) o "óleo de vedação", respectivamente.
A estratégia de vedação de óleo em duas etapas pode realizar uma formação robusta da matriz de gotículas femtoliter em minutos e sem instrumentação sofisticada. Devido ao problema de evaporação, tem sido considerado desafiador gerar microreatores menores do que os volumes picoliter28. A FemDA abordou essa questão otimizando sistematicamente os materiais e processos utilizados para a elaboração de microreatores/gotículas. Várias características notáveis das gotículas resultantes incluem a alta uniformidade (ou monodispersidade), estabilidade e biocompatibilidade na escala femtoliter. O coeficiente de variação (CV) do volume de gotículas é de apenas 3% (sem correção de vinheta para as imagens microscópicas), o menor CV entre as plataformas de gotículas do mundo, o que garante uma medição altamente paralela e quantitativa. A gotícula femtoliter é estável por pelo menos 24 horas sem contaminação cruzada entre gotículas à temperatura ambiente, o que é valioso para uma medição confiável do curso de tempo. Em relação à biocompatibilidade, conseguimos sintetizar várias proteínas a partir de um DNA modelo de cópia única na gotícula femtoliter, que anteriormente havia sido considerada difícil ou ineficiente29,30. Seria digno de elucidar por que algumas proteínas capazes de ser sintetizadas no FemDA não podem ser sintetizadas em outros sistemas de gotículas. FemDA não foi meramente um avanço técnico, mas também realizou uma medição quantitativa sem precedentes que pode correlacionar o rendimento da proteína (como refletido pela intensidade da fluorescência da gotícula) ao número de moléculas de DNA modelo em cada gotícula. Como resultado, o histograma da intensidade de fluorescência de gotículas do CFPS baseado em FemDA mostrou uma distribuição discreta que pode ser bem encaixada por uma soma de distribuições gaussianas de intervalos de pico a pico iguais. Além disso, a probabilidade de ocorrência de gotículas contendo diferentes números de moléculas de DNA foi perfeita para uma distribuição de Poisson31. Assim, o rendimento diferente de proteínas em cada gotícula pode ser normalizado com base na distribuição discreta. Este recurso crítico nos permite separar as informações de atividade enzimática da intensidade aparente, que ainda não está disponível com outras plataformas de microreatores. Os sistemas de classificação de células/gotículas microfluidas existentes são habilitados em classificação totalmente automática e bons em concentrar amostras, mas às vezes só podem produzir um histograma relativamente amplo ou de cauda longa no aspecto analítico32,33. Nosso sistema FemDA altamente quantitativo e biocompatível estabelece um novo benchmark e um alto padrão analítico no campo do desenvolvimento de microreatores.
Os óleos e surfactantes que poderiam ser usados para a preparação de gotículas ainda são muito limitados34. A combinação de ASAHIKLIN AE-3000 e SURFLON S-386 estabelecida na FemDA é um novo membro do crescente arsenal da interface fisioquímica entre a fase aquosa e a fase13do óleo . A nova interface em FemDA é fisicamente estável, quimicamente inerte e biologicamente compatível com a transcrição complexa, tradução e máquinas de modificação pós-translacional para muitos tipos de proteínas13. Seria bastante atraente encontrar uma proteína que não pode ser sintetizada nas configurações de gotícula. Além disso, a economia de custos dos reagentes é mais evidente no sistema de gotícula femtoliter do que no sistema de reator nanoliter e picoliter35,36. Em particular, muitas vezes haveria um grande volume morto, que é causado principalmente por tubos ou suprimentos externos, em sistemas microfluídicos de geração de droplet, mas não em nosso FemDA. O formato de matriz também é favorecido pela caracterização microscópica repetida e detalhada (semelhante à chamada análise de alto conteúdo) para cada reator37, em vez de apenas um único instantâneo para um objeto em movimento rápido. A escala femtoliter permitiu a integração de mais de um milhão de reatores em uma área do tamanho de um dedo, enquanto o mesmo número de reatores nanoliteres (se existir) requer sobre a área do metro quadrado, o que seria sem dúvida impraticável para fabricar ou usar tal sistema.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropil)trietoxissilano</td><td></td><td></td> Seringa <td></td></tr> de <tr><td>1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grau</td><td>EL: para uso eletrônico.</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser 3D</td><td>Lasertec</td><td>OPTELICS HYBRID</td><td>Outros microscópios semelhantes (por exemplo, Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) também são aplicáveis.</td></tr><tr><td>Seringa de 50 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-50LZ</td><td></td></tr><tr><td>6,8-difluoro-4-metilumbelliferil fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D6567</td><td>Prepare uma solução estoque de 5 mM em dimetilsulfóxido</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Kanto Chemical</td><td>EL grau</td><td>EL: para uso eletrônico. Pureza 99,8%.