Name: Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Aprenda a usar HDX-MS para investigar a dinâmica conformacional de sintetases de lantipeptídeos em condições próximas às nativas. Este método identifica regiões funcionalmente importantes sem necessidade de marcação.

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Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá, pela Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, pela Canadian Foundation for Innovation e pela McGill University.

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<li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li>
</ol>

Não temos nada para revelar.

O fluxo de trabalho HDX-MS apresentado neste protocolo fornece uma plataforma notavelmente robusta para mapear a distribuição espacial de elementos estruturalmente dinâmicos em proteínas e para investigar como essas dinâmicas mudam em resposta à perturbação (ligação de ligante, mutagênese enzimática, etc.). O HDX-MS possui várias vantagens distintas sobre outras abordagens de biologia estrutural que são comumente usadas para investigar a dinâmica conformacional. Mais notavelmente, apenas pequenas quantidades de proteína ...

Proteínas são moléculas estruturalmente dinâmicas que amostram diferentes conformações em escalas de tempo que vão desde vibração de ligação em escala femtosegundo até rearranjos de domínios proteicos inteiros que podem ocorrer ao longo de muitos segundos1. Estas flutuações conformais são frequentemente aspectos críticos da função enzima/proteína. Por exemplo, alterações conformais induzidas pela ligação de ligasão são muitas vezes criticamente importantes para a modulação da função enzimática, seja organizando resíduos ativos do local necessários para a catálise, definindo locais de ligação de substrato em mecanismos cinéticos sequenciais, protegendo intermediários reativos do ambiente ou modulando a função enzimática através de redes alostêmicas. Estudos recentes também mostraram que a dinâmica conformacional pode ser conservada ao longo da evolução e que perturbações a movimentos moleculares conservados podem ser correlacionadas com mudanças na especificidade do substrato e no surgimento de novas funções enzimárias2,3.
Nos últimos anos, a espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) tem emergido rapidamente como uma técnica poderosa para sondar como as paisagens conformais da proteína respondem a perturbações como ligadura ou mutagênese4,5,6,7. Em um experimento típico hdx-ms(Figura 1), uma proteína de interesse é colocada em tampão preparado em D2O, que desencadeia a substituição de prótons trocaveis de solventes por deuteria. A taxa de troca da moiety amida dos títulos de peptídeo depende fortemente do pH, da sequência local de aminoácidos, e do ambiente estrutural local da amida8. Amidas que estão engajadas em interações de ligação de hidrogênio (como as presentes em α-helices e β-folhas) trocam mais lentamente do que em meios em regiões não estruturadas da proteína que são expostas a solventes a granel. Assim, a extensão da captação do deutério é um reflexo da estrutura da enzima. Enzimas que são conformamente dinâmicas, ou que passam por transições estruturais sobre ligação ligante, seriam esperadas para produzir uma resposta HDX mensurável.
A base mecanicista para a taxa de câmbio lenta de uma amida estruturada é mostrada na Figura 25,8,9. Para se submeter ao HDX, a região estruturada deve primeiro amostrar transitoriamente uma conformação desdobrada, de tal forma que as moléculas de solvente que catalisam a troca de HDX através de um mecanismo químico ácido/base específico, tenham acesso ao amide tromável. Em última análise, as magnitudes relativas da taxa de câmbio química (kchem) e as taxas de dobra e reagem(kopen e kclose) determinam a taxa HDX medida no experimento5,8. A partir deste modelo cinético simples, é claro que a extensão da absorção do deutério refletirá a dinâmica conformacional subjacente (definida por kopen e kclose). A maioria dos experimentos HDX-MS são realizados em um fluxo de trabalho de baixo para cima onde, após a reação de troca, a proteína de interesse é digerida em peptídeos e a absorção do deutério por cada peptídeo é medida como um aumento na massa7. Dessa forma, o HDX-MS permite que perturbações para a dinâmica conformacional enzimária sejam mapeadas na escala espacial local dos peptídeos, permitindo que o pesquisador avalie como a perturbação altera a dinâmica em diferentes regiões da enzima de interesse.
