Configuração da Espectrometria de Massa de Plasma Acoplada de Eletroforese Capilar (CE-ICP-MS) para quantificação de espécies de redox de ferro (Fe(II), Fe(III))
4 de maio de 2020
Este método de especiação de redox de ferro é baseado na espectrometria de massa de plasma capilar indutivamente acoplada com empilhamento de amostras combinado com análise curta em uma corrida. O método analisa rapidamente e fornece baixos limites de quantificação para espécies de redox de ferro em uma variedade diversificada de tecidos e amostras biofluidas.
O ferro excessivo resulta em ferro ativo redox livre dois mais que pode causar efeitos devastadores dentro da célula, como estresse oxidativo e mortes celulares por peroxidação lipídica conhecida como ferroptose. Medições quantitativas de ferro ferro e ferro férrico são a chave para uma visão mais aprofundada desses processos prejudiciais. Esta técnica CE-ICP-Ms fornece ambos:análise rápida e baixos limites de quantificação, que são necessários para quantificar espécies ferro-redox.
Comece selecionando um nebulizador com um baixo volume auto-aspirador e preparando as peças apropriadas para montar a interface caseira. Conecte dois conectores de luer feminino de três vias com um conector luer de cone macho conectando a extremidade esquerda da barra de luer inferior de três vias ao conector masculino e ao conector masculino à conexão média do luer superior de três vias. Em seguida, coloque um tubo de um centímetro sobre o fio de platina e use um tubo de silicone de um centímetro para conectar o primeiro tubo e o bocal de um conector luer masculino.
Fixar o conjunto à conexão média do conector luer inferior de três vias por rotação do parafuso. Empurre um tubo de um centímetro sobre a saída do capilar CE e posicione a oito a nove centímetros da extremidade, em seguida, conecte-o ao bocal do conector luer masculino com um tubo de silicone. Coloque toda a montagem através da barra do conector T superior e fixe o conector luer masculino e a extremidade esquerda do conector luer feminino por rotação do parafuso.
Em seguida, fixar o tubo de silicone de 25 centímetros no bocal de um conector luer masculino e fixar todo o conjunto na parte inferior da barra do conector de isca inferior de três vias. Empurre firmemente o tubo de silicone de um centímetro, cinco milímetros sobre a extremidade do nebulizador. Enquanto o segundo conector de cone luer macho é conectado à parte saliente do tubo.
Mova a parte da interface com o capilar ce saliente para o cone masculino no nebulizador, em seguida, insira cuidadosamente o capilar através do cone masculino e a parte mais larga do capilar nebulizador. Se necessário, ajuste o comprimento do capilar saliente desparafusando o luer masculino esquerdo, movendo o luer com tubos conectados na posição necessária e reinstalando-o. Os conectores luer feminino superior devem caber firmemente no cone masculino.
Quando terminar a configuração proceder com iCP-Ms. Curvas de calibração foram criadas para ferro três e ferro duas espécies redox. Os limites de detecção foram de 3,1 microgramas por litro para ferro dois e 3,2 microgramas por litro para ferro três e a linearidade foi demonstrada até 150 microgramas por litro.
A análise do Sh-SY5Y Cell Lysate mostrou uma migração ligeiramente mais lenta para espécies de redox de ferro devido à condutividade um pouco maior. As concentrações medidas de ferro três e ferro dois foram de 330 microgramas por litro e 84 microgramas por litro, respectivamente. Resultando em uma proporção de ferro de 2 a 3 de 0,25.
O passo mais importante deste protocolo é a cuidadosa inserção do capilar ce saliente através da interface montada e seu posicionamento adequado relacionado ao capilar de nebulizadores. Os métodos aqui apresentados podem se tornar uma ferramenta promissora para aprofundar a visão dos processos moleculares dependentes do ferro. Estudos cuidadosamente projetados são necessários para validar se a quantificação de mais de dois mais de ferro pode servir como um potencial biomarcador para identificar tecidos em risco de danos letais mediados por ferro no contexto de doenças neurodegenerativas e cancerígenas.
Visão Geral
Este estudo apresenta um novo método de especiação redox do ferro utilizando eletroforese capilar acoplada à espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente (CE-ICP-MS). Esta técnica permite análise rápida e baixos limites de quantificação para espécies redox do ferro em diversos tecidos e biofluidos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Bioquímica
- Química Analítica
Antecedentes
- O excesso de ferro pode levar ao estresse oxidativo e à morte celular.
- A medição quantitativa de ferro ferroso e férrico é fundamental para compreender esses processos.
- A ferroptose é uma forma de morte celular associada à sobrecarga de ferro.
- Os métodos existentes podem não fornecer a velocidade e sensibilidade necessárias para a quantificação de ferro.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método rápido e sensível para quantificar espécies redox do ferro.
- Investigar as implicações da quantificação de ferro em doenças neurodegenerativas e câncer.
- Validar o potencial da quantificação de ferro como biomarcador de dano tecidual.
