Isolamento e Caracterização de Exossomos de Fibroblastos de Músculo Esquelético
16 de maio de 2020
Este protocolo ilustra 1) o isolamento e cultura de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos, bem como 2) purificação e caracterização de exossomos usando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose seguidos por análises de western blot.
A vantagem de usar a centrifugação diferencial para este protocolo é que ele é facilmente escalável até litros e, portanto, ideal para isolar exossomos de fibroblastos primários. Os exossomos purificados podem ser obtidos de diferentes tipos de células e tecidos isolados de vários modelos de doenças. Os exossomos podem ser usados como biomarcadores diagnósticos.
Demonstrando esse procedimento será Diantha van de Vlekkert, cientista do Laboratório d'Azzo Para começar, pese os músculos do camundongo e depois transfira-os para um prato de 10 centímetros. Trabalhando sob um capuz de biossegurança, pique os músculos com bisturis para produzir uma pasta fina. Transfira a pasta muscular finamente picada para um tubo de 50 mililitros e adicione a solução de digestão usando 3,5 vezes o volume por miligrama de tecido.
Incube por 45 minutos a 37 graus Celsius. Para ajudar na dissociação completa, misture bem a suspensão com uma pipeta de 5 mililitros a cada 10 minutos. Para inativar a solução de digestão, adicione 20 mililitros de DMEM Complete à suspensão celular.
Pipete através de um filtro de células de náilon de 70 micrômetros colocado em um tubo de 50 mililitros e, em seguida, lave o filtro de células com mais 5 mililitros de DMEM Complete. Centrifugue a suspensão celular a 300g por 10 minutos em temperatura ambiente. Remova cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de DMEM Complete.
Semeie as células em um prato de 10 centímetros e, em seguida, coloque o prato na incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 3% de oxigênio. As culturas de fibroblastos do músculo esquelético precisam ser mantidas em um baixo nível de oxigênio para garantir condições fisiológicas de luz. O nível de oxigênio no músculo esquelético é de aproximadamente 2,5%Depois que as células atingirem 100%de confluência, cultive-as por mais um dia, depois enxágue-as com PBS e adicione um mililitro de solução de tripsinização.
Depois de incubar as células por 10 minutos, interrompa a tripsinização adicionando 10 mililitros de DMEM Complete. Transfira a suspensão celular para um tubo de 50 mililitros e, em seguida, centrifugue as células a 300g por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda o pellet em 20 mililitros de DMEM completo e semeie as células em um prato de 15 centímetros.
Colete o meio condicionado dos fibroblastos cultivados em um tubo de 15 mililitros. Centrifugue o meio condicionado a 300g por 10 minutos para pellet as células vivas. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 50 mililitros e granular as células mortas centrifugando o tubo a 2 000 g durante 10 minutos.
Em seguida, transfira o sobrenadante para um tubo de polipropileno de 38,5 mililitros e centrifugue o tubo a 10.000 g por 30 minutos para remover organelas, corpos apoptóticos e fragmentos de membrana. Para peletar os exossomos, transfira o sobrenadante para um tubo ultraclear de 38,5 mililitros e ultracentrifugue-o a 100.000g por 1,5 horas. Descarte cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente um mililitro de meio condicionado.
Lave o pellet de exossomo e ressuspenda-o em até 30 mililitros de PBS gelado. Centrifugue os exossomos novamente a 100.000g por 1,5 horas. Para completar a purificação, remova o sobrenadante por pipetagem, tomando cuidado para não perturbar o pellet exossômico.
A etapa do pellet do exossomo pode ser solta e facilmente destacada. Portanto, a remoção do sobrenadante PBS deve ser feita com muito cuidado com o auxílio de uma pipeta de 200 microlitros. Ressuspenda o pellet em PBS gelado usando 25 microlitros por prato de 15 centímetros de fibroblastos.
Por fim, meça a concentração de proteína usando o BCA Protein Assay Kit e um leitor de microplacas a 562 nanômetros. Este protocolo é um método altamente reprodutível e consistente para purificar exossomos. A microscopia eletrônica de transmissão mostra os tamanhos relativamente uniformes desses exossomos.
O immunoblot de lisados de exossomos mostra um padrão canônico de expressão proteica e a ausência de contaminantes proteicos de LDH e calnexina. Os exossomos foram separados por um gradiente de densidade de sacarose e as frações individuais foram sondadas em um western blot com anticorpos contra Alix, CD9 e CD81. Os exossomos sedimentaram consistentemente nas frações de três a seis.
Os exossomos bioativos isolados e concentrados podem ser usados para análises de microscopia eletrônica e espectrometria de massa, bem como para experimentos de captação in vitro e in vivo para estudos funcionais. Este protocolo é adequado para o isolamento de exossomos de células de baixa secreção e pode ser aplicado para explorar o envolvimento de exossomos em doenças fibróticas humanas.