As vantagens da abordagem HDX-MS para a dinâmica estrutural proteica elucidação são inúmeras. Em primeiro lugar, o método pode ser realizado com pequenas quantidades de proteína nativa ou em complexos proteicos em sistemas com estrutura quaternária10. Não é mesmo necessário que a preparação da enzima usada no ensaio seja altamente purificada11,12, desde que o fluxo de trabalho HDX-MS de baixo para cima forneça um número suficiente de peptídeos confiantemente identificados que cobrem a sequência proteica de interesse. Além disso, o HDX-MS pode fornecer informações sobre a dinâmica conformacional em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem de proteínas específicas do local, como seria usado em estudos de fluorescência de moléculas únicas13, e não há limite de tamanho para o complexo proteico ou proteico que possa ser investigado (o que torna desafiadoras abordagens como ressonância magnética nuclear [NMR] espectroscopia)7,14. Finalmente, métodos HDX-MS resolvidos pelo tempo podem ser empregados para estudar proteínas intrinsecamente desordenadas, que são difíceis de estudar com cristalografia de raios-X15,16,17,18. A principal limitação do HDX-MS é que os dados são de baixa resolução estrutural. Os dados HDX-MS são úteis para apontar para onde a dinâmica conformacional está mudando e para revelar alterações conformais acopláveis, mas muitas vezes não fornecem muita visão do mecanismo molecular preciso que conduz a mudança observada. Avanços recentes na combinação de métodos de dissociação de captura de elétrons com dados de proteína HDX-MS mostraram-se promissores para mapear locais de troca para resíduos de aminoácidosúnicos 19,mas estudos bioquímicos e estruturais de acompanhamento ainda são frequentemente necessários para fornecer clareza aos modelos estruturais encaminhados pelos dados hdx-MS.
Abaixo, um protocolo detalhado para o desenvolvimento de um ensaio HDX-MS é apresentado20. Os protocolos de preparação da amostra apresentados abaixo devem ser geralmente aplicáveis a qualquer proteína que exaque boa solubilidade em tampões aquosos. Métodos de preparação de amostras mais especializados e fluxos de trabalho HDX-MS estão disponíveis para proteínas do que precisam ser avaliados na presença de detergentes ou fosfolipídios21,22,23,24. As configurações instrumentais para a coleta de dados HDX-MS são descritas para um espectrômetro de massa quadrúpole de alta resolução acoplado ao sistema de cromatografia líquida. Dados de complexidade e resolução semelhantes poderiam ser coletados em qualquer um dos vários sistemas de espectrometria de massa líquida (LC-MS) disponíveis comercialmente. Aspectos-chave do processamento de dados usando um pacote de software comercialmente disponível também são fornecidos. Também apresentamos diretrizes para coleta e análise de dados que são consistentes com as recomendações feitas pela comunidade HDX-MS mais ampla12. O protocolo descrito é usado para estudar as propriedades estruturais dinâmicas do HalM2, uma sintetização lanthipeptide que catalisa a maturação multistep de um produto natural de peptídeo antimicrobiano20. Ilustramos como o HDX-MS pode ser usado para revelar sites de ligação de substratos e propriedades alotésicas que iludiram a caracterização anterior. Vários outros protocolos sobre proteína HDX-MS foram publicados nos últimos anos25,26. Juntamente com o presente trabalho, essas contribuições anteriores devem proporcionar ao leitor alguma flexibilidade no design experimental.