Métodos Utilizados
- Espectrometria de massas com plasma acoplado indutivamente por eletroforese capilar (CE-ICP-MS).
- Preparação da amostra envolvendo montagem de interface caseira.
- Curvas de calibração para espécies redox de ferro dois e ferro três.
- Análise do lisado de células SH-SY5Y para medição da concentração de ferro.
Resultados Principais
- Os limites de detecção foram de 3,1 µg/L para ferro dois e 3,2 µg/L para ferro três.
- Observou-se resposta linear até 150 µg/L.
- As concentrações medidas foram de 330 µg/L para ferro três e 84 µg/L para ferro dois.
- Verificou-se que a razão entre ferro dois e três foi de 0,25.
Conclusões
- O método desenvolvido é promissor para o estudo de processos moleculares dependentes de ferro.
- Uma configuração cuidadosa é essencial para medições precisas.
- Estudos adicionais são necessários para explorar o papel da quantificação de ferro em contextos de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A quantificação precisa de espécies redox do ferro (Fe(II)/Fe(III)) é fundamental para compreender os danos celulares mediados pelo ferro em contextos neurodegenerativos e oncológicos. O método CE-ICP-MS permite a detecção rápida e sensível dessas espécies em matrizes biológicas complexas, auxiliando na desmistificação mecanicista precoce de hipóteses terapêuticas envolvendo estresse oxidativo e vias de ferroptose. Essa capacidade melhora a validação de alvos ao fornecer biomarcadores quantitativos e específicos do estado redox para triagem de portfólios em programas na fase de descoberta.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite investigar a homeostase redox do ferro como hipótese terapêutica em modelos de doenças.
- Valor Operacional: Fornece leituras quantitativas específicas ao estado redox para esclarecer as vias mecanicistas da morte celular induzida por ferro.
- Valor Preditivo: Apoia a confiança no alvo orientada por biomarcadores, correlacionando as razões Fe(II)/Fe(III) com o estresse oxidativo e os desfechos de ferroptose.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do ensaio: Oferece baixos limites de detecção (3,1–3,2 µg/L) e resposta linear até 150 µg/L, permitindo quantificação confiável em lisados diluídos e biofluidos.
- Reprodutibilidade: Demonstra precisão no tempo de migração inferior a 3% e precisão na medição entre 2,2–3,5%, garantindo resultados consistentes na triagem de compostos.
- Escalabilidade: O empilhamento por condutividade-pH permite volumes de injeção maiores sem comprometer a separação, melhorando a produtividade na validação de ensaios.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Permite a medição de espécies redox de ferro em lisados de SH-SY5Y e LCR, conectando a descoberta a sistemas relevantes para a doença.
- Decisões Ajustadas ao Risco: A precisão de recuperação (97–105%) e a confirmação por adição padrão apoiam a quantificação confiável de biomarcadores para critérios de prosseguimento ou interrupção.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Facilita a avaliação de estratégias de modulação do ferro ao fornecer leituras diretas das espécies Fe(II) e Fe(III) em modelos pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método CE-ICP-MS integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao fornecer dados quantitativos específicos da redox que orientam as etapas de validação de alvos e identificação de compostos promissores, particularmente para vias envolvendo estresse oxidativo dependente de ferro.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a disregulação do ferro em modelos de doenças neurodegenerativas e câncer por meio da quantificação com resolução de espécies.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios com baixo limite de quantificação (LOQ) e alta precisão, facilitando a avaliação confiável dos efeitos de compostos sobre os estados redox do ferro.
- Análises: Gera resultados quantitativos baseados na área dos picos e métricas de tempo de migração que permitem comparação entre condições e análise de tendências.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à validação pré-clínica por meio de espécies de ferro mensuráveis em lisados celulares e biofluidos, apoiando o alinhamento de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: A detecção independente de plataforma por ICP-MS permite reutilização em múltiplos alvos elementares além do ferro, aumentando a utilidade a longo prazo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao distinguir as contribuições do Fe(II) e do Fe(III) para o estresse oxidativo e a ferroptose.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da separação potencializada por empilhamento e da redução de interferências no modo DRC.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao fornecer biomarcadores redox quantitativos associados a estados patológicos do ferro.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seu impacto na especiação do ferro em modelos relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência na configuração de eletroforese capilar e na otimização de ICP-MS, especialmente no modo DRC com gás reativo NH3.
- Depende de uma montagem estável da interface entre o capilar de EC e o nebulizador para manter a integridade do sinal e evitar deslocamentos redox.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos parâmetros do eletrólito de fundo (HCl 20 mM) e da tensão (+25 kV) para garantir reprodutibilidade.
- Requer adaptação para amostras de condutividade variável (por exemplo, LCR) mediante adição de padrão para confirmação da identificação dos picos.
- Limitação prática: a sensibilidade do método aos efeitos da matriz da amostra exige diluição ou padronização para quantificação precisa em biofluidos complexos.