</td></tr><tr><td>Soprador de ar</td><td>Hozan</td><td>Z-263</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de alumínio</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-24M-02</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de microtubo de alumínio</td><td>BIO-BIK</td><td>AB-136C</td><td></td></tr><tr><td>ASAHIKLIN AE-3000</td><td>AGC</td> <td>(amostra de teste)</td> <td>A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à AGC.</td></tr><tr><td>Limpador BEMCOT PS-2</td><td>Ozu</td><td>028208</td><td></td></tr><tr><td>Punção de biópsia com êmbolo</td><td>Kai</td><td>BPP-10F</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Matsunami Glass</td><td>No. 1 (24 mm e vezes; 32 mm, 0,13 ~ 0,17 mm de espessura)</td> <td>Tamanho personalizado.</td></tr><tr><td>Porta-manchas de vidro</td><td>Nakayama</td><td>803-131-11</td><td></td></tr><tr><td>CRECIA TechnoWipe limpador limpo</td> Papel <td>Nippon Crecia</td><td>C100-M</td><td></td></tr><tr><td>Tapete de corte</td><td>GE Healthcare</td><td>WB100020</td><td></td></tr><tr><td>CYTOP</td><td>AGC</td><td>CTL-816AP</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de desaeração</td><td>Thinky</td><td>AR-100</td><td></td></tr><tr><td>Cortador de mesa</td><td>Roland</td><td>STIKA SV-8</td><td></td></tr><tr><td>Desenvolvedor</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ 300 MIF</td><td>AZ Electronic Materials foi agora adquirida pela Merck. Outros desenvolvedores alcalinos também podem ser aplicáveis, mas devem exigir otimização das condições de desenvolvimento (tempo, temperatura, etc.)</td></tr><tr><td>Fita adesiva dupla face de filme Kapton</td><td>Teraoka Seisakusho</td><td>7602 #25</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Kanto Químico EL</td><td>grau</td><td>EL: para uso eletrônico. Pureza 99,5%.</td></tr><tr><td>Versão de Fiji</td><td></td><td></td><td>: ImageJ 1.51n</td></tr><tr><td>Cortador de cabo plano</td><td>Tokyo-IDEAL</td><td>MT-0100</td><td></td></tr><tr><td>Óleo Fomblin</td><td>Solvay</td><td>Y25 ou Y25 / 6</td><td>A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à Solvay. Fomblin Y25 / 6 é uma alternativa se Y25 não estiver prontamente disponível.</td></tr><tr><td>Placa quente</td><td>COMO UM</td><td>TH-900</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de injeção</td><td>Terumo</td><td>NN-2270C</td><td>22G &times; 70 mm</td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência invertida</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Especificação de epifluorescência, câmera CCD ou sCMOS, palco motorizado, sistema de foco automático e lente objetiva de alta NA são necessários.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Synergy</td><td></td><td>Versão: 4.5</td></tr><tr><td>Alinhador de máscara</td><td>SUSS</td><td>MA-6</td><td>Outros alinhadores de máscara também são aplicáveis, desde que o modo de contato a vácuo esteja disponível.</td></tr><tr><td>Pipeta MICROMAN</td><td>GILSON</td><td>E M250E</td><td>Ponta do pistão capilar: CP250</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Versão Microsoft</td><td></td><td>: 16.16.15</td></tr><tr><td>Mini câmara de vácuo</td><td>COMO UM</td><td>MVP-100MV</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90101</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Amcor</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PCR</td><td>NIPPON Genetics</td><td>FG-021D/SP</td><td></td></tr><tr><td>PLACA DE Petri</td><td>AS ONE</td><td>GD90-15</td><td>Diâmetro 90 mm, altura 15 mm.</td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>AZ Electronic Materials</td><td>AZ P4903</td><td>A AZ Electronic Materials foi agora adquirida pela Merck. AZ P4620 é uma alternativa.</td></tr><tr><td>Leitor de placas</td><td>BioTek</td><td>POWERSCAN HT</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de polietileno</td><td>AS ONE</td><td>6-896-02</td><td>Nome comercial: Saniment.</td></tr><tr><td>Kit de síntese de proteínas in vitro PURExpress</td><td>New England Biolabs</td><td>E6800S ou E6800L</td><td>Para reação de síntese de proteínas sem células.</td></tr><tr><td>Sistema de gravação de íons reativos</td><td>Samco</td><td>RIE-10NR</td><td>Outros sistemas RIE também são aplicáveis, mas devem exigir a otimização das condições RIE (vazão de gás, pressão da câmara, potência de RF, tempo de gravação, etc.)</td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0314S</td><td></td></tr><tr><td>Fita adesiva</td><td>3M</td><td>810-1-18D</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical</td><td>194-09575</td><td>Concentração de 8 M; perigo.</td></tr><tr><td>Revestidor de rotação</td><td>Oshigane</td><td>SC-308</td><td></td></tr><tr><td>SURFLON S-386 surfactante</td><td>AGC</td> <td>(amostra de teste)</td> <td>A amostra de teste grátis pode estar disponível mediante consulta à AGC.</td></tr><tr><td>Elastômero de silicone SYLGARD 184</td><td>Dow</td><td>Sylgard184</td><td>Composição química: polidimetilsiloxano. A proporção de mistura padrão é base: agente de cura = 10 : 1 (m/m).</td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Ideal-tek</td><td>2WF. SA.1 2A</td><td></td></tr><tr><td>Limpador ultrassônico</td><td>AS ONE</td><td>ASU-2M</td><td></td></tr><tr><td>Mandril a vácuo</td><td>Oshigane</td> <td>(Personalizado)</td><td>Material: delrin; estágio de amostra retangular com vários furos (48 furos, cada um com 1 mm de diâmetro); o tamanho é personalizado para caber no tamanho da lamínula (24 mm e vezes; 32 mm).</td></tr></tbody></table>

uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de dna único

A Femtoliter Droplet Array for Massively Parallel Protein Synthesis from Single DNA Molecules

Os avanços na resolução espacial e na sensibilidade de detecção da instrumentação científica possibilitam a aplicação de pequenos reatores para pesquisas biológicas e químicas. Para atender à demanda por microreatores de alto desempenho, desenvolvemos um dispositivo Femtoliter droplet array (FemDA) e exemplificamos sua aplicação em reações de síntese proteica livre de células massivamente paralelas (CFPS). Mais de um milhão de gotículas uniformes foram prontamente geradas dentro de uma área do tamanho de um dedo usando um protocolo de vedação de óleo de duas etapas. Cada gotícula estava ancorada em uma microcâmara femtoliter composta por um fundo hidrofílico e uma parede lateral hidrofóbica. A estrutura hidrofóbica híbrida e os óleos de vedação dedicados e surfactantes são cruciais para manter a solução aquosa femtoliter no espaço femtoliter sem perda de evaporação. A configuração femtoliter e a estrutura simples do dispositivo FemDA permitiram o consumo mínimo de reagentes. A dimensão uniforme dos reatores de gotículas tornou as medições quantitativas e de curso de tempo em larga escala convincentes e confiáveis. A tecnologia FemDA correlacionou o rendimento proteico da reação do CFPS com o número de moléculas de DNA em cada gotícula. Agilizamos os procedimentos sobre a microfabização do dispositivo, a formação das gotículas femtoliter e a aquisição e análise dos dados de imagem microscópica. O protocolo detalhado com o baixo custo otimizado de execução torna a tecnologia FemDA acessível a todos que possuem instalações padrão de limpeza e um microscópio de fluorescência convencional em seu próprio lugar.

O processo de microfabricação consiste em limpeza de substratos, funcionalização de superfície, revestimento CYTOP, fotolitografia, gravura a seco, despojo fotoresist e limpeza final. É importante ressaltar que o protocolo apresentado permitiu a remoção completa do polímero CYTOP hidrofóbico dentro dos microchambers Figura 3A, produzindo uma estrutura hidrofóbica-hidrofóbica altamente paralela em um substrato de vidro de cobertura padrão. Com o auxílio do protocolo de vedação de óleo, verifi...

O objetivo geral do protocolo é preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter ordenadas, uniformes, estáveis e biocompatíveis em um substrato planar de 1 cm2 que pode ser usado para síntese proteica sem células.

Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Advances in spatial resolution and detection sensitivity of scientific instrumentation make it possible to apply small reactors for biological and ...

Mais de um milhão de uniformes das gotículas são produzidos no substrato do tamanho do dedo. E moléculas de DNA simples são distribuídas aleatoriamente em cada gota. O rendimento da proteína é proporcional ao número de moléculas em uma gotícula.Nossa técnica pode ser usada para uma medição rápida e quantitativa da atividade enzimática sem expressão e purificação de proteínas complicadas. Para começar, coloque um copo de tampa em um rack de coloração e coloque o rack em oito hidróxido de sódio molar. Sonicar o vidro de cobertura e o rack de coloração por 15 minutos em temperatura ambiente.Remova o rack de coloração do hidróxido de sódio e enxágue o vidro da tampa com água 10 vezes. Seque o vidro da tampa com uma arma de ar. Em seguida, asse e seque o copo de cobertura em uma placa quente a 200 graus Celsius por cinco minutos.Prepare solução de 0,05% aminosilano. Mergulhe o vidro de cobertura nesta solução e incuba-o por uma hora em temperatura ambiente. Enxágüe o vidro da tampa cinco vezes em água pura.Em seguida, seque o vidro da tampa usando uma arma de ar. Asse na placa quente a 80 graus Celsius por cinco minutos. Coloque o substrato de vidro de cobertura em um mandril de vácuo p

a-femtoliter-droplet-array-for-massively-parallel-protein-synthesis

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Apresenta-se um método de microfluidos para a expressão de arrays de proteínas. O dispositivo consiste de milhares de câmaras de reacção controladas por válvulas de micro-mecânicos. O dispositivo micro é acoplado a uma biblioteca de genes microarray-impresso. Estes genes são transcritos e traduzidos em seguida, on-chip, resultando numa matriz de proteína pronta para o uso experimental.