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[glu-1]-fibrinopeptídeo B (Glu-Fib)</td><td>BioBasic</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mL Amicon Ultracel 10k dispositivo de filtração centrífuga (Millipore)</td><td>Milipore Sigma</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrila</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>SIGMA</td><td>A2647-25MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>SIGMA</td><td>a2383-5G</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>ALDRICH</td><td>435767-100G</td><td></td></tr><tr><td>ácido fórmico</td><td>Thermo Fisher</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>guanidina-HCl</td><td>VWR</td><td>97063-764</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>SiGMA-Aldrich</td><td>63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto</td> <td>de potássioBioBasic</td><td>PB0440</td><td></td></tr> fosfato de potássio O <tr>peptídeo <td>de T012500</td> de<td>cloridrato de TCEP</td><td></td> BioBasic PB0445 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> foi sintetizado mediante solicitação<tr><td>Nome do Material/Equipamento</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deuteros</td><td>Andy M C Lau, et al</td><td>versão 1.08</td><td></td></tr><tr><td>DynamX</td><td>Waters</td><td>versão 3.0</td><td></td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters</td><td>versão 4.1</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lynx Global Server (PLGS)</td><td>Waters</td><td>versão 3.0.3</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>versão 2.2.2</td><td></td></tr><tr><td>Nome do Material/ Equipamento</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários/Descrição</td></tr><tr><td>Instrumento e equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C18 Coluna analítica</td><td>Waters</td><td>186002346</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pré-coluna</td><td>Waters</td><td>186003978</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HDX Manager</td><td>Eletrodo</td> de pH de microponta Waters <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>13-620-291</td><td></td></tr><tr><td>Waters Enzymate BEH coluna ou solução de pepsina</td><td>Waters</td><td>186007233</td><td></td></tr><tr><td>Waters Synapt G2-Si</td><td>Águas</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (hdx-ms) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério (HDX-MS) é um método poderoso para a caracterização biofísica de alterações conformacionais enzimáticos e interações entre enzimas enzimistas. Entre seus muitos benefícios, o HDX-MS consome apenas pequenas quantidades de material, pode ser realizado em condições próximas de nativos sem a necessidade de rotulagem enzimada/substrato, e pode fornecer informações espacialmente resolvidas sobre a dinâmica conformacional enzimático– mesmo para grandes enzimas e complexos multiproteínas. O método é iniciado pela diluição da enzima de interesse em tampão preparado em D2O. Isso desencadeia a troca de protium em peptídeos (N-H) com deutério (N-D). Nos pontos de tempo de troca desejados, as alíquotas de reação são saciadas, a enzima é proteolisada em peptídeos, os peptídeos são separados por cromatografia líquida de ultra-desempenho (UPLC), e a mudança na massa de cada peptídeo (devido à troca de hidrogênio por deutério) é registrada pela MS. A quantidade de absorção de deutério por cada peptídeo depende fortemente do ambiente local de ligação de hidrogênio desse peptídeo. Peptídeos presentes em regiões muito dinâmicas do deutério de troca de enzimas muito rapidamente, enquanto peptídeos derivados de regiões bem ordenadas passam por troca muito mais lentamente. Desta forma, a taxa HDX relata a dinâmica conformacional da enzima local. Perturbações aos níveis de absorção de deutério na presença de diferentes ligantes podem então ser usadas para mapear sites de ligação de ligantes, identificar redes alusicais e entender o papel da dinâmica conformacional na função enzimática. Aqui, ilustramos como usamos o HDX-MS para entender melhor a biossíntese de um tipo de peptídeos naturais chamados lanthipeptides. Lanthipeptídeos são peptídeos geneticamente codificados que são modificados pós-translacionalmente por enzimas grandes, multifuncionais e conformacionalmente dinâmicas que são difíceis de estudar com abordagens tradicionais de biologia estrutural. O HDX-MS fornece uma plataforma ideal e adaptável para investigar as propriedades mecanicistas desses tipos de enzimas.