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Visão Geral
Este protocolo ilustra o isolamento e o cultivo de fibroblastos primários do músculo gastrocnêmio de camundongos adultos e a purificação e caracterização de exossomos utilizando um método de ultracentrifugação diferencial combinado com gradientes de densidade de sacarose, seguido por análises de western blot. A capacidade de isolar exossomos de fibroblastos primários torna este método significativo para o estudo do seu potencial como biomarcadores diagnósticos.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Biologia celular
- Pesquisa de exossomos
- Doenças fibrosas
Antecedentes
- O isolamento de fibroblastos primários fornece informações sobre mecanismos celulares.
- Os exossomos desempenham um papel fundamental na comunicação celular e podem servir como biomarcadores de doenças.
- A técnica permite o isolamento escalonável de exossomos a partir de diversos tecidos.
Métodos Utilizados
- Ultracentrifugação diferencial para purificação de exossomos
- Músculo gastrocnêmio de camundongo como sistema biológico
- Análises por Western blot para caracterização
Resultados Principais
- Isolamos e caracterizamos com sucesso exossomos de fibroblastos.
- Observamos um padrão consistente de sedimentação de exossomos em gradientes de sacarose.
- Demonstramos a ausência de contaminantes proteicos em exossomos purificados.
Conclusões
- Este estudo estabelece um método reprodutível para o isolamento de exossomos que pode contribuir para a compreensão das doenças fibroticas.
- Os resultados destacam as potenciais aplicações terapêuticas dos exossomos em diagnósticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de exossomos de fibroblastos musculares esqueléticos primários permite a produção em escala de vesículas extracelulares para a descoberta de biomarcadores e estudos funcionais em modelos de doenças fibrosas. O protocolo possibilita a purificação reprodutível por meio de centrifugação diferencial e gradientes de densidade de sacarose, facilitando aplicações posteriores, como espectrometria de massa e microscopia eletrônica. Esta abordagem melhora a validação de alvos ao fornecer uma fonte consistente de exossomos bioativos para desvio mecanicista em pesquisas pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação do conteúdo de exossomos derivados de fibroblastos para esclarecer mecanismos de sinalização parácrina na homeostase tecidual e fibrose.
- Valor Operacional: Fornece um método escalonável para o isolamento de exossomos de células primárias, apoiando um fornecimento consistente para análise de vias-alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Exossomos purificados fornecem perfis quantitativos de proteínas e lipídios adequados para a padronização de ensaios e o desenvolvimento de painéis de biomarcadores.
- Valor Operacional: O método permite o processamento de grandes volumes, possibilitando a triagem em alto rendimento de cargas associadas a exossomos em diferentes condições experimentais.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Exossomos isolados de fibroblastos relevantes para doenças apoiam o alinhamento translacional de biomarcadores e a validação funcional pré-clínica.
- Valor Operacional: A adaptabilidade do protocolo a diversos tecidos e fluidos facilita a continuidade entre modelos em estudos de desvio de risco de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se no continuum de descoberta que vai da biologia inicial do alvo até a validação pré-clínica, especialmente para estudos que envolvem comunicação entre células estromais e sinalização mediada por vesículas extracelulares.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre os papéis dos exossomos de fibroblastos na progressão da fibrose e na sinalização intercelular.
- Triagem: Permite a preparação padronizada de amostras de exossomos para análise comparativa da composição de carga sob diferentes condições.
- Análises: Gera amostras prontas para western blot, microscopia eletrônica e espectrometria de massa, destinadas à caracterização multiômica.
- Pesquisa Translacional: Conecta o isolamento de exossomos de fibroblastos a modelos pré-clínicos de doenças fibroticas por meio de produção consistente e escalável de vesículas.
- Reutilização Empresarial: O protocolo é adaptável a diferentes tipos celulares e tecidos, posicionando-se como uma plataforma reutilizável para programas baseados em biomarcadores derivados de exossomos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a variabilidade na pureza e no rendimento de exossomos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de etapas padronizadas de centrifugação e purificação em gradiente.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer candidatos confiáveis a biomarcadores provenientes de fontes celulares mecanicamente relevantes.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de abordagens diagnósticas ou terapêuticas baseadas em exossomos, com base em dados funcionais consistentes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células primárias, ultracentrifugação e técnicas de western blot.
- Depende do acesso a equipamentos de ultracentrifugação e capacidade de preparação de gradientes de sacarose.
- Necessita padronização entre equipes para avaliação consistente do rendimento e pureza de exossomos.
- A adaptação a modelos de tecidos humanos ou doentes pode exigir otimização das condições de digestão e cultura.
- As limitações práticas incluem a possível coisolamento de agregados proteicos se os passos do gradiente não forem cuidadosamente executados.