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Concepção de fármacos com base Estrutura desempenha um papel importante no desenvolvimento de medicamentos. Prosseguindo alvos múltiplos em paralelo aumenta a chance de sucesso para a descoberta de chumbo. O seguinte artigo destaca como o Seattle Center Structural Genomics para Doenças Infecciosas utiliza uma abordagem multi-alvo para determinação da influenza A subunidade PB2 gene-to-estrutura.

Abordagem de processamento paralelo multi-alvo para Gene-a-estrutura Determinação da polimerase da gripe PB2 Subunidade

Este protocolo descreve o fabrico de uma grande escala, o ADN ou o anticorpo matriz bidimensional multiplexado, com aplicações potenciais em estudos de sinalização de células e detecção de biomarcador.

Flow-padrão Fabrication guiada de alta densidade Barcode Antibody Microarray

Aqui, um fluxo de trabalho automatizado para realizar a montagem de "dispositivo" modular do DNA usando um método de montagem clonagem de DNA modular em robôs de manipulação de líquido é apresentado. O protocolo usa uma ferramenta de software intuitivo para gerar picklists líquido manipulador para combinatória DNA dispositivo biblioteca geração, que demonstramos usando duas plataformas de manipulação de líquidos.

Robótico líquido manipulação montagem de dispositivos modulares DNA automática

Aqui nós apresentamos gotículas endereçável microarrays (ADMs), um método de matriz com base gota capaz de determinar a abundância absoluta de proteínas em células únicas. Podemos demonstrar a capacidade de ADMs caracterizam a heterogeneidade na expressão do tumor supressor p53 de proteína em uma linhagem de células cancerosas humanas.

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Este trabalho fornece um método para a fabricação de plataformas baseadas em gotículas microfluidic e a aplicação de microesferas de poliacrilamida para amplificação por PCR-microesfera. O método de PCR-microesfera torna possível obter single-stranded DNA amplicons sem separar o DNA de cadeia dupla.

Uma abordagem Microfluidic gotículas e amplificação por PCR-microesfera para Single-Stranded DNA Amplicons

Este protocolo detalha as etapas, custos e equipamentos necessários para gerar Escherichia coli-com base em extratos de células e implementar em vitro reações de síntese de proteínas dentro de 4 dias ou menos. Para aproveitar a natureza flexível desta plataforma para aplicações de amplas, podemos discutir as condições de reação que podem ser adaptadas e otimizadas.

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Neste artigo, apresentamos e discutimos novos desenvolvimentos na síntese e aplicações de Microarrays de ácidos nucleicos fabricados in situ. Especificamente, mostramos como os protocolos de síntese de DNA podem ser estendidos ao RNA e como os microarrays podem ser usados para criar bibliotecas de ácidos nucleicos recuperáveis.

Microarrays de DNA e RNA de alta densidade-síntese fotolitográfica, hibridação e preparação de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos

Descrevemos a engenharia de uma nova polimerase T7 RNA com DNA para regular reações de transcrição in vitro. Discutimos os passos para a síntese e caracterização proteica, validamos a regulação transcricional de prova de conceito e discutimos suas aplicações em computação molecular, diagnóstico e processamento de informações moleculares.

Dna-Tethered RNA Polymerase para Transcrição In vitro Programável e Computação Molecular

O estudo descreve um protocolo para a criação de grandes (μg-mg) quantidades de DNA para campanhas de triagem de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sem clonagem ou uso de células vivas. O modelo mínimo é digerido e circularizado e, em seguida, amplificado usando amplificação do círculo de rolamento isotérmico. Reações de expressão livre de células poderiam ser realizadas com o produto não purificado.

Métodos rápidos e enzimáticos para amplificação de modelos mínimos e lineares para prototipagem de proteínas usando sistemas livres de células

Aprenda a preparar mais de um milhão de gotículas femtoliter uniformes em substrato planar para síntese de proteínas sem células. Este método permite medição rápida e quantitativa da atividade enzimática sem etapas complexas de purificação.

Uma matriz de gotícula femtoliter para síntese de proteínas massivamente paralelas de moléculas de DNA único

Explorar mais vídeos