É necessário avaliar a qualidade da digestão proteolítica e a reprodutibilidade do fluxo de trabalho para cada conjunto de injeções amostrais. Assim, antes de realizar ensaios HDX-MS, é essencial estabelecer condições efetivas para a proteólise da proteína de interesse, para a separação de peptídeos utilizando cromatografia líquida de fase inversa e mobilidade de íons de fase de gás, e para a detecção de peptídeos utilizando EM. Para isso, as amostras de referência para a proteína de interesse (coletada na ausência de de...

As sintetizações lanthipeptide catalisam reações multistep durante a biossíntese de produtos naturais de peptídeos. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho contínuo, de baixo para cima, de espectrometria de massa de troca de hidrogênio -deutério (HDX-MS) que pode ser empregado para estudar a dinâmica conformacional das sintetizações de lanthipeptídeo, bem como outras enzimas semelhantes envolvidas na biossíntese de produtos naturais peptídeos.

Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Este protocolo pode fornecer informações especialmente resolvidas sobre a dinâmica conformacional da proteína. O que pode ajudar a identificar regiões funcionalmente importantes na proteína de interesse. Esta técnica investiga a dinâmica conformacional da proteína em condições quase nativas.Sem a necessidade de marcação de proteínas usando quantidade nanomolar de material para cada reação. Comece preparando amostras de referência não deuteradas para a proteína de interesse em triplicata, em tubos de 500 microlitros. Tempere as amostras com o volume apropriado de tampão de têmpera por tubo para obter uma leitura do medidor de pH de 2,5.Congelar rapidamente as amostras em nitrogênio líquido para armazenamento a menos 80 graus Celsius até sua análise. Em seguida, analise as amostras de referência da enzima prototada usando um fluxo de trabalho de espectrometria de massa de cromatografia líquida de baixo para cima de acordo com protocolos padrão. Analisar os dados brutos de espectrometria de massa no Programa de Software Proteômico apropriado.Navegue até Bibliotecas e bancos de dados de sequência de proteínas para importar a sequência de aminoácidos da proteína de interesse. Insira um nome para a sequência de proteína de interesse e importe a sequência de proteína no formato FASTA. Para definir os parâmetros de processamento no menu Biblioteca, selecione Electrospray MSE como o tipo de aquisição de dados.No campo Bloquear massa para carga 2, insira 785,8426 para a taxa de carga mestre para os dois íons mais de glucano uma fibra sem peptídeo B e clique em Concluir. Para definir os parâmetros do fluxo de trabalho, selecione Electrospray MSE para o tipo de pesquisa. No cabeçalho Workflow and Database search query, selecione a proteína do banco de dados criada no campo Banco de dados e altere o reagente de resumo primário para não específico.Para limpar o campo de reagente modificador fixo, segure o botão de controle enquanto clica em Carbamidometil C.To especifique o diretório de saída, selecione Opções, Configuração de automação e Identifique E.Em seguida, marque as caixas de saída 3D e 3D do ápice e saída de contabilidade de íons. E especifique o diretório desejado. Para processar os dados de amostra referenciados, clique com o botão direito do mouse na placa de microtitulação para criar uma nova placa.Clique com o botão esquerdo do mouse em um poço e arraste para três outros poços para destacar um poço para cada amostra referenciada. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione Adicionar dados brutos. Na janela, navegue até o diretório que contém os três arquivos referenciados e selecione todos os três arquivos ao mesmo tempo.Clique em Avançar e selecione os parâmetros de processamento definidos. Clique em Avançar novamente e selecione os parâmetros de fluxo de trabalho definidos. Em seguida, clique em Concluir.Depois que os dados brutos, os parâmetros de processamento e os parâmetros de fluxo de trabalho forem atribuídos a cada poço na placa, os poços ficarão azuis. Selecione os poços, clique com o botão direito do mouse e selecione Processar dados brutos mais recentes. Para acompanhar o processamento dos dados, clique no canto inferior direito da janela.Quando nenhum trabalho a ser executado aparecer, o processamento estará concluído e os poços na placa de microtitulação ficarão verdes. Clique com o botão direito do mouse nos poços e selecione Exibir resultados do fluxo de trabalho. Uma janela separada será aberta para cada arquivo de dados referenciado.Inspecione os dados para garantir que a maioria dos sinais de espectrometria de massa nos dados da amostra referenciada foram mapeados com sucesso para os peptídeos previstos a partir da digestão in silico da proteína de interesse. Os peptídeos correspondentes aparecerão em azul no espectro de saída. Clique duas vezes no filtro ok e verifique se a porcentagem de cobertura é maior que 99%Importe a saída do software proteômico para o software de processamento de troca de deutério de hidrogênio para obter limites adicionais.E clique em Dados e importar resultados do PLGS. Clique no ícone Adicionar e navegue até o diretório apropriado para selecionar os arquivos de dados processados. Clique em Avançar e defina o mínimo de íons consecutivos como maior ou igual a dois.O erro de massa para cinco partes por milhão. E o limite do arquivo para três e clique em Concluir. Para conduzir reações de troca de deutério de