Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

Este protocolo pode fornecer informações especialmente resolvidas sobre a dinâmica conformacional da proteína. O que pode ajudar a identificar regiões funcionalmente importantes na proteína de interesse. Esta técnica investiga a dinâmica conformacional da proteína em condições quase nativas.

Sem a necessidade de marcação de proteínas usando quantidade nanomolar de material para cada reação. Comece preparando amostras de referência não deuteradas para a proteína de interesse em triplicata, em tubos de 500 microlitros. Tempere as amostras com o volume apropriado de tampão de têmpera por tubo para obter uma leitura do medidor de pH de 2,5.

Congelar rapidamente as amostras em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius até sua análise. Em seguida, analise as amostras de referência da enzima prototada usando um fluxo de trabalho de espectrometria de massa de cromatografia líquida de baixo para cima de acordo com protocolos padrão. Analisar os dados brutos de espectrometria de massa no Programa de Software Proteômico apropriado.

Navegue até Bibliotecas e bancos de dados de sequência de proteínas para importar a sequência de aminoácidos da proteína de interesse. Insira um nome para a sequência de proteína de interesse e importe a sequência de proteína no formato FASTA. Para definir os parâmetros de processamento no menu Biblioteca, selecione Electrospray MSE como o tipo de aquisição de dados.

No campo Bloquear massa para carga 2, insira 785,8426 para a taxa de carga mestre para os dois íons mais de glucano uma fibra sem peptídeo B e clique em Concluir. Para definir os parâmetros do fluxo de trabalho, selecione Electrospray MSE para o tipo de pesquisa. No cabeçalho Workflow and Database search query, selecione a proteína do banco de dados criada no campo Banco de dados e altere o reagente de resumo primário para não específico.

Para limpar o campo de reagente modificador fixo, segure o botão de controle enquanto clica em Carbamidometil C.To especifique o diretório de saída, selecione Opções, Configuração de automação e Identifique E.Em seguida, marque as caixas de saída 3D e 3D do ápice e saída de contabilidade de íons. E especifique o diretório desejado. Para processar os dados de amostra referenciados, clique com o botão direito do mouse na placa de microtitulação para criar uma nova placa.

Clique com o botão esquerdo do mouse em um poço e arraste para três outros poços para destacar um poço para cada amostra referenciada. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione Adicionar dados brutos. Na janela, navegue até o diretório que contém os três arquivos referenciados e selecione todos os três arquivos ao mesmo tempo.

Clique em Avançar e selecione os parâmetros de processamento definidos. Clique em Avançar novamente e selecione os parâmetros de fluxo de trabalho definidos. Em seguida, clique em Concluir.

Depois que os dados brutos, os parâmetros de processamento e os parâmetros de fluxo de trabalho forem atribuídos a cada poço na placa, os poços ficarão azuis. Selecione os poços, clique com o botão direito do mouse e selecione Processar dados brutos mais recentes. Para acompanhar o processamento dos dados, clique no canto inferior direito da janela.

Quando nenhum trabalho a ser executado aparecer, o processamento estará concluído e os poços na placa de microtitulação ficarão verdes. Clique com o botão direito do mouse nos poços e selecione Exibir resultados do fluxo de trabalho. Uma janela separada será aberta para cada arquivo de dados referenciado.

Inspecione os dados para garantir que a maioria dos sinais de espectrometria de massa nos dados da amostra referenciada foram mapeados com sucesso para os peptídeos previstos a partir da digestão in silico da proteína de interesse. Os peptídeos correspondentes aparecerão em azul no espectro de saída. Clique duas vezes no filtro ok e verifique se a porcentagem de cobertura é maior que 99%Importe a saída do software proteômico para o software de processamento de troca de deutério de hidrogênio para obter limites adicionais.

E clique em Dados e importar resultados do PLGS. Clique no ícone Adicionar e navegue até o diretório apropriado para selecionar os arquivos de dados processados. Clique em Avançar e defina o mínimo de íons consecutivos como maior ou igual a dois.

O erro de massa para cinco partes por milhão. E o limite do arquivo para três e clique em Concluir. Para conduzir reações de troca de deutério de hidrogênio, tampão de têmpera alíquota em tubos de 500 microlitros.

E centrifugue brevemente para transferir todo o tampão de têmpera para o fundo de cada tubo. Coloque os tubos contendo a solução temperada no gelo. Em seguida, pré-misture todos os componentes da reação deuterada em um tubo separado de 1,5 mililitro.

Em seguida, transfira a mistura de reação para um banho-maria com temperatura controlada a 25 graus Celsius para uma incubação de 10 minutos. Adicione enzima aos componentes da reação deuterada para iniciar a reação de troca. Misture bem o conteúdo da reação pipetando para cima e para baixo.

