Abordagem estereotática angular adaptável para técnicas versáteis de neurociência

Este protocolo é significativo, pois é um procedimento adaptável e estereotáxico que pode ser utilizado em camundongos e ratos e pode ser aplicado a muitas novas técnicas neurocientíficas. A principal vantagem desse procedimento estereotáxico adaptável é sua capacidade de ser usado para atingir regiões desafiadoras e de difícil acesso do cérebro. Demonstrando o procedimento estará Chelsea Faber, uma jovem e talentosa pesquisadora de pós-doutorado no laboratório.

Depois de confirmar que a estrutura e o micromanipulador foram calibrados, coloque o medidor de altura central no soquete da placa de base do suporte da cabeça. Prenda o osciloscópio centralizador no porta-ferramentas e mire o osciloscópio. Ajuste a posição do micromanipulador até que a mira esteja alinhada e focada na mira do medidor e coloque as barras auriculares nos suportes de forma que as linhas indicadoras em ambos os lados fiquem em zero.

Use os botões médio-lateral e ântero-posterior no suporte da cabeça para centralizar as barras auriculares nos planos X e Y acima da mira do medidor de altura central. Para alinhar a posição da barra auricular no eixo Z, remova as barras auriculares do suporte e remova o medidor de altura central. Em seguida, recoloque as barras auriculares e centralize novamente as barras em zero.

Em seguida, mire novamente no osciloscópio e use os botões de deslocamento vertical e inclinação coronal, respectivamente, para abaixar e girar as barras auriculares até que a mira do osciloscópio permaneça centralizada entre as barras auriculares durante a rotação coronal. Para alinhar o eixo central de rotação para coordenadas angulares, prenda o osciloscópio de centralização no porta-ferramentas e posicione o micromanipulador na coordenada calculada. Observe que a coordenada direita/esquerda para o implante angular corresponde ao comprimento do lado A.Olhando para baixo no escopo, marque esta coordenada para representar o ponto em que a cânula entrará no cérebro, uma vez que a cabeça é girada.

Reposicione o micromanipulador sobre a linha média e use o botão de inclinação coronal para girar a cabeça para o ângulo calculado. Se a mira do osciloscópio não estiver alinhada com a marca de referência, use o botão de deslocamento vertical para ajustar a posição da cabeça no eixo Z até que a mira se alinhe o mais próximo possível da marca. Neste ponto, o ponto arbitrário de rotação deve estar alinhado com o centro de rotação da estereotaxa.

Gire a cabeça de volta para a posição coronal de zero grau antes de prosseguir para as etapas subsequentes de perfuração e microinjeção. Depois de realizar a microinjeção, retorne a cabeça para a posição de nível zero grau e use uma furadeira manual para colocar dois orifícios, anteriormente, e dois orifícios, posteriormente, longe o suficiente dos orifícios de rebarbas de coordenadas angulares para acomodar a parte da ponteira da fibra óptica que fica acima do crânio. Quando todos os orifícios tiverem sido perfurados, use uma pequena chave de fenda para inserir os parafusos ósseos o mais suavemente possível, de modo que eles fiquem firmes no crânio sem penetrar no cérebro.

Prenda uma cânula de fibra óptica no suporte da cânula e coloque o suporte da cânula no suporte da ferramenta. Gire a cabeça para o ângulo calculado, observando que as coordenadas do micromanipulador não se aplicam à nova ferramenta. Use o centro dos orifícios de rebarbas angulares como alvo de implantação.

Abaixe a fibra óptica até que ela toque a dura-máter no centro do orifício da rebarba e zere o micromanipulador no eixo Z. Abaixe lentamente a fibra óptica até a coordenada angular ventral dorsal e, em seguida, use gel de cianoacrilato para conectar a ponteira de fibra óptica aos parafusos de ancoragem ipsilaterais. Use uma ponta de micropipeta para aplicar um acelerador.

Assim que o gel estiver completamente endurecido, solte suavemente e levante o suporte da cânula até que esteja livre da ponteira. Implante a segunda fibra óptica na coordenada angular contralateral e, em seguida, nivele a cabeça. Para segurança extra, use o gel de cianoacrilato e o acelerador para fazer uma conexão adicional entre as duas cânulas de fibra óptica angulares e aplique uma quantidade pequena e relativamente fina de cimento dentário na superfície do crânio, tomando cuidado para cobrir completamente os parafusos de ancoragem e a base das cânulas de fibra óptica.

Para interrogar o papel dos neurônios do núcleo ventromedial do hipotálamo no controle glicêmico, nesta análise representativa, uma abordagem estereotáxica padrão, não angulada, foi utilizada para a microinjeção bilateral de um canal inibitório do vírus da rodopsina no núcleo ventromedial. Dada a proximidade do núcleo ventromedial com a linha média, as restrições de espaço não permitiram um implante não angulado de fibras bilaterais, necessitando do desenvolvimento de uma estratégia cirúrgica para implantar precisamente as fibras ópticas em um ângulo. As coisas mais importantes a serem lembradas são simplesmente ser paciente e não se apressar, pois ser consistente e preciso com suas atribuições de coordenadas é fundamental para o sucesso.

Este procedimento pode ser adaptado e aplicado a qualquer método neurocientífico que exija microinjeção ou implantação no cérebro de roedores, incluindo abordagens de quimiogenética, optogenética e fotometria de fibra.