hidrogênio, tampão de têmpera alíquota em tubos de 500 microlitros.E centrifugue brevemente para transferir todo o tampão de têmpera para o fundo de cada tubo. Coloque os tubos contendo a solução temperada no gelo. Em seguida, pré-misture todos os componentes da reação deuterada em um tubo separado de 1,5 mililitro.Em seguida, transfira a mistura de reação para um banho-maria com temperatura controlada a 25 graus Celsius para uma incubação de 10 minutos. Adicione enzima aos componentes da reação deuterada para iniciar a reação de troca. Misture bem o conteúdo da reação pipetando para cima e para baixo.Nos pontos de tempo de troca experimentais apropriados, remover alíquotas de 50 microlitros de cada reação de troca de deutério de hidrogênio. E misture as reações de forma rápida e uniforme com uma alíquota de tampão de têmpera gelada em tubos individuais de 500 microlitros. Em seguida, tampe imediatamente os tubos para congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.Armazene as amostras a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para análise. Depois de descongelar as amostras congeladas, analise as amostras de referência de enzimas deuteradas usando o mesmo fluxo de trabalho de espectrometria de massa de cromatografia líquida de baixo para cima desenvolvido para as amostras de referência não deuteradas. Depois de coletar os dados LCMS para as amostras deuteradas, importe os dados para o projeto de troca de deutério de hidrogênio criado anteriormente para processamento de dados.E clique em Novo estado e Nova exposição para definir os estados bioquímicos e os tempos de exposição ao deutério, respectivamente, pertinentes à análise. Clique em Nova matéria-prima para selecionar os arquivos de dados de troca de deutério de hidrogênio a serem analisados. E atribua os tempos de troca e o estado bioquímico apropriados a cada arquivo de dados brutos importado.Para análise e visualização dos dados, selecione o primeiro peptídeo na lista de peptídeos e abra o gráfico espectral empilhado no menu Visualizações. Clique com o mouse para atribuir e cancelar a atribuição de bastões conforme necessário para garantir que a distribuição de isótopos adequada tenha sido localizada nos dados. E que cada pico de isótopo foi atribuído.Para verificar as atribuições de stick para cada estado de carga, alterne o estado de carga na parte superior da janela de gráfico espectral empilhado. Para verificar o desvio padrão dos valores de captação de deutério peptídico no menu Visualizações, selecione o mapa de cobertura. Que exibe cada peptídeo na lista de peptídeos mapeados ao longo da sequência de aminoácidos da proteína de interesse.Pinte os peptídeos de acordo com o desvio padrão relativo e pesquise visualmente no mapa por peptídeos discrepantes com o alto desvio padrão relativo. Clique nos peptídeos outliers no mapa de cobertura para preencher os gráficos espectrais empilhados e a janela do visualizador de dados com o peptídeo alvo. Exiba a diferença de interesse no mapa de cobertura e clique com o botão direito do mouse no mapa para exportar os dados da diferença para um arquivo CSV.Importe a diferença, os dados do estado e o arquivo PDB da proteína de interesse para o Deuteros. E selecione o intervalo de confiança de 99% e Ativar soma e processe os dados. Em seguida, em pi mol, selecione Exportar, Absorção e Exportar para gerar um script PyMOL para mapear as regiões de diferença de troca significativa na estrutura PDB da proteína de interesse no software PyMOL.Esses cromatogramas representativos de íons totais para três amostras de referência da peptídeo sintetetase lambda Hal-M2 mostram as mudanças dependentes do tempo na soma de todas as contagens de íons em todos os valores da relação massa-carga incluídos na varredura espectral de massa. A forma e a intensidade do perfil do cromatograma de íons totais devem ser semelhantes. Indicando que a digestão proteolítica de Hal-M2 é reprodutível.E é de eficiência semelhante em todas as três amostras de referência. Os espectros de massa em um determinado intervalo de tempo também devem ser semelhantes. Fornecendo confiança de que peptídeos semelhantes estão presentes em cada amostra e estão aludindo em momentos semelhantes da coluna C18.A maioria dos peptídeos nas amostras trocadas de deutério deve exibir mudanças óbvias em suas distribuições isotópicas em direção a valores mais altos de relação massa-carga. Por exemplo, esses dados indicam que uma fração substancial do marcador de deutério estava sendo mantida durante todo o curso da coleta de dados de têmpera ácida, digestão de pepsina e espectrometria de massa por cromatografia líquida. Após a caracterização das propriedades bioquímicas da enzima, conforme demonstrado, resultados representativos de espectrometria de massa de troca de deutério de hidrogênio como esses podem ser gerados.Para ilustrar a ligação do peptídeo precursor Hal-A2 ao Hal-M2 AMP, complexo PMP. As reações de troca de deutério de hidrogênio devem ser preparadas e extintas de maneira consistente. E você deve ser metódico ao determinar os valores de troca de deutério para vários peptídeos detectados.A espectrometria de massa de troca de deutério de hidrogênio fornece informações em nível de peptídeo e alterações conformacionais dinâmicas de proteínas. A relevância funcional de qualquer troca de deutério de hidrogênio deve ser validada para o Meter Genesis. E ensaios de atividade ortogonal.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