Nos pontos de tempo de troca experimentais apropriados, remover alíquotas de 50 microlitros de cada reação de troca de deutério de hidrogênio. E misture as reações de forma rápida e uniforme com uma alíquota de tampão de têmpera gelada em tubos individuais de 500 microlitros. Em seguida, tampe imediatamente os tubos para congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.

Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para análise. Depois de descongelar as amostras congeladas, analise as amostras de referência de enzimas deuteradas usando o mesmo fluxo de trabalho de espectrometria de massa de cromatografia líquida de baixo para cima desenvolvido para as amostras de referência não deuteradas. Depois de coletar os dados LCMS para as amostras deuteradas, importe os dados para o projeto de troca de deutério de hidrogênio criado anteriormente para processamento de dados.

E clique em Novo estado e Nova exposição para definir os estados bioquímicos e os tempos de exposição ao deutério, respectivamente, pertinentes à análise. Clique em Nova matéria-prima para selecionar os arquivos de dados de troca de deutério de hidrogênio a serem analisados. E atribua os tempos de troca e o estado bioquímico apropriados a cada arquivo de dados brutos importado.

Para análise e visualização dos dados, selecione o primeiro peptídeo na lista de peptídeos e abra o gráfico espectral empilhado no menu Visualizações. Clique com o mouse para atribuir e cancelar a atribuição de bastões conforme necessário para garantir que a distribuição de isótopos adequada tenha sido localizada nos dados. E que cada pico de isótopo foi atribuído.

Para verificar as atribuições de stick para cada estado de carga, alterne o estado de carga na parte superior da janela de gráfico espectral empilhado. Para verificar o desvio padrão dos valores de captação de deutério peptídico no menu Visualizações, selecione o mapa de cobertura. Que exibe cada peptídeo na lista de peptídeos mapeados ao longo da sequência de aminoácidos da proteína de interesse.

Pinte os peptídeos de acordo com o desvio padrão relativo e pesquise visualmente no mapa por peptídeos discrepantes com o alto desvio padrão relativo. Clique nos peptídeos outliers no mapa de cobertura para preencher os gráficos espectrais empilhados e a janela do visualizador de dados com o peptídeo alvo. Exiba a diferença de interesse no mapa de cobertura e clique com o botão direito do mouse no mapa para exportar os dados da diferença para um arquivo CSV.

Importe a diferença, os dados do estado e o arquivo PDB da proteína de interesse para o Deuteros. E selecione o intervalo de confiança de 99% e Ativar soma e processe os dados. Em seguida, em pi mol, selecione Exportar, Absorção e Exportar para gerar um script PyMOL para mapear as regiões de diferença de troca significativa na estrutura PDB da proteína de interesse no software PyMOL.

Esses cromatogramas representativos de íons totais para três amostras de referência da peptídeo sintetetase lambda Hal-M2 mostram as mudanças dependentes do tempo na soma de todas as contagens de íons em todos os valores da relação massa-carga incluídos na varredura espectral de massa. A forma e a intensidade do perfil do cromatograma de íons totais devem ser semelhantes. Indicando que a digestão proteolítica de Hal-M2 é reprodutível.

E é de eficiência semelhante em todas as três amostras de referência. Os espectros de massa em um determinado intervalo de tempo também devem ser semelhantes. Fornecendo confiança de que peptídeos semelhantes estão presentes em cada amostra e estão aludindo em momentos semelhantes da coluna C18.

A maioria dos peptídeos nas amostras trocadas de deutério deve exibir mudanças óbvias em suas distribuições isotópicas em direção a valores mais altos de relação massa-carga. Por exemplo, esses dados indicam que uma fração substancial do marcador de deutério estava sendo mantida durante todo o curso da coleta de dados de têmpera ácida, digestão de pepsina e espectrometria de massa por cromatografia líquida. Após a caracterização das propriedades bioquímicas da enzima, conforme demonstrado, resultados representativos de espectrometria de massa de troca de deutério de hidrogênio como esses podem ser gerados.

Para ilustrar a ligação do peptídeo precursor Hal-A2 ao Hal-M2 AMP, complexo PMP. As reações de troca de deutério de hidrogênio devem ser preparadas e extintas de maneira consistente. E você deve ser metódico ao determinar os valores de troca de deutério para vários peptídeos detectados.

A espectrometria de massa de troca de deutério de hidrogênio fornece informações em nível de peptídeo e alterações conformacionais dinâmicas de proteínas. A relevância funcional de qualquer troca de deutério de hidrogênio deve ser validada para o Meter Genesis. E ensaios de atividade ortogonal.