MALDI-TOF espectrometria de massa foi utilizado com sucesso para monitorar a troca hidrogênio / deutério amida em proteína quinase PAK2 ativação.

Amida de hidrogênio / deutério Exchange &amp; MALDI-TOF Análise Espectrometria de Massa de PAK2 Ativação

Conformação da proteína e dinâmicas são a chave para a compreensão da relação entre estrutura e função de proteínas. Troca de hidrogênio acoplada a espectrometria de massa de alta resolução é um método versátil para estudar a dinâmica de conformação das proteínas, bem como a caracterização da proteína-ligante e interações proteína-proteína, incluindo interfaces de contato e efeitos alostéricos.

Analisando Dynamics proteína utilizando hidrogênio câmbio Espectrometria de Massa

Aqui, apresentamos protocolos detalhados para espectrometria de massa de troca de hidrogênio/deutério de amida em estado sólido (ssHDX-MS) e espectrometria de massa de marcação fotolítica em estado sólido (ssPL-MS) para proteínas em pós sólidos. Os métodos fornecem informações de alta resolução sobre a conformação e interações de proteínas no estado sólido amorfo, o que pode ser útil no projeto de formulação.

Mass Spectrometric Abordagens para estudar a estrutura das proteínas e interacções em liofilizados Pós

flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Dentre as mais adversas condições de stress que organismos encontram durante seu ciclo de vida envolve o acúmulo de oxidantes. Durante o estresse oxidativo, células dependem fortemente de chaperones moleculares. Aqui, apresentamos os métodos usados para investigar redox-regulado antiatividade agregação, bem como para acompanhar mudanças estruturais que regulam a função de acompanhante usando HDX-MS.

Definição da atividade de chaperona regulada por redox de Hsp33 e mapeamento de alterações conformacionais em Hsp33 usando espectrometria de massa de troca de hidrogênio-deutério

Apresentado aqui é um protocolo para uma abordagem de troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforese capilar (HDX), juntamente com espectrometria de massa de cima para baixo. Essa abordagem caracteriza a diferença nas estruturas de alta ordem entre diferentes espécies proteicas, incluindo proteínas em diferentes estados e diferentes proteoformes, conduzindo o diferencial simultâneo HDX e a separação eletroforética.

Troca de hidrogênio/deutério à base de eletroforose capilar para caracterização conformacional de proteínas com espectrometria de massa de cima para baixo

O conjunto estrutural da alfa-sinucleína monomérica afeta sua função fisiológica e propriedades fisiológicas. O presente protocolo descreve como realizar espectrometria de massa de milissegundos de hidrogênio/deutério e análises subsequentes de dados para determinar informações conformais sobre o monômero dessa proteína intrinsecamente desordenada em condições fisiológicas.

Espectrometria de massa de hidrogênio/deutério-deutério para o estudo da dinâmica estrutural alfa-sinucleína sob condições fisiológicas

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

gotículas lipídicas são organelos importantes para a replicação de vários agentes patogénicos, incluindo o vírus da hepatite C (HCV). Descreve-se um método para isolar gotículas lipídicas para a espectrometria de massa quantitativa de proteínas associadas; ele pode ser utilizado sob uma variedade de condições, tais como infecção por vírus, stress ambiental, ou tratamento com droga.

Isolamento de gotículas de gordura para análise quantitativa Espectrometria de Massa

Diferentes métodos para manipular a arquitetura tridimensional em hidrogel à base de proteínas são avaliados aqui com respeito a propriedades do material. As redes se são acrescidas com um peptídeo de célula-adesivo, e sua viabilidade na cultura de pilha é avaliada usando duas linhas de células de modelo diferente.

Fácil manipulação das arquiteturas em hidrogel à base de proteínas para aplicações de cultura de células

Aprenda a usar HDX-MS para investigar a dinâmica conformacional de sintetases de lantipeptídeos em condições próximas às nativas. Este método identifica regiões funcionalmente importantes sem necessidade de marcação.

Uma plataforma de espectrometria de massa de troca de hidrogênio (HDX-MS) para investigar enzimas biossintéticas de peptídeos

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